穿心蓮內(nèi)酯對克雷伯桿菌肺炎大鼠肺臟病理損傷、免疫功能紊亂及TLR4/NF-κB信號通路的調(diào)節(jié)作用①

亢瑞娜 何國莉 黃靚妹 劉曉霞 李君蕊

(唐山市工人醫(yī)院感染性疾病科，唐山 063000)

肺炎是終末氣道、肺泡和肺間質(zhì)炎癥統(tǒng)稱，致病因素包括細菌、病毒、真菌、寄生蟲等微生物及放射線、異物吸入等。克雷伯桿菌是細菌性肺炎常見致病菌，高發(fā)于嬰幼兒，危及嬰幼兒生命安全。肺炎患者體內(nèi)存在大量炎癥細胞因子和纖維，形成肺部機械損傷和宿主炎癥介質(zhì)、細胞因子激活釋放的惡性循環(huán)。因此，肺炎治療第一要務(wù)為抗炎。穿心蓮內(nèi)酯是從植物穿心蓮葉片中提取得到的二萜內(nèi)酯，具有抗炎抗菌、保肝、抗腫瘤、抗氧化和增強免疫等作用，廣泛應(yīng)用于各種炎癥性疾病，如關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)炎、椎間盤退變等[1-9]?；罨疊細胞的核因子kappa輕鏈增強子(NF-κB)信號通路是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)，誘導各種促炎基因表達，包括編碼細胞因子和趨化因子的基因[10]。研究表明穿心蓮內(nèi)酯抗炎活性與靶向TLR4/NF-κB信號通路有關(guān)，可能成為炎癥的防治藥物[6,9,11-13]。本研究采用氣管滴入克雷伯桿菌的方法建立大鼠肺炎模型，研究穿心蓮內(nèi)酯對大鼠的抗炎作用及機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量180～220g，購自北京維通利華公司，合格證號：SCXK (京) 2014-0001。飼養(yǎng)于無菌環(huán)境，26℃～28℃，50%～60%濕度，自由采食高壓滅菌水和無菌飼料，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進行實驗。

1.1.2試劑與儀器 穿心蓮內(nèi)酯粉末購自Sigma公司；TRIzol試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購自美國ThermoFisher公司；HE染色試劑盒、Masson染色試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；一抗、二抗均購自英國Abcam公司；ECL化學發(fā)光液購自Invitrogen公司；ELISA試劑盒購自美國RB公司； BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；肺炎克雷伯桿菌(1.5×109cfu/ml)購自重慶醫(yī)科大微生物學教研室。PCR儀、電泳儀及半干轉(zhuǎn)膜儀購自美國伯樂公司；Gel View 6000凝膠成像系統(tǒng)購自廣州云星儀器有限公司；多功能酶標儀購自瑞士TECAN公司；普通光學顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

1.2方法

1.2.1分組及給藥 大鼠隨機分為對照組(Control組)、模型組(Klebsiella組)、Kleb+Adnro(2.5 mg)組、Kleb+Adnro(5 mg)組和Kleb+Adnro(10 mg)組，每組12只。穿心蓮內(nèi)酯配制成10 mg/ml儲存液，給藥時稀釋成0.25、0.5和1 mg/ml分別作為低、中、高劑量組。給藥組自造模前1 d腹腔注射10 ml/kg 穿心蓮內(nèi)酯，對照組和模型組腹腔注射等體積滅菌生理鹽水，連續(xù)7 d。給藥結(jié)束后，眼眶采血后脫頸椎處死大鼠，取血清和肺臟進行后續(xù)實驗。

1.2.2建模 參考文獻[7]，10 %水合氯醛麻醉大鼠，無菌切開頸部皮膚，暴露上段氣管，經(jīng)氣管滴入0.15 ml菌液后豎直固定1 min，對照組滴入等體積生理鹽水。

1.2.3W/D值測定 取大鼠右肺中葉用預冷的PBS充分洗滌，吸水紙去除水分，稱量濕重(W)。80℃干燥48 h，稱量干重(D)，計算W/D。

1.2.4HE染色和Masson染色 將左肺用預冷的PBS充分洗滌，10 %中性福爾馬林固定，脫水、透明、浸蠟和包埋，制成5 μm切片。行HE和Masson染色，光學顯微鏡下觀察肺臟病理學改變和纖維化情況。

1.2.5Western blot檢測Caspase-3、Caspase-9、NF-κB p65和IκBα表達 RIPA蛋白裂解液于冰上提取各組肺組織總蛋白，BCA試劑盒檢測各組蛋白濃度并調(diào)平。每組取等量蛋白質(zhì)用12%SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗，4℃孵育過夜。棄去一抗，緩沖液清洗PVDF膜，加入對應(yīng)二抗，室溫封閉1 h，滴加ECL于暗室曝光顯影。以GAPDH或LAMIN A為內(nèi)參。

1.2.6ELISA檢測大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6的含量 眼眶靜脈叢取血，4℃下3 000 r/min離心10 min，收集上清保存于-80℃?zhèn)溆?。嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.7RT-PCR檢測NF-κB p65和IκB表達 Trizol試劑提取各組大鼠肺臟組織總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，PCR擴增，熒光定量PCR試劑盒檢測cDNA。

2 結(jié)果

2.1穿心蓮內(nèi)酯減輕肺炎大鼠肺臟損傷 與對照組相比，模型組大鼠右肺W/D值明顯增加(P<0.05)，而穿心蓮內(nèi)酯治療組大鼠右肺濕重/干重比值與模型組相比明顯降低(P<0.05)，見圖1A。

對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)基本完整，未見炎癥細胞浸潤或間質(zhì)增厚；模型組出現(xiàn)包括肺泡塌陷、肺泡壁厚度增加、間質(zhì)水腫、充血，炎癥細胞浸潤和成纖維細胞間質(zhì)浸潤等組織病理學改變；給藥劑量增加，穿心蓮內(nèi)脂治療組大鼠肺組織病理學改變及纖維化程度隨之改善，提示建模成功，見圖1B。

對照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常，未見明顯病理變化；與對照組相比，模型組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞嚴重，肺泡腔基本消失，藍色膠原纖維呈彌漫性增生沉積；給藥組大鼠仍有肺泡結(jié)構(gòu)，膠原纖維沉積較模型組明顯減輕，且與給藥劑量呈負相關(guān)，提示建模成功，見圖1C。

圖1 穿心蓮內(nèi)酯對肺炎大鼠肺臟損傷的影響(×200)Fig.1 Effects of Andro on lung injury in pneumonia rats(×200)

圖2 穿心蓮內(nèi)酯對肺炎大鼠凋亡相關(guān)蛋白表達的影響Fig.2 Effect of Andro on expressions of apoptosis-related proteins in pneumonia rats

2.2穿心蓮內(nèi)酯減少大鼠凋亡相關(guān)蛋白表達水平 與對照組相比，模型組大鼠高表達裂解形式的Caspase-3和Caspase-9(P<0.05)，穿心蓮內(nèi)脂治療組蛋白表達水平較模型組明顯下調(diào)(P<0.05)，且呈劑量依賴性，見圖2。

2.3穿心蓮內(nèi)酯降低肺炎模型大鼠炎癥反應(yīng) 與對照組相比，模型組大鼠炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6血清表達水平均明顯上調(diào)(P<0.05)；與模型組相比，穿心蓮內(nèi)酯治療組炎癥因子水平隨給藥劑量增加而下降(P<0.05)，見圖3。

圖3 穿心蓮內(nèi)酯對肺炎大鼠血清炎癥細胞因子含量的影響Fig.3 Effect of Andro on concentration of inflammatory cytokines in serum of pneumonia rats

圖4 穿心蓮內(nèi)酯對肺炎大鼠IκBα和NF-κB p65磷酸化水平的影響Fig.4 Effects of Andro on phosphorylation of IκBα and NF-κB p65 in pneumonia rats

2.4穿心蓮內(nèi)酯抑制肺炎大鼠IκBα和NF-κB p65磷酸化激活 與對照組相比，模型組大鼠p-IκBα和p-NF-κB p65 mRNA表達水平明顯上調(diào)(P<0.05)；經(jīng)穿心蓮內(nèi)酯治療后，mRNA表達水平明顯下調(diào)(P<0.05)，且與給藥劑量呈負相關(guān)。Western blot檢測結(jié)果與RT-PCR類似，證明穿心蓮內(nèi)酯能下調(diào)IκBα和NF-κB p65磷酸化水平，從而抑制該通路的激活，見圖4。

3 討論

克雷伯桿菌是最早被發(fā)現(xiàn)的能引起肺炎的革蘭氏陰性桿菌，克雷伯桿菌肺炎因其并發(fā)癥高耐藥性而威脅公共衛(wèi)生安全[14]。段爭等[15]研究認為PM2.5暴露。降低肺臟對細菌的清除能力，加重炎癥反應(yīng)，增加大鼠肺臟對細菌、病毒等的敏感性，使條件致病菌成為致病菌。當致病菌到達下呼吸道時，肺泡毛細血管發(fā)生滲透性水腫、充血、炎癥細胞浸潤及纖維沉積等，因此，課題組采用氣管滴入克雷伯桿菌的方法構(gòu)建肺炎模型，測量大鼠肺臟W/D比值，HE和Masson染色結(jié)果證明肺炎模型建立成功。本文研究也證實穿心蓮內(nèi)酯能有效緩解肺臟病理損傷和纖維化，與具有強大抗炎活性的碧蘿芷(松樹皮萃取物)通過抑制NF-κB介導的炎癥反應(yīng)改善肺損傷相似[16]。

炎癥性疾病的病理特征是細胞過度凋亡和促炎因子產(chǎn)生，許多天然化合物在抗細胞凋亡和/或炎癥干預上表現(xiàn)出生物學活性，如碧蘿芷、丹參酚酸B、牛蒡子苷元等，穿心蓮內(nèi)酯在干預炎癥和凋亡性疾病中作用明顯。在體內(nèi)體外實驗中均表現(xiàn)出抗凋亡作用[9，16-18]。體外培養(yǎng)小鼠T細胞，穿心蓮內(nèi)酯在不影響細胞活性的情況下通過抑制細胞凋亡和炎癥細胞因子釋放發(fā)揮有效的免疫抑制作用，在膿毒癥小鼠模型中，能通過減少心肌細胞凋亡等機制減輕脂多糖誘導的心臟功能紊亂[19，20]。本研究表明穿心蓮內(nèi)酯能降低肺炎大鼠凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Caspase-9表達，下調(diào)炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的血清表達水平，這可能與大鼠肺部細菌清除增加有關(guān)，有效改善大鼠肺部病理學。

NF-κB是調(diào)節(jié)炎癥最重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，激活的NF-κB可轉(zhuǎn)移到細胞核并與促炎基因啟動子結(jié)合，導致基因表達增強和炎癥反應(yīng)擴增，從而導致炎癥損傷。因此，阻斷NF-κB轉(zhuǎn)錄活性可能是治療炎癥的重要靶點[21-23]。脂多糖誘導的髓核變性研究發(fā)現(xiàn)，穿心蓮內(nèi)酯治療后，細胞凋亡率、炎癥介質(zhì)表達均明顯降低，其機制與抑制NF-κB途徑密切相關(guān)[9]。穿心蓮內(nèi)酯能顯著抑制促炎細胞因子IL-1β對髓核細胞凋亡的誘導作用，明顯抑制Toll樣受體(TLRs)、髓系分化因子88(MYD88)激活和NF-κB核易位[12]。本研究觀察到克雷伯桿菌肺炎大鼠肺組織NF-κB p65和其抑制蛋白IκBα的mRNA和蛋白水平顯著升高，穿心蓮內(nèi)酯可抑制兩者表達。

綜上所述，穿心蓮內(nèi)酯能降低克雷伯桿菌肺炎大鼠肺臟W/D比值，緩解肺組織充血、水腫、炎癥細胞浸潤和膠原沉積，改善肺組織形態(tài)和纖維化情況，抑制血清TNF-α、IL-1β和IL-6表達，并抑制NF-κB p65和IκBα磷酸化水平。穿心蓮內(nèi)酯通過抑制TLR4/NF-κB信號通路活化，改善克雷伯桿菌肺炎大鼠的肺臟病理損傷和免疫功能紊亂，為穿心蓮內(nèi)酯治療細菌性肺炎提供參考。