基于IL-33/ST2信號(hào)通路的茯苓多糖調(diào)控潰瘍性結(jié)腸炎大鼠肥大細(xì)胞活化的機(jī)制研究

梁桐爾 劉楊洋 王 烜

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，瀘州 646000)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種累及結(jié)直腸的非特異性炎癥性腸病，主要表現(xiàn)為持續(xù)、反復(fù)腹瀉，排黏液性膿血便，腹痛等癥狀[1]。UC發(fā)病因素較為復(fù)雜，目前認(rèn)為其發(fā)病可能與感染、免疫、精神等多種因素相關(guān)，而免疫因素被認(rèn)為是主要因素。肥大細(xì)胞(mast cells，MC)是一種主要分布于結(jié)締組織和黏膜上皮的重要免疫細(xì)胞，其胞質(zhì)含有嗜堿性顆粒[2]。應(yīng)激狀態(tài)下，MC可通過脫顆粒釋放多種炎癥因子，如TA、IL-6等[3]。UC發(fā)生過程中，IL-33/ST2信號(hào)通路協(xié)同IgE介導(dǎo)MC的脫顆粒效應(yīng)，促進(jìn)炎癥因子的釋放，啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[4]。目前西醫(yī)治療UC主要采用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等藥物，但其易引起腹瀉、腹痛、惡心、嘔吐等不良反應(yīng)。研究報(bào)道茯苓多糖具有增強(qiáng)巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞活性的作用，但其與IL-33/ST2信號(hào)通路的研究目前尚未見報(bào)道[5]。本研究通過建立UC大鼠模型，給予茯苓多糖灌胃治療，探討茯苓多糖對(duì)UC大鼠MC活化的作用機(jī)制及對(duì)IL-33/ST2信號(hào)通路的影響，以期為更合理有效治療UC大鼠，減少治療帶來的不良反應(yīng)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠90只由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):SYXK(京)2018-0013，體質(zhì)量(180±40)g。嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理規(guī)定飼養(yǎng)，溫度18～28℃，濕度 40%～70%。

1.1.2主要儀器與試劑 茯苓多糖購自江方格藥業(yè)有限公司；柳氮磺胺吡啶片(SASP)購自上海信宜天平藥業(yè)有限公司；2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)購自上海西格瑪奧德里奇公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自Promega公司；IL-33、IL-5、IL-13、IL-4、IL-6 ELISA試劑盒購自上海廣銳生物科技有限公司；4%多聚甲醛、蛋白酶抑制劑、RIPA裂解液購自羅氏公司；IL-33、ST2單克隆抗體購自CST公司；Anti-beta-Actin、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(HRP)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；Olympus BH2顯微鏡購自日本Nikon公司；勻漿機(jī)、微量移液槍購自德國 Eppendorf公司；電泳儀購自北京六一生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型的制備 對(duì)照組15只，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，除對(duì)照組外剩余75只大鼠均建立UC大鼠模型[6]。造模前大鼠禁食24 h，麻醉大鼠后在大鼠肛門處緩慢插入橡膠管約8 cm至結(jié)腸，每只大鼠以100 mg/kg注入5%的TNBS與乙醇1∶1 的混合溶液，灌入后倒置大鼠約30 s防止灌注液倒流，隨即平放大鼠至自然清醒，造模后觀察大鼠情況，至第2天大鼠出現(xiàn)排泄稀爛便、甚至出現(xiàn)精神萎靡、膿血便及活動(dòng)減少等癥狀，說明造模成功。對(duì)照組大鼠同采用體積的生理鹽水灌腸。

1.2.2動(dòng)物分組與給藥 對(duì)照組15只，其余75只UC大鼠造模成功后按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、茯苓多糖低劑量組、茯苓多糖中劑量組、茯苓多糖高劑量組、SASP組(陽性對(duì)照組)，每組均15只。參考文獻(xiàn)[7]灌注藥物，分組后茯苓多糖低、中、高劑量組按照每天5 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg，SASP組300 g/kg SASP灌胃，對(duì)照組、模型組每天灌胃生理鹽水10 ml/kg，連續(xù)治療14 d。

1.2.3大鼠一般情況的觀察 各組大鼠在試驗(yàn)期間均無死亡，分別于分組后、治療結(jié)束時(shí)稱量體質(zhì)量，實(shí)驗(yàn)期間常規(guī)監(jiān)測大鼠的飲食、嗜睡、懶動(dòng)、毛色、大小便等情況。并觀察大鼠疾病活動(dòng)度，對(duì)大鼠進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)分，定期觀察大鼠體質(zhì)、大便隱血、大便性狀情況，按照0～4分進(jìn)行評(píng)分，DAI=體質(zhì)量下降百分比評(píng)分+大便隱血/便血評(píng)分+大便性狀評(píng)分。

1.2.4樣品的采集 各組動(dòng)物灌胃14 d后，乙醚麻醉后于尾靜脈取血3 ml，室溫靜置30 min，3 000 r/min 離心15 min，分離血清，-20℃冰箱保存待測。3%戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠，開腹截取肛門2～10 cm處結(jié)腸組織，沿腸系膜剪開腸腔，去除腸黏膜表面黏附的血液、糞便、分泌物，等滲生理鹽水沖洗干凈并吸干水分，稱重；平展腸黏膜組織，肉眼觀察結(jié)腸大體形態(tài)，進(jìn)行結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)(CMDI)評(píng)分；切取病變明顯結(jié)腸組織一部分凍存于-80℃冰箱，一部分固定于4%多聚甲醛。

1.2.5ELISA方法檢測血清IL-33、IL-5、IL-13、IL-6、sST2的水平 采用酶聯(lián)免疫吸附測定法 (enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)檢測血清IL-33、IL-5、IL-13、IL-6、sST2的水平，具體操作步驟如下：將1.2.4中抽取的冰凍血液標(biāo)本和ELISA試劑盒取出后，于室溫平衡30 min，然后按照說明書將試劑盒內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品配置成所需的濃度備用。分別設(shè)待測樣品孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和空白孔，然后依次加入待測標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品和辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育、洗滌，采用底物四甲基聯(lián)苯胺顯色，并用酶標(biāo)儀在450 nm處測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測標(biāo)本濃度。

1.2.6HE染色及免疫組化染色 甲醛固定組織用于HE染色及免疫組化染色，HE染色后觀察結(jié)腸組織病理變化，進(jìn)行組織學(xué)損傷(TDI)評(píng)分。甲醛固定組織制備切片，免疫組化SP法檢測TA表達(dá)水平，HE染色和免疫組化染色均按照試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.2.7甲苯胺藍(lán)改良法染色檢測MC形態(tài) 取1.2.4中甲醛固定組織，常規(guī)石蠟包埋，切片，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，4 μm厚間斷切片，采用甲苯胺藍(lán)改良法染色檢測MC形態(tài)、數(shù)目、脫顆粒率，隨機(jī)選取3個(gè)視野，置于高倍(×400)鏡下觀察，取平均值，計(jì)數(shù)MC 數(shù)量、脫顆粒細(xì)胞數(shù)目、脫顆粒率，脫顆粒率=脫顆粒細(xì)胞數(shù)目/MC 數(shù)目×100%。

1.2.8Western blot檢測結(jié)腸組織IL-33、ST2蛋白水平 取1.2.4中的凍存組織，用蛋白提取試劑盒提取蛋白，采用RIPA蛋白裂解法提取組織中的總蛋白，冰上裂解45 min，裂解期間間隔混勻組織液，裂解完成后于4℃條件下14 000 g離心15 min，收集上清液，采用BCA法測定蛋白濃度，根據(jù)測定結(jié)果調(diào)整所有蛋白樣本為相同濃度后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離(10%分離膠和5%濃縮膠)，濕轉(zhuǎn)全部轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，用5%的脫脂奶粉封閉2 h，加入預(yù)先按照說明書稀釋好的一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜后加室溫孵育對(duì)應(yīng)的二抗2 h，以actin為內(nèi)參，TBST清洗后ECL顯色曝光得到蛋白條帶，并使用Image J進(jìn)行條帶分析 。

2 結(jié)果

2.1大鼠一般情況觀察 對(duì)照組大鼠飲食正常，大小便正常，皮毛光滑；模型組大鼠出現(xiàn)扎堆、嗜睡、厭食、皮毛干枯等表現(xiàn)，3 d后出現(xiàn)大便帶血、少動(dòng)少食，體重減輕等癥狀；灌腸后茯苓多糖治療組和SASP組大鼠在治療第2周后便血、皮毛干枯、飲食量少等癥狀開始緩解，茯苓多糖中、高劑量組和SASP組大鼠恢復(fù)良好。與對(duì)照組比較，模型組大鼠日攝食量、日體質(zhì)量增加量顯著降低，DAI評(píng)分顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，茯苓多糖治療組和SASP組日攝食量、日體質(zhì)量逐漸增加，DAI評(píng)分逐漸降低(P<0.05)。見表1。

2.2各組大鼠結(jié)腸組織切片HE染色觀察 對(duì)照組大鼠結(jié)腸組織切片顯示大鼠腸黏膜形態(tài)完整，腺體排列整齊，無水腫、潰瘍；模型組顯示腸黏膜腺體結(jié)構(gòu)排列紊亂，出現(xiàn)水腫、出血、糜爛，腸黏膜上皮損壞，散在潰瘍連續(xù)存在，黏膜和黏膜下層較多炎癥細(xì)胞浸潤；茯苓多糖各治療組和SASP組肉眼及鏡下結(jié)腸損傷較輕，少量潰瘍，炎癥細(xì)胞浸潤減輕見圖1。與對(duì)照組比較，各組大鼠CMDI、TDI評(píng)分顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，茯苓多糖各治療組和SASP組CMDI、TDI評(píng)分均降低，尤以茯苓多糖高劑量組、SASP組降低最為顯著(P<0.05)，見表2。

2.3各組大鼠結(jié)腸組織切片甲苯胺藍(lán)改良法檢測MC形態(tài)及數(shù)目 甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果顯示，光鏡下可見近端結(jié)腸黏膜固有層和黏膜下層彌散分布肥大細(xì)胞，肥大細(xì)胞呈卵圓形或梭形，胞漿呈紫色，核藍(lán)色，未脫顆粒者形態(tài)完整，胞漿均勻，染色呈紫色；脫粒者形態(tài)不規(guī)則，胞漿顏色較淺，細(xì)胞周圍可見紫色顆粒物質(zhì)(圖2中箭頭所指)。與對(duì)照組比較，模型組近端結(jié)腸MC數(shù)目顯著增加(P<0.01)；與模型組相比，茯苓多糖低、中、高劑量組和SASP組MC數(shù)目顯著減少(P<0.01)，見表3。

GroupsDose ofadministration(g/kg)Average dailyintake(g/d)Average dailyweight gain(g/d)DAI scoresControl-14.68±0.433.73±0.320.23±0.08Model-11.27±0.151)3.08±0.171)2.93±0.311)Poria cocos polysaccharide low dose50 mg/kg11.94±0.201)2)3.11±0.231)2)2.70±0.301)2)Poria cocos polysaccharide medium dose100 mg/kg14.25±0.351)2)3.55±0.221)2)2.00±0.231)2)Poria cocos polysaccharide high dose200 mg/kg14.39±0.391)2)3.62±0.291)2)1.28±0.181)2)SASP300 m/kg 14.52±0.331)2)3.66±0.201)2)1.01±0.111)2)

Note：Compared with control group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05.

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織切片HE染色(×100)Fig.1 HE staining of colon slices of rats in each group(×100)Note: A.Control group；B.Model group；C.Poria cocos polysaccharide low dose group；D.Poria cocos polysaccharide medium dose group；E.Poria cocos polysaccharide high dose group；F.SASP group.

GroupsCMDITDIControl14.74±0.453.75±0.35Model11.33±0.191)3.02±0.201)Poria cocos polysaccharide low dose11.96±0.221)2)3.13±0.251)Poria cocos polysaccharide medium dose13.02±0.311)2)3.25±0.271)2)Poria cocos polysaccharide high dose14.21±0.381)2)3.46±0.311)2)SASP14.60±0.391)2)3.61±0.291)2)

Note：Compared with control group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05.

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織切片甲苯胺藍(lán)染色(×400)Fig.2 Toluidine blue staining of colon slices of rats in each group(×400)Note: A.Control group；B.Model group；C.Poria cocos polysaccharide low dose group；D.Poria cocos polysaccharide medium dose group；E.Poria cocos polysaccharide high dose group；F.SASP group.

GroupsMC(n/400 hp)Degranulationrate(%)Control3.14±0.450.45±0.12Model10.33±2.191)0.86±0.201)Poria cocos polysaccharide low dose8.03±2.171)2)0.75±0.181)2)Poria cocos polysaccharide medium dose6.42±1.911)2)0.63±0.081)2)Poria cocos polysaccharide high dose3.75±1.731)2)0.48±0.061)2)SASP3.42±1.371)2)0.46±0.041)2)

Note：Compared with control group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05.

圖3 各組大鼠結(jié)腸組織TA表達(dá)(×400)Fig.3 Expression of TA in colon tissue of rats in each group(×400)Note: A.Control group；B.Model group；C.Poria cocos polysaccharide low dose group；D.Poria cocos polysaccharide medium dose group；E.Poria cocos polysaccharide high dose group；F.SASP group.

GroupsOptical density valueControl172.09±23.45 Model113.89±20.191)Poria cocos polysaccharide low dose133.96±17.221)2)Poria cocos polysaccharide medium dose148.02±15.311)2)Poria cocos polysaccharide high dose160.21±12.381)2)SASP167.60±13.791)2)

Note：Compared with control group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05.

GroupsIL-33(pg/ml)IL-5(pg/ml)IL-13(pg/ml)IL-6(pg/ml)sST2(ng/L)Control15.10±2.522.21±0.358.52±1.2030.28±6.0258.19±15.52Model39.29±3.321)4.02±0.671)17.21±2.891) 83.25±14.041)180.91±29.261)Poria cocos polysaccharide low dose32.03±3.161)2)3.55±0.451)2)14.91±1.351)2) 60.06±14.151)2) 160.89±24.031)2)Poria cocos polysaccharide medium dose25.29±2.091)2)3.06±0.351)2)11.56±1.571)2) 46.56±9.341)2) 135.68±18.951)2)Poria cocos polysaccharide high dose17.02±2.191)2)2.46±0.311)2)10.39±1.781)2) 35.17±8.121)2) 105.68±17.611)2)SASP15.78±2.161)2)2.41±0.291)2)9.95±2.031)2) 33.26±7.021)2) 94.02±6.151)2)

Note：Compared with control group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05.

圖4 各組大鼠IL-33、ST2蛋白的表達(dá)Fig.4 Expression of IL-33 and ST2 proteins in rats of each groupNote: 1.Control group；2.Model group；3.Poria cocos polysaccharide low dose group；4.Poria cocos polysaccharide medium dose group；5.Poria cocos polysaccharide high dose group；6.SASP group.

GroupsIL-33ST2Control0.35±0.080.10±0.02Model1.10±0.121)1.02±0.111)Poria cocos polysaccharide low dose0.56±0.051)2)0.75±0.071)2)Poria cocos polysaccharide medium dose0.60±0.071)2)0.45±0.081)2)Poria cocos polysaccharide high dose0.36±0.061)2)0.32±0.051)2)SASP0.32±0.041)2)0.11±0.031)2)

Note：Compared with control group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05.

2.4各組大鼠結(jié)腸組織MC的TA表達(dá)水平 與對(duì)照組比較，模型組結(jié)腸TA水平顯著增加(P<0.01)；與模型組相比，茯苓多糖低、中、高劑量組和SASP組TA水平顯著減少(P<0.01)。

2.5各組大鼠血清sST2及炎癥因子表達(dá)水平 與對(duì)照組比較，模型組IL-33、IL-5、IL-13、IL-6、sST2水平顯著升高，與模型組比較，茯苓多糖各治療組和SASP組IL-33、IL-5、IL-13、IL-6、sST2水平顯著降低(P<0.05)。

2.6各組大鼠IL-33、ST2蛋白的表達(dá) 與對(duì)照組比較，模型組IL-33、ST2蛋白水平顯著升高，與模型組比較，茯苓多糖各治療組和SASP組IL-33、ST2蛋白水平顯著降低(P<0.05)。

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為UC的病癥主要是濕熱蘊(yùn)腸、氣滯絡(luò)淤，屬本虛標(biāo)實(shí)之癥[8]。近年來研究表明，UC的發(fā)病與機(jī)體免疫密切相關(guān)，UC患者T淋巴細(xì)胞降低，免疫力減弱[9]。茯苓具有澀腸止瀉、清熱燥濕的功效，茯苓多糖可增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞、B細(xì)胞活性，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞功能，但關(guān)于茯苓多糖對(duì)MC的作用目前尚不清楚。本研究通過制備UC模型，觀察茯苓多糖對(duì)MC及IL-33/ST2通路的作用，結(jié)果顯示茯苓多糖治療后，大鼠排膿血便、皮毛干枯、飲食量減少等癥狀得到緩解，且治療組大鼠DAI評(píng)分顯著降低，提示茯苓多糖可降低UC大鼠的臨床病理癥狀。SASP屬于磺胺類藥物，是治療大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的常用藥物。本研究中，與茯苓多糖治療組比較，SASP組治療效果更優(yōu)，但長期使用SASP易引起嘔吐、藥物熱、白細(xì)胞減少等不良癥狀，故選擇中藥代替西藥，進(jìn)一步分析結(jié)腸黏膜病理結(jié)構(gòu)和MC數(shù)目及炎癥因子水平。

UC是嚴(yán)重的腸道炎癥性疾病，主要表現(xiàn)為腸道腺體結(jié)構(gòu)排列紊亂、炎癥細(xì)胞浸潤等典型的組織學(xué)特征，是一種自身免疫性疾病[10]。本研究采用茯苓多糖治療UC大鼠，治療后大鼠結(jié)腸損傷減輕，炎癥細(xì)胞浸潤減弱，腸黏膜水腫減輕，提示茯苓多糖可通過抑制結(jié)腸黏膜的炎癥細(xì)胞緩解UC癥狀。黏膜免疫在腸道炎癥和損傷中發(fā)揮重要作用，淋巴細(xì)胞活化參與UC的發(fā)生[11]。目前認(rèn)為UC是個(gè)體對(duì)腸腔內(nèi)正常促炎因子的異常反應(yīng)引起的免疫失調(diào)，MC可能是這一過程的關(guān)鍵因子[12]。MC是免疫細(xì)胞的一種，可分泌多種細(xì)胞因子，參與T細(xì)胞、B細(xì)胞、APC細(xì)胞的活化。研究顯示，MC常分布于腸黏膜下小血管、毛細(xì)血管叢，其在炎癥性腸病中顯著提高，并釋放大量顆粒[13]。MC活化釋放多種細(xì)胞介質(zhì)，TA是MC活化、釋放顆粒的特異性標(biāo)志，UC患者中TA水平顯著增高[14]。另外TA也可激活MC，可刺激MC脫顆粒，放大MC效應(yīng)，使MC以瀑布效應(yīng)得到激活。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，向健康小鼠結(jié)腸內(nèi)灌注TA可引發(fā)腸道炎癥[15]。本研究顯示，茯苓多糖治療后，大鼠MC數(shù)目、脫顆粒率及TA水平均顯著下降，提示茯苓多糖可抑制MC的激活，進(jìn)而緩解UC病理癥狀。

ST2是IL-1受體家族成員，可分為可溶型ST2(sST2)和跨膜型ST2(ST2L)，主要在Th2細(xì)胞、MC、巨噬細(xì)胞中表達(dá)[16]。研究報(bào)道IL-33是ST2的功能配體，炎性腸病患者血清IL-33、ST2水平與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，是疾病活動(dòng)程度的標(biāo)志物[17]。機(jī)體胃腸道組織細(xì)胞損傷時(shí)，IL-33作為組織損傷的信號(hào)被凋亡細(xì)胞釋放。研究顯示，IL-33在UC及克羅恩病患者血清中異常升高[18]。本研究中，UC大鼠IL-33、ST2水平顯著高于對(duì)照組，茯苓多糖治療后，UC大鼠IL-33、ST2水平顯著降低，提示抑制IL-33、ST2水平對(duì)緩解UC炎癥反應(yīng)具有重要作用。UC主要是Th2細(xì)胞介導(dǎo)的腸黏膜炎癥，Th2細(xì)胞特征性的細(xì)胞因子IL-5在UC患者血清中異常增加[19]。IL-5的主要來源是嗜酸性粒細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞又通過分泌IL-5來促進(jìn)炎癥的發(fā)展。IL-13也是Th2細(xì)胞介導(dǎo)的關(guān)鍵因子，其與細(xì)胞凋亡和修復(fù)密切相關(guān)。IL-33與受體ST2結(jié)合對(duì)Th2細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)，進(jìn)而作用于MC、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。IL-33/ST2信號(hào)可促進(jìn)腸黏膜Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-5、IL-13，加強(qiáng)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)疾病進(jìn)程的發(fā)展。本研究中，與對(duì)照組比較，模型組大鼠MC數(shù)目、IL-5、IL-13、IL-6的水平升高，茯苓多糖治療后MC數(shù)目、IL-5、IL-13、IL-6的水平顯著降低，提示茯苓多糖可通過IL-33/ST2信號(hào)通路抑制MC的激活及炎癥反應(yīng)。

綜上所述，茯苓多糖能夠通過IL-33/ST2抑制MC的激活進(jìn)而緩解結(jié)腸黏膜損傷及炎癥反應(yīng)，發(fā)揮結(jié)腸黏膜保護(hù)作用，但關(guān)于茯苓多糖調(diào)控IL-33/ST2通路的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。