電針刺激經(jīng)Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)脊髓損傷大鼠移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的存活及分化

王文峰 葉紅暉

(日照市中心醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，日照 276800)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesench-ymal stem cells，BMSCs)是具有多向分化潛能、自我更新能力強(qiáng)、低免疫原性的多能干細(xì)胞，作為種子細(xì)胞廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[1]。脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是常見嚴(yán)重創(chuàng)傷性疾病，由神經(jīng)元損傷、軸突髓鞘脫失及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞功能失調(diào)引起機(jī)體功能障礙[2]。研究顯示，BMSCs移植在SCI治療中具有較好的應(yīng)用前景，但移植的BMSCs在體內(nèi)存活率較低及向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的效率不高[3,4]。電針(electro-acupuncture，EA)是治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的常用方法，可用于SCI。研究顯示，EA可誘導(dǎo)SCI后運(yùn)動(dòng)功能改善，并促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化，可提高脊髓損傷干細(xì)胞移植的成功率，但具體作用機(jī)制尚未明確[5,6]。本研究以SCI模型大鼠為研究對(duì)象，探討EA刺激對(duì)SCI后移植的BMSCs存活和分化的影響，為提高干細(xì)胞移植對(duì)SCI治療的成功率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)4周齡健康雄性SD大鼠10只，體質(zhì)量80～100 g，10周齡健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量390～410 g，均由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證編號(hào)：SCXK(湘)2016-0002。分籠飼養(yǎng)，自由飲食進(jìn)水，22～24℃，相對(duì)濕度50%～70%，晝夜12/12 h。

1.1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司；Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑IGC-001購自美國MedChemExpress公司；異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)熒光標(biāo)記的CD44和CD90抗體及苯腎上腺素(phenylephrine，PE)熒光標(biāo)記CD29和CD45抗體均購自美國Becton Dickinson公司；大鼠神經(jīng)營養(yǎng)素3(neurotro-phin-3，NT-3)ELISA試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；BrdU單克隆抗體、β-catenin單克隆抗體、c-Myc單克隆抗體、cyclin D1單克隆抗體、神經(jīng)元特異性核蛋白(neuronal nuclei，NeuN)單克隆抗體和GAPDH單克隆抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；Alexa Fluor?488 goat anti-mouse IgG(H+L)和Alexa Fluor?594 goat anti-mouse IgG(H+L)二抗購自上海浩然生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.3儀器 環(huán)球牌針灸針(0.3×25 mm)購自蘇州環(huán)球針灸醫(yī)療器械有限公司；HT-2溫針電針綜合治療儀購自常州華音電子有限公司。

1.2方法

1.2.1BMSCs分離、培養(yǎng)及鑒定 從4周齡SD大鼠雙側(cè)股骨和脛骨一端緩慢沖洗骨髓腔，另一端收集細(xì)胞懸液，200目篩網(wǎng)過濾，離心吸取乳白色、云霧狀液體層，DMEM/F12完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至第3代，胰酶消化后制備單細(xì)胞懸液，分別加入CD44-FITC、CD90-FITC、CD29-PE和CD45-PE熒光抗體進(jìn)行標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測BMSCs表面標(biāo)志物。取第3代BMSCs接種于6孔板，細(xì)胞融合度達(dá)到60%時(shí)加入成骨誘導(dǎo)劑(1 mmol/L地塞米松、1 mol/L β-甘油磷酸鈉和50 mmol/L抗壞血酸)，3 d更液1次，誘導(dǎo)21 d后10%中性甲醛固定，茜素紅和堿性磷酸酶染色觀察。

1.2.2急性SCI模型的建立及BMSCs移植 將60只10周齡雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham)、模型組(SCI)、BMSCs移植組(BMSCs)、BMSCs移植+EA組(BMSCs+EA)和抑制劑IGC-001干預(yù)組(BMSCs+EA+IGC-001)，每組12只。除sham組外，其他各組SD大鼠均采用改良Allen′s打擊法，建立SCI模型：1%戊巴比妥(30 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，取俯臥位固定大鼠，備皮，在暴露T9-T11椎旁肌肉后，完全切斷T10椎板顯現(xiàn)脊髓，采用Allen′s撞擊器(20 g)從3 cm高度處自由落體，撞擊T10段脊髓，誘導(dǎo)脊髓挫傷，sham組大鼠暴露T10段脊髓后未撞擊[7]。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：脊髓損傷處缺血水腫，形成尾巴痙攣性顫動(dòng)，雙下肢軀體回縮樣撲動(dòng)，呈遲緩性癱瘓。手術(shù)完畢后青霉素鹽水沖洗傷口，逐層縫合肌肉和皮膚，分籠飼養(yǎng)，輔助排尿。造模成功后，BMSCs組、BMSCs+EA組和BMSCs+EA+IGC-001組均尾靜脈一次性注射0.5 ml(1×107個(gè)/ml)被BrdU標(biāo)記的BMSCs，sham組和SCI組尾靜脈注射等體積生理鹽水。BMSCs+EA+IGC-001組大鼠尾靜脈注射IGC-001(5 mg/kg)，1次/d，共4周。

1.2.3EA治療 麻醉復(fù)蘇4 h后，BMSCs+EA組和BMSCs+EA+IGC-001組大鼠采用EA干預(yù)“大椎”和“命門”穴位。將不銹鋼針灸針刺入選定穴位，傾斜15°～45°，深度0.5～0.7 cm，連接EA治療儀，工作頻率2 Hz，工作電流1 mA，持續(xù)20 min，隔天1次，治療4周。

1.2.4神經(jīng)功能評(píng)分 采用BBB(basso，beattie and bresnahan)運(yùn)動(dòng)評(píng)定量表評(píng)估大鼠術(shù)后第1、7、14、21、28天后肢運(yùn)動(dòng)功能。BBB評(píng)分范圍為0～21分，0分表示后肢完全癱瘓，21分表示后肢運(yùn)動(dòng)功能完全正常，分?jǐn)?shù)越低表示肢體功能障礙越嚴(yán)重[8]。

1.2.5ELISA檢測損傷脊髓組織中NT-3含量 EA治療4周后，各組隨機(jī)取4只大鼠，1%戊巴比妥(30 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，以T10節(jié)段為中心快速取出約1 cm長的脊髓組織，冰浴研磨，制備組織勻漿，取上清，按照試劑盒說明書進(jìn)行ELISA分析，酶標(biāo)儀測定450nm波長處OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算NT-3濃度。

1.2.6免疫熒光實(shí)驗(yàn)評(píng)估移植BMSCs的存活及分化 EA治療4周后，BMSCs移植的各組隨機(jī)取4只大鼠，麻醉后經(jīng)心臟灌注4%多聚甲醛固定，完整取出T9-T11節(jié)段脊髓，將取出的脊髓組織放入4%多聚甲醛中固定過夜，放入30%蔗糖溶液中，至組織下沉到容器底部。T9-T11節(jié)段脊髓組織縱向連續(xù)冷凍切片，厚度25 μm，每連續(xù)5片取1片用于組織免疫熒光實(shí)驗(yàn)。取冰凍切片，含10%正常山羊血清的PBS室溫封閉1 h，加入小鼠抗人anti-BrdU單克隆抗體(1∶200)和小鼠抗人anti-NeuN單克隆抗體(1∶50)，4℃孵育過夜。PBS洗3次，加入二抗Alexa Fluor?488 goat anti-mouse IgG(H+L)或Alexa Fluor?594 goat anti-mouse IgG(H+L)室溫避光孵育1 h，PBS洗3次，滴加防淬滅劑、封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。

存活的移植BMSCs數(shù)量計(jì)算：熒光顯微鏡下以anti-BrdU單克隆抗體單標(biāo)顯示的細(xì)胞記為存活的BMSCs。用校準(zhǔn)的十字線目鏡勾畫，分布于每個(gè)切片的病灶部位，隨機(jī)選取3個(gè)視野(0.09 mm2)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以單位面積內(nèi)被BrdU標(biāo)記的細(xì)胞平均數(shù)表示存活細(xì)胞數(shù)。

分化的移植BMSCs數(shù)量計(jì)算：熒光顯微鏡下以anti-BrdU單克隆抗體和anti-NeuN單克隆抗體雙標(biāo)顯示的細(xì)胞記為神經(jīng)元樣細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)方式同上，結(jié)果以單位面積內(nèi)統(tǒng)計(jì)的神經(jīng)元樣細(xì)胞數(shù)量所占存活BMSCs的百分比表示。

1.2.7Western blot檢測損傷脊髓組織Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá) EA治療4周后，取各組剩余大鼠，麻醉后迅速取出T10節(jié)段脊髓組織，PBS清洗，加裂解液，冰浴研磨，12 000 r/min離心25 min，收集上清，Bradford法測定蛋白濃度。取25 μg 蛋白，行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST洗3次，加入一抗anti-β-catenin單克隆抗體、anti-c-Myc單克隆抗體、anti-cyclin D1單克隆抗體和anti-GAPDH單克隆抗體，4℃孵育過夜。TBST洗3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育30 min，TBST洗滌3次，加入超敏發(fā)光底物，曝光顯影，Image J分析條帶灰度值，GAPDH作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1BMSCs細(xì)胞的鑒定 結(jié)果顯示CD44、CD90和CD29均呈陽性表達(dá)，表達(dá)率分別為(91.7±2.4)%、(94.1±1.9)%和(92.8±1.6)%，而CD45呈陰性表達(dá)，其表達(dá)率僅為(2.7±0.9)%，見圖1。堿性磷酸酶染色結(jié)果顯示，經(jīng)染色后出現(xiàn)較多藍(lán)黑色顆粒，茜素紅染色結(jié)果顯示，存在大量紅色陽性克隆的鈣化結(jié)節(jié)，見圖2，分離所得細(xì)胞為BMSCs。

2.2EA刺激改善BMSCs移植后SCI大鼠神經(jīng)功能 各時(shí)間點(diǎn)sham組大鼠BBB評(píng)分顯著高于其他組(P<0.05)；BMSCs移植后21 d到28 d，BMSCs組和BMSCs+EA組大鼠BBB評(píng)分均顯著高于SCI組(P<0.05)，BMSCs+EA組顯著高于BMSCs組(P<0.05)；BMSCs+EA+IGC-001組大鼠BBB評(píng)分顯著低于BMSCs+EA組，見圖3。

2.3EA刺激促進(jìn)損傷脊髓組織NT-3表達(dá) EA干預(yù)4周后， 與sham組相比，SCI組大鼠脊髓損傷部位NT-3含量顯著降低(P<0.05)；與SCI組相比，BMSCs組和BMSCs+EA組大鼠脊髓損傷部位NT-3含量顯著增加(P<0.05)，BMSCs+EA組顯著高于BMSCs組(P<0.05)；與BMSCs+EA組相比，BMSCs+EA+IGC-001組大鼠脊髓損傷部位NT-3含量顯著降低(P<0.05)，見圖4。

圖1 BMSCs表面標(biāo)志物表達(dá)Fig.1 Expression of surface markers of BMSCs

2.4EA刺激促進(jìn)損傷脊髓內(nèi)移植BMSCs的存活及分化 各BMSCs移植組大鼠脊髓損傷處均有部分被BrdU標(biāo)記綠色熒光，與BMSCs組相比，BMSCs+EA組存活的BMSCs數(shù)量顯著增加(P<0.05)，BMSCs+EA+IGC-001組存活的BMSCs數(shù)量較BMSCs+EA組顯著減少(P<0.05)，見圖5。BMSCs+EA組神經(jīng)元樣細(xì)胞數(shù)目顯著多于BMSCs組(P<0.05)，而BMSCs+EA+IGC-001組顯著少于BMSCs+EA組(P<0.05),見圖6。

圖2 BMSCs成骨誘導(dǎo)分化(×200)Fig.2 Osteoblasts induction of BMSCs(×200)

圖3 各組大鼠各時(shí)間段BBB評(píng)分Fig.3 BBB scores of rats in each group at each time

圖4 各組大鼠脊髓損傷部位NT-3含量Fig.4 NT-3 contents in spinal rats injured sites of each group

2.5EA刺激上調(diào)損傷脊髓內(nèi)Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白的表達(dá) EA干預(yù)4周后， SCI組大鼠脊髓損傷處β-catenin、c-Myc和cyclin D1等蛋白表達(dá)水平與sham組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與SCI組相比，BMSCs組和BMSCs+EA組大鼠SCI處β-catenin、c-Myc和cyclin D1等蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)，其BMSCs+EA組各蛋白表達(dá)水平顯著高于BMSCs組(P<0.05)；與BMSCs+EA組相比，BMSCs+EA+IGC-001組大鼠SCI處β-catenin、c-Myc和cyclin D1等蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)，見圖7。

圖5 BrdU熒光標(biāo)記檢測各組BMSCs 移植后存活情況(×100)

圖6 移植BMSCs在SCI組織中的分化情況(×200)

圖7 Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平Fig.7 Expression levels of Wnt/β-catenin pathway associated proteins

3 討論

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)是修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷最理想的移植細(xì)胞，但由于其潛在的倫理問題，臨床應(yīng)用受限。與NSCs相比，BMSCs不涉及倫理問題，且來源廣泛、取材容易，在體外可誘導(dǎo)成神經(jīng)元樣細(xì)胞，備受青睞。研究證實(shí)，BMSCs移植治療SCI有效可行，但機(jī)制復(fù)雜，可能通過促進(jìn)軸突再生重建神經(jīng)通路、分泌相關(guān)細(xì)胞因子促進(jìn)神經(jīng)重塑和血管再生，抑制氧化應(yīng)激、減輕炎癥及分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)等發(fā)揮治療作用[9-11]。然而，BMSCs移植后在體內(nèi)存活率較低以及向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化效率不高，嚴(yán)重影響其療效并限制其應(yīng)用，如何提高BMSCs移植存活率及向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化效率至關(guān)重要。本研究結(jié)果顯示，BMSCs移植后采用EA干預(yù)可促進(jìn)BMSCs在SCI大鼠脊髓損傷截面組織的存活及向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，并改善大鼠神經(jīng)功能損傷，其機(jī)制可能與EA激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。

針刺作為我國傳統(tǒng)康復(fù)手段，可緩解和預(yù)防各類神經(jīng)類疾病并發(fā)癥，促進(jìn)神經(jīng)損傷后的神經(jīng)功能恢復(fù)。早期EA干預(yù)可減輕繼發(fā)性損傷、促進(jìn)神經(jīng)軸突再生、加速神經(jīng)干細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)脊髓受損神經(jīng)功能修復(fù)[12]。本研究分離大鼠BMSCs，并采用流式細(xì)胞儀檢測其表面標(biāo)志物CD44、CD90和CD29及通過成骨誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)證實(shí)分離的細(xì)胞為BMSCs，尾靜脈注射采用BrdU標(biāo)記BMSCsEA干預(yù)治療，結(jié)果顯示，與BMSCs組相比，BMSCs+EA組大鼠BBB評(píng)分顯著增加，說明EA刺激可顯著提高BMSCs移植后SCI大鼠的后肢運(yùn)動(dòng)功能，與Ding等[13]研究結(jié)果一致。NT-3是重要的神經(jīng)生長因子，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)元存活與分化、神經(jīng)修復(fù)等方面發(fā)揮重要作用。研究顯示，EA刺激聯(lián)合MSCs移植可顯著提高SCI病灶及周圍組織中NT-3含量，促進(jìn)神經(jīng)損傷修復(fù)[14]。本研究顯示，與BMSCs組相比，BMSCs+EA組大鼠SCI病灶組織中NT-3含量顯著增加，提示EA干預(yù)可能通過提高NT-3表達(dá)，改善損傷脊髓的微環(huán)境，促進(jìn)SCI大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。

BrdU是胸腺嘧啶核苷類似物，在細(xì)胞增殖時(shí)能夠替代胸腺嘧啶摻入到正在復(fù)制的DNA中并傳到子代，通過BrdU特異性抗體標(biāo)記檢測，可間接反映細(xì)胞增殖情況。本研究采用BrdU標(biāo)記的BMSCs進(jìn)行移植，檢測BrdU在SCI組織中表達(dá)情況，反映BMSCs移植后的存活情況。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BMSCs+EA組大鼠SCI病灶組織中被BrdU標(biāo)記的BMSCs細(xì)胞數(shù)目較BMSCs組顯著增加，說明EA干預(yù)可促進(jìn)BMSCs存活。劉建敏等[15]研究顯示，EA刺激能夠提高SCI大鼠NSCs移植后的存活率。NeuN是主要分布于神經(jīng)元胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)的可溶性小蛋白，其表達(dá)水平反映神經(jīng)元細(xì)胞的增殖能力，是神經(jīng)元細(xì)胞的標(biāo)志物[16]。本研究通過免疫熒光檢測NeuN蛋白與BrdU共定位情況評(píng)估移植的BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化情況，結(jié)果顯示，BMSCs+EA組大鼠SCI病灶組織中NeuN與BrdU共定位的BMSCs細(xì)胞數(shù)目較BMSCs組顯著增加，說明EA干預(yù)可促進(jìn)BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。提示，EA刺激可促進(jìn)移植的BMSCs存活和分化。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與EA刺激介導(dǎo)的SCI修復(fù)過程。Zhang等[17]研究稱EA刺激可激活Wnt/β-catenin通路促進(jìn)SCI組織內(nèi)源性NSCs增殖與分化，恢復(fù)SCI大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能。Wang等[18]研究顯示，經(jīng)“大椎”和“命門”EA刺激介導(dǎo)的SCI大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能改善，與SCI組織內(nèi)Wnt1、Wnt3a和β-catenin表達(dá)上調(diào)有關(guān)，提示EA刺激可能通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)脊髓損傷后移植BMSCs的存活和分化。本研究結(jié)果顯示，與BMSCs組相比，BMSCs+EA組大鼠脊髓損傷處β-catenin、c-Myc和cyclin D1等蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，表明電針刺激可激活脊髓損傷組織微環(huán)境中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。采用Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑IGC-001干預(yù)后，與BMSCs+EA組相比，BMSCs+EA+IGC-001組大鼠BBB評(píng)分、損傷組織中NT-3含量、存活及分化的BMSCs細(xì)胞數(shù)目及β-catenin、c-Myc和cyclin D1等蛋白表達(dá)水平均顯著下降，表明IGC-001干預(yù)可顯著逆轉(zhuǎn)EA刺激的作用。且研究表明，NT-3是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的靶基因[19,20]。本研究中EA刺激可通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路介導(dǎo)NT-3表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)移植BMSCs存活與分化，改善SCI大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能。

綜上所述，EA刺激可促進(jìn)移植的BMSCs在SCI部位存活并向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，改善SCI大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能，其機(jī)制可能是EA刺激激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，上調(diào)脊髓損傷組織微環(huán)境中NT-3表達(dá)，NT-3發(fā)揮其作為神經(jīng)營養(yǎng)因子的功能，促進(jìn)移植BMSCs分化及存活。但本研究未深入驗(yàn)證NT-3是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的下游靶基因，需要進(jìn)一步研究證實(shí)。