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    lncRNA GAS5通過抑制MAPK/ERK信號通路阻斷乳腺癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程

    2020-07-13 05:26:16高青山牟成金
    中國免疫學(xué)雜志 2020年11期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞系乳腺引物

    李 娟 高青山 牟成金 何 力

    (四川省人民醫(yī)院東院乳腺甲狀腺外科,成都 610000)

    在女性的惡性腫瘤致死率排名中,乳腺癌始終占據(jù)第一位,嚴(yán)重地威脅著女性的生命健康[1]。盡管隨著標(biāo)準(zhǔn)化化療和手術(shù)的廣泛應(yīng)用,早期乳腺癌的死亡率已有顯著下降,但由于耐藥和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生,乳腺癌死亡人數(shù)仍在上升[2]。約90%的乳腺癌死亡都是由遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移引起的[3]。

    人類全基因組測序分析結(jié)果表明,絕大多數(shù)基因組被轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA),主要包括微小RNA(miRNA)和長非編碼RNA(lncRNA)[4]。通常將lncRNA定義為轉(zhuǎn)錄物長度超過200個核苷酸,且無蛋白編碼能力的RNA[5]。越來越多的證據(jù)表明lncRNA涉及各種病理生理學(xué)過程,如基因表達(dá)、細(xì)胞增殖、凋亡等[6]。更重要的是,lncRNA作為致癌基因或抗癌基因參與許多惡性腫瘤的發(fā)病和發(fā)展[7]。

    生長抑制特異性轉(zhuǎn)錄本5(growth arrest special 5,GAS5)位于染色體的1q25,最早是使用從小鼠NIH 3T3細(xì)胞中提取的一種lncRNA[8]。一些研究表明GAS5作為腫瘤抑制因子在多種癌癥表達(dá),如宮頸癌、前列腺癌和肺癌等[9-11]。在乳腺癌中GAS5下調(diào)并能抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[12]。但其在乳腺癌中的作用機(jī)制卻不明了,本研究擬深入探討GAS5對乳腺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及相關(guān)機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1材料

    1.1.1標(biāo)本和細(xì)胞系 選取2017年1月1日至2018年1月1日我院乳腺外科收治的50例乳腺癌患者腫瘤組織及相鄰的非腫瘤組織。將組織樣品分成兩份,一份用10%福爾馬林固定用于組織病理學(xué)診斷,另一份立即在液氮中快速冷凍,并儲存在液氮中直至RNA提取。手術(shù)前未接受過放療或化療。所有實(shí)驗(yàn)組織標(biāo)本的使用我院倫理委員會批準(zhǔn)。

    1.1.2細(xì)胞株與主要試劑 人乳腺癌細(xì)胞系SKBR3、MCF-7和MDA-MB-231,以及正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A均購自復(fù)旦大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心。胎牛血清,RPMI1640培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司。Transwell小室購自美國Millipore公司。Matrigel購自美國BD公司。GAS5質(zhì)粒及對照購自上海吉凱制藥技術(shù)有限公司。Lipofecta-mine2000轉(zhuǎn)染試劑購自日本TaKaRa公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(FSQ-101)購自日本ToYoBo公司,PCR試劑盒購自美國Sigma公司。裸鼠購自我院實(shí)驗(yàn)動物中心。

    1.2方法

    1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 細(xì)胞在含10%胎牛血清的Dulbecco′s改良的DMEM培養(yǎng)基/高葡萄糖中培養(yǎng)。細(xì)胞在加有5%CO2的37℃潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用Lipofectamine 2000用pcDNA-GAS5及對照vector轉(zhuǎn)染細(xì)胞。NC組為轉(zhuǎn)染對照組慢病毒組,OE-GAS5組為轉(zhuǎn)染si-GAS5慢病毒組;pcDNA-GAS5的核苷酸序列是正向5′-GGCGAGGAGTCGAGATGCGA-GAT-3′,反向5′-AATGCGAGGGAATCCTAT-CGAAA-TC-3′。轉(zhuǎn)染后,收獲細(xì)胞進(jìn)行qRT-PCR分析。

    1.2.2RNA提取和qRT-PCR分析 使用TRIzol試劑從組織或細(xì)胞中分離總RNA,并按照說明書用逆轉(zhuǎn)錄酶和寡核苷酸(dT)合成cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行實(shí)時PCR,條件如下:94℃10 s,94℃5 s,52℃30 s退火,72℃15 s,40個循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)使用GAS5的特異性引物(正向引物,5′-ATCCGCAAGCCAGGAAGAGTC-3′和反向引物5′-CTTGCTTGATGCTTTGGTCTGT-3′)作為對照,用特異性引物(正向引物5′-CATCACCATCTTCCAG-GAGCG-3′和反向引物5′-TGACCTTGCCCACAGC-CTT-3′)擴(kuò)增。

    1.2.3細(xì)胞遷移能力測定 乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞在12孔塑料培養(yǎng)皿中生長至匯合,并用pcDNA-GAS5或NC處理。轉(zhuǎn)染24 h后,用 200 μl 移液器尖端在匯合的細(xì)胞單層上產(chǎn)生線性刮傷(一式三份)。為了在創(chuàng)傷之前從細(xì)胞周期中除去細(xì)胞,將細(xì)胞維持在無血清培養(yǎng)基中。在0 h和48 h拍攝圖像,觀察遷移的細(xì)胞和傷口愈合,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.2.4細(xì)胞侵襲能力測定 將乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞按照上述方法轉(zhuǎn)染24 h后,將無血清培養(yǎng)基中的1×105個細(xì)胞接種在Transwell遷移室中。Transwell的上室用基質(zhì)膠涂覆。含有20%FBS的培養(yǎng)基加入到下室中。24 h后,用棉絨除去未侵入的細(xì)胞。位于小室下表面的侵襲性細(xì)胞用結(jié)晶紫染色,然后用顯微鏡計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.2.5Western blot 根據(jù)蛋白相對分子質(zhì)量大小,配制凝膠,根據(jù)所測蛋白濃度適量加入蛋白樣品及每孔5 μl的蛋白marker;跑膠,首先加壓80 V,保證所有樣品在同一水平線,待樣品至分離膠處,將電壓加到120 V;切膠,根據(jù)所需條帶大小,對照蛋白Marker進(jìn)行切膠,并準(zhǔn)備與所切膠條相同大小濾紙2片和PVDF膜(浸泡甲醇15 s);按照濾紙、膠、PVDF膜、濾紙的順序排好,并趕出氣泡,壓緊,在250 mA恒流下,按1 kD蛋白1 min進(jìn)行轉(zhuǎn)膜;轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,PBST洗膜1次,并放入脫脂奶粉封閉1 h;一抗,PBST洗膜1次,將膜浸入稀釋好的一抗中,4℃過夜;二抗,PBST洗膜3次,將膜浸入稀釋好的二抗中,常溫下孵育1 h;顯影,PBST洗膜3次后,在暗室中曝光,并分析。

    1.2.6裸鼠腫瘤異種移植模型 將1×106濃度的pcDNA-GAS5組和對照空載體組MDA-MB-231細(xì)胞分別注射到4~6周齡裸鼠的腋窩。飼養(yǎng)8周后檢測裸鼠腫瘤異種移植物的體積和質(zhì)量生長情況。異體移植物大小根據(jù)以下公式測量:體積=1/2(最短直徑)2×最長直徑。

    2 結(jié)果

    2.1lncRNA GAS5在乳腺癌組織中和細(xì)胞系中的表達(dá) 通過qPCR比較lncRNA GAS5在30對乳腺癌和癌旁非腫瘤組織中的表達(dá)差異,結(jié)果如圖1所示,lncRNA GAS5在乳腺癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁正常組織(P=0.004)。比較lncRNA GAS5在正常乳腺上皮細(xì)胞系(MCF-10A)和三個乳腺癌細(xì)胞系(SKBR3、MCF-7和MDA-MB-231)中的表達(dá),結(jié)果顯示lncRNA GAS5在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)顯著低于正常乳腺上皮細(xì)胞系,且在MDA-MB-231中的表達(dá)最低(圖2),說明lncRNA GAS5在乳腺癌中可能是作為一個抑癌基因,因此選取MDA-MB-231細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)的功能表型驗(yàn)證。

    2.2lncRNA GAS5與乳腺癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 在不同年齡段的乳腺癌患者之間GAS5的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表1)。隨著乳腺癌分期越高,乳腺癌患者組織中的GAS5的表達(dá)水平越高,存在乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者組織中GAS5的表達(dá)越明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表1)。

    2.3lncRNA GAS5對乳腺癌細(xì)胞侵襲的影響

    圖1 lncRNA GAS5在乳腺癌組織和癌旁正常組織的表達(dá)Fig.1 Expression of lncRNA GAS5 in breast cancer tissue cell lines

    Transwell結(jié)果如圖3所示,pcDNA-GAS5組的細(xì)胞顯著少于對照空載體組(169.2±18.6 vs 103.7±16.1,P<0.05),lncRNA GAS5的過表達(dá)顯著削弱了MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力。

    2.4lncRNA GAS5對乳腺癌細(xì)胞遷移的影響 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測lncRNA GAS5對MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響。如圖4所示,pcDNA-GAS5組的細(xì)胞愈合率較對照組顯著降低[(41.2±2.7)% vs (11.9±0.5)%,P<0.05],lncRNA GAS5的過表達(dá)顯著降低了MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力。

    2.5lncRNA GAS5對EMT過程的影響 檢測EMT重要標(biāo)記物,包括上皮標(biāo)記物E-cadherin和間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin和Snail。結(jié)果如圖5所示,lncRNA GAS5的過表達(dá)使MDA-MB-231細(xì)胞中的E-cadherin蛋白顯著升高, 而N-cadherin、Vimentin

    圖2 lncRNA GAS5在正常乳腺上皮細(xì)胞系和乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)Fig.2 Expression of lncRNA GAS5 in normal breast epithelial cell line and breast cancer cell linesNote:*.P<0.05.

    表1 乳腺癌患者組織中GAS5的表達(dá)與其臨床病理特征之間的關(guān)系

    Tab.1 Relationship between expression of GAS5 and clinicopathological features in tissues of patients with breast cancer

    Clinicopathological datanHigh expression of GAS5Low expression of GAS5P valueAge(year)0.624≤602818106022157Pathological staging0.015Ⅰ817Ⅱ1459Ⅲ21516Ⅳ716Lymph node metastasis0.026No34727Yes16511

    圖3 lncRNA GAS5對MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的影響Fig.3 Effect of lncRNA GAS5 on invasive ability of MDA-MB-231 cellsNote:*.P<0.05.

    圖4 lncRNA GAS5對MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響Fig.4 Effect of lncRNA GAS5 on migration ability of MDA-MB-231 cellsNote:*.P<0.05.

    圖5 lncRNA GAS5對MDA-MB-231細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Snail蛋白的影響Fig.5 Effect of lncRNA GAS5 on protein expression of E-cadherin,N-cadherin,Vimentin and Snail in MDA-MB-231 cells

    圖6 lncRNA GAS5通過抑制MAPK/ERK蛋白信號通路影響細(xì)胞EMT過程Fig.6 lncRNA GAS5 influences cellular EMT process by inhibiting MAPK/ERK protein signaling pathway

    和Snail蛋白的表達(dá)顯著降低。Western blot結(jié)果表明lncRNA GAS5可能會通過調(diào)節(jié)EMT從而影響MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲。

    圖7 lncRNA GAS5對乳腺癌細(xì)胞裸鼠成瘤的影響Fig.7 Effect of lncRNA GAS5 on tumorigenicity of breast cancer cells in nude mice

    2.6lncRNA GAS5通過激活MAPK/ERK蛋白信號通路影響細(xì)胞的增長和EMT過程 使用Western blot檢測總的ERK1/2蛋白和磷酸化的ERK1/2蛋白(P-ERK1/2)的表達(dá)情況,結(jié)果與預(yù)期的相似(圖6),lncRNA GAS5的過表達(dá)顯著降低了MDA-MB-231細(xì)胞中P-ERK1/2的表達(dá)。通過MAPK/ERK信號通路的抑制劑—U0126進(jìn)一步驗(yàn)證,結(jié)果表明,U0126能消除lncRNA GAS5對P-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響,在過表達(dá)lncRNA GAS5的MDA-MB-231細(xì)胞中加入U0126后,其P-ERK1/2的蛋白表達(dá)與對照組無明顯差異,而且EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Snail均無明顯差異。

    2.7lncRNA GAS5對乳腺癌細(xì)胞裸鼠成瘤的影響 通過體內(nèi)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證lncRNA GAS5的抑癌作用,結(jié)果如圖7所示,過表達(dá)lncRNA GAS5組的瘤體較對照組明顯縮小,而且隨著時間延長,過表達(dá)lncRNA GAS5組瘤體的體積也顯著小于對照組。在3周后,過表達(dá)lncRNA GAS5組腫瘤的重量較對照組明顯減輕[(0.37±0.09)g vs (0.82±0.10)g,P<0.05],結(jié)果說明lncRNA GAS5抑制了裸鼠體內(nèi)腫瘤的增長。

    3 討論

    在全球范圍內(nèi),乳腺癌的發(fā)病率呈增加的趨勢,每年約有130萬婦女患乳腺癌,乳腺癌占所有惡性腫瘤總數(shù)的7%~8%[13]。越來越多的證據(jù)證明lncRNA參與了乳腺癌的形成、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[14]。與正常乳腺組織相比,許多l(xiāng)ncRNA在乳腺癌組織中的表達(dá)不盡相同。Xu等最近的一項(xiàng)研究表明,lncRNA MALAT-1在乳腺癌細(xì)胞系中下調(diào),并通過PI3K-AKT信號通路影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[15]。lncRNA CCAT1的上調(diào)與乳腺癌患者的疾病進(jìn)展和預(yù)后不良密切相關(guān)[16]。在乳腺癌中,lncRNA UCA1通過與miR-143相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和凋亡[14]。

    GAS5包括12個外顯子,它能剪接成兩個成熟的lncRNAs[17]。最近,Cao等[18]發(fā)現(xiàn)GAS5的過表達(dá)促進(jìn)膀胱癌耐藥細(xì)胞株的凋亡。在卵巢癌中,GAS5在腫瘤組織中減少并且低表達(dá)的GAS5往往預(yù)后更差[19]。此外,GAS5的過度表達(dá)通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白D1,p21和凋亡蛋白酶活化因子1抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖[20]。宮頸癌細(xì)胞中GAS5下調(diào)促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[21]。結(jié)果顯示lncRNA GAS5在乳腺癌中表達(dá)明顯低于正常組織,而且lncRNA GAS5的過表達(dá)能顯著影響MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲和遷移。動物實(shí)驗(yàn)同樣證實(shí)lncRNA GAS5能抑制腫瘤在裸鼠體內(nèi)的生長。以上結(jié)果說明lncRNA GAS5在腫瘤中可能作為潛在的抑癌基因。

    EMT是導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移的重要原因之一,主要涉及上皮表型的喪失和間質(zhì)及遷移表型的獲取[22]。Wnt、TGF-β、Hedgehog、Notch、NF-κB及MAPK/ERK被認(rèn)為是參與EMT過程的關(guān)鍵分子[23]。研究中發(fā)現(xiàn)上調(diào)lncRNA GAS5表達(dá)導(dǎo)致上皮標(biāo)志物E-cadherin的顯著增加,而間充質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin和Snail明顯減少,表明lncRNA GAS5可能是乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT的關(guān)鍵調(diào)控因子。但是,由于在發(fā)生EMT過程中可能存在許多共同的作用位點(diǎn),所以我們需要探究lncRNA GAS5在乳腺癌細(xì)胞中調(diào)控EMT的潛在機(jī)制。

    MAPK/Erk信號通路是在腫瘤發(fā)生中重要的細(xì)胞信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)之一[24]。lncRNAs異常激活磷酸化Erk1/2在許多類型的癌癥中都有被發(fā)現(xiàn)[25]。有研究顯示,MAPK/ERK途徑的過度激活促進(jìn)了EMT的進(jìn)展[26]。而在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,通過抑制MAPK/ERK能顯著削弱其遷移和侵襲能力[27]。本研究結(jié)果表明,lncRNA GAS5的過表達(dá)顯著降低了MDA-MB-231細(xì)胞中P-ERK1/2的表達(dá)。而當(dāng)使用選擇性磷酸化ERK1/2抑制劑U0126時,lncRNA GAS5對MDA-MB-231細(xì)胞的P-ERK1/2和EMT相關(guān)蛋白的影響被抵消。

    綜上所述,lncRNA GAS5可能通過抑制MAPK/ERK信號通路,阻斷乳腺癌細(xì)胞的EMT過程。lncRNA GAS5可能成為乳腺癌診斷和治療的新的靶點(diǎn)。

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