程序性壞死與急性肺損傷*

王文妍， 劉亞楠， 黃威， 陳仲清

南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院重癥醫(yī)學科、廣東省休克微循環(huán)重點實驗室(廣東廣州 510515)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是一種常見的臨床疾病，常見于膿毒癥、外傷、移植后反應等，病理學表現(xiàn)為彌漫性肺泡損傷。嚴重的ALI可進一步發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，美國的一項統(tǒng)計顯示，每年超過190 000例ALI患者發(fā)展為ARDS，并導致75 000例死亡[1]。目前認為ALI可能通過炎癥級聯(lián)反應、氧化應激反應或細胞死亡引起，但其發(fā)病機制至今仍未完全明確。細胞死亡的方式分為凋亡和壞死，以往的研究認為凋亡是唯一可控的死亡模式，壞死則是不可控的[2]。但是最近的研究從基因、生物化學及功能學上表明，壞死也可以被一定的細胞信號通路調控。與凋亡時細胞的胞質及染色質固縮、核破裂、釋放凋亡小體等不同，壞死細胞的病理形態(tài)主要表現(xiàn)為細胞膜及溶酶體膜通透性增高、細胞器腫脹、染色質輕度縮合、核保持不變等。程序性壞死在疾病的病理生理過程中的作用已經逐漸被發(fā)現(xiàn)，在心血管、腎臟、肝臟、神經系統(tǒng)的感染、缺血再灌注、腫瘤、全身炎癥反應綜合征及藥物相關性器官損傷的發(fā)生發(fā)展中均發(fā)現(xiàn)程序性壞死的參與。研究表明程序性壞死在肺損傷中也扮演著重要角色。本文就程序性壞死的具體分子機制及疾病病理生理相關作用進行綜述，并總結了近幾年程序性壞死相關ALI的研究，為ALI的診療及預后判斷提供了新的思路和手段。

1 程序性壞死的分子機制

目前最常討論的程序性壞死是由受體相互作用蛋白3(protein kinase 3，RIP3)及受體混合系列蛋白激酶樣結構域(mixed lineage kinase domain-like，MLKL)相互作用介導的，被稱為壞死性凋亡(necroptosis)的死亡方式[3]。其中最經典的通路即通過腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor，TNF-α)誘導的程序性壞死。TNF-α與其受體TNFR1(TNF receptor 1)相互作用，激活受體相互作用蛋白1(receptor interacting protein 1，RIP1)使其發(fā)生磷酸化，活化的RIP1和RIP3通過RIP同型結構域(RIP homotypic interaction motif，RHIM)相互作用[4-5]，使RIP3聚集及磷酸化，與RIP1形成壞死小體(necrosome)，向下激活MLKL，使MLKL形成聚合體，并使胞膜上鈣離子及鉀離子通道開放或直接通過四螺旋束結構域(4-helical bundle domain)的氨基末端結合在胞膜上成孔導致細胞死亡[6-7]。RIP1/RIP3/MLKL聚合體形成使MLKL寡聚后由胞質向胞膜轉移是程序性壞死執(zhí)行細胞死亡過程至關重要的步驟(圖1)。

除了TNF-α可激活經典的程序性壞死之外，TNF超家族也可通過與胞膜上的死亡受體結合，形成死亡誘導復合物(death-inducing-signalling complex，DISC)，并且在抑制IAP及Caspase-8活化的條件下引起程序性壞死[8]。LPS及dsRNA可通過Toll樣受體TLR4及TLR3[9]、外源性DNA進入胞質可通過刺激ZEBP1蛋白誘導干擾素(interferon，IFN)生成促進程序性壞死[10]。這些通路最終均可在Caspase-8失活的條件下，誘導RIP1/RIP3/MLKL壞死小體的產生。

圖1 RIP1/RIP3/MLKL相互作用示意圖

2 TNF-α 激活程序性壞死通路的調控

TNF-α刺激細胞激活MLKL蛋白啟動程序性壞死受到多種蛋白的調控。TNF-α是一種多效性細胞因子，在感染或組織損傷引起的炎癥中起關鍵作用，但是在某些情況下，也可有效誘導細胞死亡。TNF-α信號主要通過TNFR1誘導下游基因表達，TNFR1激動引起的RIP1依賴性程序性壞死的啟動需滿足2個條件：Caspase-8被滅活或RIP1去泛素化。

2.1 TNF-α結合TNFR1誘導復合體Ⅰ形成 首先，TNFR1識別TNF-α后，在胞質中通過TNFR1相關的死亡域蛋白(TNFR1-associated death domain protein，TRADD)、RIP1和E3連接酶[TNF受體相關因子2 (TNF receptorassociated factor 2，TRAF2)、細胞凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)及線性泛素鏈組裝復合體(linear ubiquitin chain assembly complex，LUBAC)]結合形成的復合體Ⅰ。其中，TRAF2、IAP、LUBAC構成的復合體是復合體Ⅰ內的線性泛素化鏈，可激活核因子-κB(NF-κB)從胞質復合體中解離入核并調節(jié)基因表達，有利于促炎反應及阻止細胞凋亡。使用胱天蛋白酶(second mitochondrial activator of caspase，SMAC)模擬物，可通過抑制IAP蛋白家族的幾種E3連接酶，如cIAP1/2(cellular inhibitor of apoptosis protein)或XIAP(X-linked inhibitor of apoptosis)，使RIP1去泛素化，誘導程序性壞死；去泛素酶CYLD(cylindromatosis)也可通過使Lys63連接的泛素化從RIP1上解離介導壞死作用[11]。

2.2 復合體Ⅰ失穩(wěn)形成復合體Ⅱa引起凋亡 復合體Ⅰ不穩(wěn)定時會產生復合體Ⅱa，由TRADD、Fas相關的死亡域蛋白(Fas-associated death domain-containing protein,FADD)及Caspase-8組成，可直接誘導凋亡[12]，Caspase-8滅活則使凋亡轉為壞死。在胞質中同時存在兩種不同形式的 FADD 樣白細胞介素-1β轉化酶抑制蛋白FLIP[FADD-like interleukin (IL)-1β-converting enzyme (FLICE)-inhibitory protein，F(xiàn)LIP]，其中cFLIP的長形式cFLIPL具有無活性的Caspase 樣結構域，可與Caspase-8的Caspase結構域形成異源二聚體，促進Caspase-8激活[13]，激活的Caspase-8具有剪切RIP1、RIP3及去泛素化酶CYLD的作用，可抑制程序性壞死[14-15]。相反，短形式的cFLIPS可以抑制Caspase-8激活。因此，在cFLIPL存在時，Caspase-8活化導致RIP1及RIP 被剪切，最終導致凋亡。

2.3 去泛素化或滅活Caspase-8促進復合體Ⅱb形成并向下激活程序性壞死 在IAP抑制劑(SMAC模擬物)或Caspase-8滅活劑[16-17]存在時，會形成另外一種復合體Ⅱb，包括 RIP1、RIP3和FADD及Caspase-8，在RIP3和MLKL的水平足夠高時，RIP1及RIP3形成壞死小體，從而引起壞死。研究發(fā)現(xiàn)，RIP1通過Ser14/15、Ser20、Ser161和Ser166位點[18]、RIP3通過Ser-227(h)Thr-231 和 Ser-232(m)位點[19]、MLKL通過T357和S358位點[20]發(fā)生磷酸化繼而進一步激活程序性壞死過程。而RIP1、RIP3及MLKL分別可以被necrostatins[18，21]、GSK 872及NSA(necrosulfonamide)[22]特異性抑制(圖2)。

圖2 調控TNF-α介導程序性壞死的分子機制[2]

通常認為RIP1會引起RIP3磷酸化促進下游發(fā)生程序性壞死，但是也有研究表明，RIP1可通過非激酶活性依賴的結構性的功能促進細胞存活而抑制凋亡和壞死[23]。在FADD缺乏的細胞中，RIP1激酶失活的細胞可以抑制但不能完全阻斷RIP3誘導的壞死，說明依賴和不依賴RIP1酶活性的壞死通路都是存在的。

綜上所述，多種細胞因子或細胞損傷分子模式均可在一定條件下引起程序性壞死，在這一過程中，RIP1及RIP3形成壞死小體是關鍵步驟，最終引起細胞膜離子通道開放，細胞腫脹破裂，釋放大量細胞因子，造成炎癥反應及組織損傷，嚴重的可引起全身炎癥反應綜合征，導致全身多器官損傷。

3 程序性壞死與ALI

目前，導致ALI的原因主要有感染、高氧刺激、機械通氣引起的物理損傷等，同時也可能由全身狀況引起，特別是膿毒癥、休克、免疫反應相關的器官損傷等。嚴重的ALI可能發(fā)展為ARDS，以發(fā)展快、彌漫性、嚴重的低氧血癥及最終的肺水腫、呼吸衰竭為特征。這些因素和癥狀涉及廣泛的肺部細胞損傷，并且在多項研究中也已證實程序性壞死在這一過程中扮演重要角色。

3.1 肺部感染 肺部感染是常見的感染性疾病，包括細菌性、病毒性及不典型病原菌感染。肺部感染是導致ALI發(fā)生最常見的原因[2]。常見的細菌感染如肺炎雙球菌、沙雷菌、結核桿菌、金黃色葡萄球菌及耐碳青霉烯的肺炎克雷伯菌均可通過程序性壞死導致細胞死亡[24-30]。大多數(shù)病原體可以釋放細胞毒性產物殺死細胞，其中最常見的是成孔毒素(pore-forming toxins，PFTs)，高濃度的PFT可以形成溶解孔，低濃度則可以升高細胞膜通透性導致離子失調，如鈣離子內流及鉀離子外流，而激活程序性壞死[24]。沙雷菌、肺炎球菌及金黃色葡萄球菌等感染的小鼠支氣管上皮可觀察到顯著的p-MLKL水平升高，并且體外實驗已經證實RIP1/RIP3/MLKL抑制劑預處理可預防其引起的細胞死亡[24]。說明在革蘭陽性菌及陰性菌感染中均可發(fā)生程序性壞死，并且抑制程序性壞死可在細菌感染中保護細胞，減輕損傷。

結核桿菌(mycobacterium tuberculosis，Mtb)感染可以抑制凋亡并促進壞死來殺死感染的巨噬細胞。結核壞死毒素(tuberculosis necrotizing toxin，TNT)分泌到細胞質中水解煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)。NAD+水解所致的線粒體去極化和ATP生成抑制導致糖酵解的增多及細胞外酸化，激活RIP3和MLKL，導致壞死。抑制RIP3或MLKL均可保護巨噬細胞，這一過程不依賴于TNF-α及RIP1[25]。也有文獻提出，在結核桿菌感染的鼠纖維母細胞中，在TNF-α的協(xié)同作用下發(fā)生RIP1依賴的MLKL磷酸化為特征的程序性壞死。鼠巨噬細胞中則發(fā)生依賴RIP1但不依賴MLKL磷酸化的壞死性細胞死亡?？傊?，不論TNF-α存在與否，結核桿菌感染的細胞都會發(fā)生RIP3依賴的壞死，說明RIP3在結核菌引起的程序性壞死中的核心作用。程序性壞死可以使細菌從巨噬細胞中逃逸或直接進入細胞外環(huán)境，對促進肉芽腫性炎癥的發(fā)生、發(fā)展至關重要[26]。而另一方面，通過程序性壞死引起細胞的迅速死亡，反而能夠減弱TNF-α或LPS引起的炎癥反應，敲除RIP3或MLKL可以恢復TNF-α誘導的細胞因子產生。與壞死過程中釋放損傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)相比，TNF-α或LPS直接誘導細胞因子具有更強的促炎作用。病原體感染導致的程序性壞死誘導細胞快速死亡，阻斷了損傷細胞持續(xù)釋放炎癥因子，這一機制也有利于細胞內病原體通過程序性壞死抑制宿主免疫反應[27]。目前關于程序性壞死在結核菌感染中的研究顯示，程序性壞死對巨噬細胞的損傷導致病原體逃逸，并減弱了炎癥反應，不利于感染控制。

除了細菌外，病毒感染也可以誘導程序性壞死。例如甲型流感病毒感染巨噬細胞和上皮細胞后，其NS1蛋白可以通過與MLKL相互作用增加MLKL低聚和膜易位，從而增加程序性壞死[28]。新型甲型流感病毒N7N9嚴重感染也與cIAP下調及肺上皮的壞死相關。cIAP2可以保護肺組織不受流感病毒感染的傷害并促進宿主存活，敲除cIAP2可促進壞死小體的形成，使小鼠死亡率升高[29]。但是一些研究顯示，在甲型流感病毒感染的小鼠模型中，阻斷RIP3活性會增加病毒滴度，鼠巨細胞病毒及單純皰疹病毒也可以阻止程序性壞死，從而使病毒擴散[24]，說明細胞發(fā)生程序性壞死減少了病毒大量復制，對機體有益。某些病毒也可以通過引起TNF-α刺激細胞的快速壞死，阻斷炎癥因子持續(xù)釋放從而故意阻斷宿主的炎癥反應，殺死前驅感染細胞還能夠促進病毒的釋放。因此也可以將壞死視為對病原體擴散有利的反應[27]。

通常認為細胞壞死主要以溶酶體膜通透性增加，細胞腫脹破碎并釋放大量細胞因子為主要特征，可引起炎癥反應，造成肺部屏障損傷，促進病原體侵入。嚴重的炎癥級聯(lián)反應可進一步導致細胞死亡，釋放大量DAMPS，加重器官損傷。但是根據(jù)感染病原體致病機制的不同，最終引起的病情轉歸可能截然相反。壞死導致的細胞快速死亡也可能阻斷TNF-α的持續(xù)釋放，反而可以減輕后續(xù)可能引起的炎癥風暴，也可以抑制病毒大量復制擴散。這提示我們在臨床分析病情及指定治療方案時，需要考慮到更多的情況。雖然程序性壞死在病原體造成的損傷中的具體機制及作用還未完全明確，但是目前的共識表明，程序性壞死在病毒性肺炎期間主要具有保護作用，是感染的肺細胞中止病毒復制的一種方法，而在細菌性肺炎期間則是有害的，但是目前并無直接通過改善程序性壞死進行干預的治療手段。

3.2 膿毒癥相關ALI 膿毒癥3.0定義中，膿毒癥是宿主對感染的反應失調引起危害生命的器官功能損害，即由感染引起的全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)。在膿毒癥中，壞死細胞釋放多種DAMPS刺激持續(xù)的炎癥因子釋放，加劇了器官損傷。膿毒癥時約有40%進展為ALI或ARDS，是引起ARDS最常見的原因[31]。敲除Caspase-3、Caspase-7或Caspase-1不能改善嚴重SIRS，但是敲除RIP3可以完全避免SIRS造成的細胞死亡，并且減少循環(huán) DAMPS 的水平。使用Nec-1抑制RIP1活化也具有相同的效果[30]，提示在膿毒癥中，對機體產生損傷的主要機制可能是壞死而非凋亡。更進一步的研究發(fā)現(xiàn)，抑制RIP1激酶活性可減少內皮細胞程序性壞死，防止脈管斷裂、凝血級聯(lián)反應及器官損傷，間接抑制促炎因子的產生，從而改善TNF/zVAD誘導的休克[32]。敲除RIP3減弱了CLP誘導的ALI，從而改善肺部結構的完整性，減少肺中性粒細胞浸潤[33]；同時也可減弱小鼠肺損傷，并降低肺泡灌洗液中炎癥因子的水平，從而提高LPS誘導的ARDS小鼠生存率[34]。抑制RIP1激酶活性同時減少RIP3可以在TNF-α誘導的SIRS中起保護作用[2]，除此之外，necrostatin也可能對TNF-α誘導的細胞因子有直接抑制作用，有研究發(fā)現(xiàn)在necrostatin存在的情況下，TNF-α誘導產生的IL-6減低，而IL-6在SIRS中起到重要作用[30]。在臨床上，有研究表明ICU的患者血漿中RIPK3水平升高與院內病死率和器官衰竭相關[35]。

以上數(shù)據(jù)顯示程序性壞死可能是一種潛在的膿毒癥治療靶點。動物實驗中抑制壞死通路的關鍵蛋白RIP1及RIP3活化可對膿毒癥有顯著的改善作用，臨床檢測中也發(fā)現(xiàn)RIPK3水平與膿毒癥病死率的相關性。這可能為SIRS 和膿毒癥的診斷及治療提供有價值的分子標志物。

3.3 機械通氣及高氧損傷 機械通氣是危重患者生命支持的重要手段，常應用于改善ALI患者出現(xiàn)的低氧血癥，但是使用不當也可引起肺組織過度擴張及局部不張，誘發(fā)和加重炎癥反應。機械通氣造成的壓力性機械損傷及高氧環(huán)境均可引起氣道及肺泡上皮細胞的程序性壞死，加重肺部損傷。高潮氣量可導致大鼠肺泡結構紊亂及炎癥細胞浸潤，肺組織內 RIP1/RIP3/MLKL水平較自主呼吸相比均升高，Nec-1則可以減輕高潮氣量造成的肺損傷[36]。高氧環(huán)境也會對細胞產生損傷，氧分壓>50 kPa就會造成高氧急性肺損傷。以往認為高氧是通過直接升高胞內活性氧簇(ROS)，引起后續(xù)的炎癥反應和應激反應造成的，但是研究中發(fā)現(xiàn)RIP1/RIP3/MLKL的表達同時上調，說明高氧刺激激活了程序性壞死。使用依達拉奉和Nec-1治療可逆轉丙二醛(malondialdehyde，MDA)上升，使得谷胱甘肽及超氧化物歧化酶降低[37]，從而減輕高氧導致的肺損傷。MDA可作為氧化應激和自由基介導損傷的標志物。故在對已經存在肺損傷或ARDS的患者使用機械通氣時，應考慮到氣壓傷及高氧損傷的可能，需監(jiān)控氣道壓及氧合指數(shù)，及時調整氧流量及給氧濃度，預防可能造成的醫(yī)源性損傷。

3.4 移植后肺損傷 原發(fā)性移植物功能障礙(primary graft dysfunction，PGD)是肺移植后發(fā)病和死亡的主要原因，缺血再灌注(ischemia/eperfusion，IR)是其關鍵原因，necrostatin-1治療可顯著抑制 IR 誘導的壞死細胞死亡和線粒體ROS的產生[38-39]。研究發(fā)現(xiàn)，在缺血再灌注過程中可以觀察到炎癥細胞浸潤和程序性壞死的增加，而非凋亡。隨低溫保存和再灌注后時間的增加，磷酸化的RIP1逐漸增多，臨床肺移植中也證明，肺上皮細胞壞死的程度與PGD的發(fā)生有關。并且，在其他器官移植造成的肺損傷，例如腎移植后肺損傷中，也發(fā)現(xiàn)了程序性壞死。近年來，越來越多的實驗室和臨床證據(jù)提示急性缺血性腎損傷可誘發(fā)遠端肺損傷，推測是因為促炎細胞因子如白細胞介素(IL)-1b、IL-6的釋放，特別是TNF-α從損傷的腎組織進入體循環(huán)和肺循環(huán)，引起肺組織損傷和炎癥，其中程序性壞死起關鍵作用，并且損傷嚴重程度與TNF-α水平有關[40]。

移植后損傷是復雜的過程，單純抑制細胞死亡改善并不足以逆轉其損傷，還需同時考慮缺血再灌注及免疫反應造成的損傷。這些研究為改善移植手術流程及移植患者遠期預后提供分子基礎，也為開發(fā)治療此類圍手術期并發(fā)癥的新策略提供了依據(jù)。

4 展望

綜上所述，越來越多的證據(jù)證明了程序性壞死在人類肺疾病病理生理過程中的重要性。它可以直接導致細胞死亡，進而引起炎癥級聯(lián)反應。敲除關鍵蛋白可提高動物的生存率，減輕肺部病理改變及細胞損傷，降低炎癥因子水平。但是也有研究表明程序性壞死使細胞直接死亡，從而避免了促炎因子的過度釋放，最終抑制炎癥反應。根據(jù)目前研究，程序性壞死對宿主有益還是對病原體有益取決于具體情況，其在不同疾病中的關鍵機制仍未完全明確，且程序性壞死與其他死亡模式的相互關系也需要深入闡明。在今后的研究中，可對疾病進行進一步分類，按照不同類別探究程序性壞死在疾病發(fā)展過程中存在積極或消極作用，及其具體的分子機制。并且，仍需深入研究發(fā)現(xiàn)具有特異性的程序性壞死生物標志物及具有針對性的干預措施，以將程序性壞死相關性研究應用于臨床疾病的診斷及治療中。