不同凍結(jié)方式對凍結(jié)豬肉保水性的影響機(jī)制

白 京，田寒友，鄒 昊，李文采，王 輝，賈仕杰，喬曉玲*

（中國肉類食品綜合研究中心，北京食品科學(xué)研究院，肉類加工技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100068）

豬肉是我國肉類消費(fèi)的主體，熱鮮豬肉或冷鮮豬肉在-18 ℃以下凍結(jié)保存是目前應(yīng)用廣泛、效果較好且成本較低的一種豬肉貯藏方法[1]，但目前我國冷凍肉存在汁液流失嚴(yán)重、色澤裂變等質(zhì)量問題，嚴(yán)重影響了我國肉品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2]。目前，肉品凍結(jié)方式主要包括空氣凍結(jié)、直接接觸凍結(jié)、間接接觸凍結(jié)，新興凍結(jié)方式有均溫凍結(jié)、被膜包裹凍結(jié)以及高壓冷凍凍結(jié)等，其中，空氣凍結(jié)采用空氣作介質(zhì)，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，應(yīng)用最為廣泛[3]。目前也有以液體為介質(zhì)的冷凍方式，屬于浸漬式凍結(jié)方法，就是將食品浸漬在低溫液體環(huán)境中快速降至冰點(diǎn)后均勻降溫，保持食品原有品質(zhì)，如今大多應(yīng)用在大型食品如冷凍魚和火腿等的保存，很少應(yīng)用在豬肉冷凍保存上[4]。

肉的保水性指的是肉的持水能力，是衡量冷凍肉品質(zhì)的最重要指標(biāo)之一[5]。目前在探究肉的保水性影響機(jī)理方面，主要有以下幾種研究觀點(diǎn)：一是通過蛋白質(zhì)分子的靜電荷效應(yīng)影響，表現(xiàn)在肉品pH值的升高和降低[6]；二是蛋白質(zhì)降解的影響，主要可以用肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的降解解釋[7-9]；三是肌肉組織空間結(jié)構(gòu)變化的影響，表現(xiàn)在纖維網(wǎng)絡(luò)空間的變化、肌節(jié)的長度變化以及水分組成分布的變化等[10-12]。

本實(shí)驗(yàn)以豬肉為研究對象，分別對樣品進(jìn)行液浸冷凍處理和空氣凍結(jié)處理，研究比較了兩種冷凍處理對凍結(jié)樣品保水性的影響，并通過比較樣品的pH值、水分組成、蛋白質(zhì)降解和組織結(jié)構(gòu)的觀察結(jié)果等，探究了不同凍結(jié)方式對凍結(jié)樣品保水性的影響機(jī)制，旨在為優(yōu)化工業(yè)上豬肉冷凍處理工藝提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取常規(guī)屠宰工藝屠宰后的豬胴體（北京三元豬），屠宰后在1 h內(nèi)從胴體上分割出背最長?。ū本┲腥鹗称酚邢薰荆┳鳛閷?shí)驗(yàn)材料。樣品質(zhì)量為（400±1）g，尺寸約為16 cm×8 cm×4.5 cm。

冷凍液體 南京中豐益農(nóng)業(yè)科技有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SSN-11E USB專業(yè)型溫度記錄儀 深圳宇問加壹傳感系統(tǒng)有限公司；液體制冷設(shè)備 南京中豐益生物技術(shù)有限公司；ME電子天平、Seven2Go-單通道便攜式pH計梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；電子恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；321LS系列電子天平 普利賽斯稱重設(shè)備有限公司；MINI MR-60核磁共振成像儀 上海紐邁電子科技有限公司；均質(zhì)器株式會社日本精機(jī)制作所；漩渦混合器 金壇市白塔新寶儀器廠；SU8020透射電子顯微鏡 日本電子株式會社；Axio Examiner光學(xué)顯微鏡 蔡司（中國）有限公司；NanoDrop 8000分光光度計 賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

將背最長肌隨機(jī)分成3 組，進(jìn)行不同方式的處理。第1組（冷鮮）：0～4 ℃冷卻成熟24 h，后放置在4 ℃環(huán)境下冷藏貯存；第2組（空氣冷凍）：0～4℃冷卻成熟24 h后，放置在（-20±2）℃低溫庫中凍結(jié)，當(dāng)中心溫度達(dá)到（-20±2）℃時，放置在-20 ℃冰箱中貯藏；第3組（液浸冷凍）：將樣品直接浸漬在（-20±2）℃的液體中冷卻凍結(jié)，當(dāng)中心溫度達(dá)到（-20±2）℃時，放置在-20 ℃冰箱中貯藏。

第2、3組分別在貯藏時間為3 d和3 個月時，進(jìn)行指標(biāo)測定；其中第1組樣品僅測定貯藏3 d的相關(guān)指標(biāo)，作為另兩組樣品的對照組。

1.3.2 凍結(jié)過程中的中心溫度測定

將專業(yè)型溫度記錄儀插入肉塊中心位置后，進(jìn)行真空包裝，打開溫度記錄儀記錄肉塊凍結(jié)過程中溫度的變化情況。

1.3.3 凍結(jié)損失率和解凍汁液流失率的測定

取兩組凍結(jié)處理組樣品，分別在凍結(jié)前（m1/g）、解凍前（m2/g）和解凍后（m3/g）稱質(zhì)量，按照公式（1）、（2）分別計算解凍汁液流失率和凍結(jié)損失率。

1.3.4 蒸煮損失率的測定

取一定大小的兩組解凍后肉樣和冷鮮肉樣，按照NY/T 2793—2015《肉的食用品質(zhì)客觀評價方法》[13]進(jìn)行蒸煮損失率的測定，按照公式（3）計算蒸煮損失率。

式中：m4、m5分別表示豬肉蒸煮前和蒸煮后的質(zhì)量/g。

1.3.5 pH值測定

pH值采用經(jīng)過校正的便攜式pH計進(jìn)行測定。用錐子插入肉中形成測試孔，并將pH計的電極直接插入孔中，直接讀數(shù)。

1.3.6 水分分布測定

低場核磁共振技術(shù)是通過檢測肉品中氫原子核在磁場中的弛豫特性得到肉品中水分分布的信息，是目前國際上用于研究肌肉水分分布及確定水分組分的最有效手段之一[14]。本研究低場核磁共振橫向弛豫時間T2通過核磁共振成像分析儀進(jìn)行測定。選擇肉中氫質(zhì)子共振頻率為22.3 MHz，測量溫度為30 ℃，選擇硬脈沖CPMG序列（Carr-Purcell-Meiboom-Gill sequence），設(shè)置參數(shù)為：90°脈沖和180°脈沖之間的時間是200 μs，重復(fù)采樣4 次，重復(fù)間隔時間是1 800 ms，模擬增益為20。測量時將大小為5 cm×10 cm×5 cm的凍結(jié)樣品放置在樣品槽中，每個測試至少3 個重復(fù)。為避免肉樣水分蒸發(fā)，在20 min內(nèi)完成樣品的制備和測定。得到CPMG指數(shù)衰減曲線后，應(yīng)用核磁共振弛豫時間反演擬合軟件Ver4.09進(jìn)行反演，使用綜合迭代法算法，得到T2的相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.3.7 蛋白的提取及測定

依據(jù)Liu Gang等[15]的方法提取蛋白，并進(jìn)行些許調(diào)整。稱取不同處理的凍結(jié)樣品各5 g，加入15 mL低離子濃度磷酸緩沖液（含0.1 mol/L NaCl、5 mmol/L EDTA，pH 7.4），用預(yù)冷的均質(zhì)器以8 000×g轉(zhuǎn)速進(jìn)行均質(zhì)，之后4 ℃、12 000×g離心5 min，取其上清液即為肌漿蛋白溶液。取上述沉淀用低離子濃度的磷酸緩沖液沖洗3 次，沖洗方法為：加入25 mL緩沖液，漩渦振蕩混勻，再12 000×g離心5 min。沖洗后取沉淀2 g，加入18 mL高離子濃度磷酸緩沖液（含20 mmol/L磷酸緩沖液、0.6 mol/L NaCl、5 mmol/L EDTA、4 mmol/L MgCl2，pH 7.4），漩渦振蕩混勻，在4 ℃環(huán)境下過夜。次日于4 ℃下以15 000×g離心5 min，取上清液即為肌原纖維蛋白。

以分子質(zhì)量范圍為6.5～245 kDa的寬分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白作為對照，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析肉樣中肌漿蛋白、肌原纖維蛋白的降解情況，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，5 倍上樣緩沖液與蛋白樣品體積比1∶1，采用NanoDrop分光光度計測定提取到的肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的蛋白質(zhì)量濃度，上樣時將肌漿蛋白質(zhì)量濃度調(diào)至10 mg/mL，上樣體積為10 μL，將肌纖維蛋白質(zhì)量濃度均調(diào)至5 mg/mL，上樣體積為20 μL。電泳測定時濃縮膠電壓90 V，分離膠電壓110 V，用考馬斯亮藍(lán)G250染色20 min后脫色，直至無色，即可得到清晰的蛋白質(zhì)條帶。

1.3.8 組織結(jié)構(gòu)觀察

分別采用掃描電子顯微鏡和光學(xué)顯微鏡對不同貯藏時間的兩組凍結(jié)樣品中心部位的組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察比較，具體參考余小領(lǐng)等[5]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

運(yùn)用SPSS 20軟件對測定數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，分析方法為Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，應(yīng)用MATLAB 2014b和Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同凍結(jié)方式對豬肉凍結(jié)時間的影響

圖1 不同凍結(jié)方式豬肉凍結(jié)過程中的溫度變化Fig. 1 Change in internal temperature of pork during freezing process

空氣冷凍樣品初始溫度為4 ℃，是因?yàn)樵摌悠肥窍壤鋮s成熟后再冷凍處理的，液浸冷凍樣品初始溫度為15 ℃，二者在凍結(jié)過程中的溫度變化如圖1所示。液浸冷凍樣品凍結(jié)時間為93 min，從4 ℃降至-20 ℃的時間為86 min；空氣冷凍樣品從4 ℃降至-20 ℃的時間為551 min，前者凍結(jié)速率明顯高于后者。在溫度為-1～-5 ℃之間，肉樣內(nèi)部的水分逐漸凍結(jié)成為冰晶，空氣冷凍樣品降溫持續(xù)時間較長，說明形成的最大冰晶帶更大[16]。

2.2 不同凍結(jié)方式對豬肉保水性的影響

表1 不同凍結(jié)方式對豬肉保水性的影響Table 1 Comparison of water-holding capacity of frozen meat subjected to different freezing methods

如表1所示，在貯藏3 d時，液浸冷凍處理組豬肉解凍汁液流失率顯著低于空氣冷凍處理組（P＜0.05），而貯藏3 個月時，液浸冷凍處理組樣品的解凍汁液流失率低于空氣冷凍處理組，但無顯著性差異（P＞0.05），但在貯藏3 d和3 個月時，空氣冷凍處理組豬肉凍結(jié)損失率均顯著高于液浸冷凍處理組（P＜0.05），表明在冷凍貯藏過程中液浸冷凍方式處理的凍結(jié)樣品升華損失的水分較少，而解凍過程中液浸冷凍處理組樣品液化損失的水分相對較少。在貯藏3 d和3 個月時，液浸冷凍處理組豬肉蒸煮損失率均小于空氣冷凍處理組豬肉，但均未達(dá)到顯著水平（P＞0.05）。指標(biāo)整體結(jié)果表明，冷凍貯藏期間，液浸冷凍處理方式的凍結(jié)樣品在保水性上優(yōu)于空氣冷凍處理的凍結(jié)樣品。

2.3 不同凍結(jié)方式對豬肉pH值的影響

pH值是影響肉中酶活性、蛋白質(zhì)變性以及嫩度的主要因素之一[17]。從圖2可以看出，貯藏3 d時，3 種處理方式的樣品pH值無顯著性差異，但在貯藏3 個月時，液浸冷凍處理組樣品pH值顯著高于空氣冷凍處理組（P＜0.05）。且液浸處理組pH值一直高于冷卻成熟結(jié)束后的冷鮮肉貯藏的初始值，而空氣冷凍處理樣品在貯藏3 個月時低于其初始值。另一方面，液浸冷凍樣品在兩個時間點(diǎn)的pH值無顯著性差異（P＞0.05），而空氣冷凍樣品隨著貯藏時間的延長，pH值顯著降低（P＜0.05）。按照pH值對肉的保水性影響機(jī)制，肌肉成熟的過程中產(chǎn)生乳酸，引起pH值下降，當(dāng)pH值達(dá)到主要蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（肌球蛋白等電點(diǎn)為5.4）時，蛋白質(zhì)相互吸引降低了對水分的吸引，使得肌原纖維之間距離縮小，還會導(dǎo)致肌原纖維的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)發(fā)生收縮，引起保水性下降[18]；因此液浸冷凍樣品pH值在貯藏過程中無顯著變化是使得其具有較好保水性的影響因素之一。

圖2 不同凍結(jié)方式肉樣的pH值變化Fig. 2 Comparison of pH of frozen pork subjected to differentfreezing methods

2.4 不同凍結(jié)方式對豬肉水分分布的影響

圖3 不同凍結(jié)方式肉樣橫向弛豫時間分布圖Fig. 3 Distribution of transverse relaxation time T2 in meat samples subjected to different methods

弛豫時間是描述弛豫過程的時間常數(shù)，肉與肉制品中水分的橫向弛豫時間T2呈多指數(shù)衰減[19]，可以反映樣品中水分子的自由度，能區(qū)分出不同狀態(tài)水的分布情況和自由移動程度[20]，分別為與大分子相互作用的水（結(jié)合水，T21）、肌原纖維和網(wǎng)狀組織中的水（不易流動水，T22）以及細(xì)胞外水（自由水，T23）[21-22]。不同T2區(qū)間的積分面積占總積分面積的比例表示各個區(qū)間氫質(zhì)子的相對含量[23]。圖3所示為各組樣品的T2譜圖，均有3 個峰，分別代表T21（0～10 ms）、T22（10～100 ms）和T23（100～1 000 ms），所有樣品的T22峰比例最高，表明樣品中水分大多以不易流動水形式存在。具體的峰頂點(diǎn)時間、峰面積和峰比例見表2。

表2 不同凍結(jié)方式肉樣的橫向弛豫時間比較Table 2 Comparison of T2parameters in different frozen pork samples

由表2可知，不同凍結(jié)處理方式對3 種狀態(tài)水的分布均有不同程度的影響。在貯藏時間為3 d時，與冷鮮肉相比，液浸冷凍處理樣品T21峰面積顯著增加（P＜0.05），峰比例極顯著增加（P＜0.01），T22的峰面積極顯著降低（P＜0.01），T22峰比例顯著降低（P＜0.05），T23的峰面積和峰比例均極顯著增加（P＜0.01）；空氣冷凍處理樣品的T21峰面積顯著降低（P＜0.05），T21峰比例無顯著性變化（P＞0.05），T22的峰面積和峰比例均無顯著性變化（P＞0.05），T23的峰面積和峰比例則均極顯著增加（P＜0.01）。由此來看，貯藏時間為3 d時，與冷鮮肉相比，液浸冷凍樣品結(jié)合水含量和自由水含量均顯著增加，不易流動水含量顯著降低；空氣冷凍樣品結(jié)合水含量顯著降低，但結(jié)合水相對含量無顯著變化，且有降低的趨勢，不易流動水含量和相對含量無顯著變化，但有降低的趨勢，自由水含量和相對含量均極顯著增加。

隨著貯藏時間的延長，不同凍結(jié)處理方式樣品的3 種狀態(tài)水分布也有顯著性差異。雖然貯藏3 個月樣品與冷鮮肉相比，變化趨勢與貯藏時間3 d相同，但貯藏時間3 個月與貯藏時間3 d的樣品相比，液浸冷凍樣品T21峰面積顯著降低（P＜0.05），其峰比例無顯著變化（P＞0.05），T22峰面積極顯著增加（P＜0.01），其峰比例無顯著變化（P＞0.05），T23峰面積和峰比例均極顯著降低（P＜0.01）；空氣冷凍樣品T21峰面積和峰比例極顯著降低（P＜0.01），T22峰面積顯著降低（P＜0.05），其峰比例無顯著變化（P＞0.05），T23峰面積和峰比例極顯著增加（P＜0.01）。由此來看，隨著貯藏時間的延長，液浸冷凍樣品自由水含量及相對含量均極顯著降低，結(jié)合水含量顯著降低，相對含量無顯著變化，但有降低的趨勢；不易流動水含量顯著升高，相對含量無顯著變化，但有升高的趨勢。空氣冷凍樣品結(jié)合水含量及相對含量均極顯著降低；不易流動水含量顯著降低，相對含量無顯著變化，但有降低的趨勢；自由水含量和相對含量均極顯著增加。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在貯藏時間3 d和3 個月時，與冷鮮肉相比，液浸冷凍處理樣品中的不易流動水向結(jié)合水和自由水移動，這可能是因?yàn)橐航鋬鰳悠肺唇?jīng)過冷卻成熟，自身的結(jié)合水含量更高，但經(jīng)過凍結(jié)后，自由水含量高于冷鮮肉[24]，而空氣冷凍處理樣品中的結(jié)合水和不易流動水向自由水移動，這可能是因?yàn)閮鼋Y(jié)后冰晶的生長破壞部分細(xì)胞，自由水含量增加[25]；而在貯藏3 個月過程中，隨著貯藏時間延長，液浸冷凍處理樣品中的自由水和結(jié)合水向不易流動水移動，液浸冷凍具有較快的冷卻速率，貯藏期間pH值無明顯變化，根據(jù)Bertram等[26]的研究，不易流動水含量的增加可能是因?yàn)槿鈽觾?nèi)無氧引發(fā)的反應(yīng)使得細(xì)胞內(nèi)通透性增加引起肌絲空間增加，吸水能力增強(qiáng)，從而引起胞內(nèi)水含量增加；而空氣冷凍處理樣品中的結(jié)合水和不易流動水向自由水移動，空氣冷凍冷卻速率較低，貯藏期間pH值逐漸降低，根據(jù)Bertram等[27]的研究，這可能是因?yàn)閜H值的降低誘導(dǎo)了肌原纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)收縮而引起了物理變化，吸水能力減弱，且引起了蛋白質(zhì)靜電荷減少，使其水合作用減弱，導(dǎo)致結(jié)合水和不易流動水含量減少，自由水含量增加。而李春等[28]將冷卻豬肉在相對濕度約80%、溫度（2±1）℃的常規(guī)常濕環(huán)境中冷卻24 h和朱迎春等[29]將牛背最長肌在2 ℃和-1.5 ℃環(huán)境中貯藏0～15 d，均發(fā)現(xiàn)不易流動水含量先增加后降低。因此，液浸冷凍和空氣冷凍處理在相同的貯藏條件時，水分分布產(chǎn)生差異可能是因?yàn)橐航鋬鏊俾瘦^高，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等變化較慢，處于組分變化前期階段，因此不易流動水含量先升高，這也與pH值變化結(jié)果一致，后期可以延長貯藏時間進(jìn)行比較。

2.5 不同凍結(jié)方式對豬肉蛋白質(zhì)降解的影響

圖4 不同凍結(jié)方式對豬肉蛋白質(zhì)降解的影響Fig. 4 Changes in protein degradation in frozen pork subjected to different freezing methods

如圖4A、B所示，兩組冷凍處理的樣品與冷鮮肉樣品相比，SDS-PAGE條帶的數(shù)量與降解的蛋白分子質(zhì)量均無明顯變化，表明在3 個月內(nèi)，兩種冷凍方式有效地抑制了肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的降解。Kristensen等[30]研究發(fā)現(xiàn)，冷鮮豬肉樣品在貯藏第4天開始出現(xiàn)蛋白質(zhì)的輕微降解，而在本研究中，在冷凍處理前樣品中的蛋白質(zhì)還未開始出現(xiàn)降解。即豬肉直接凍結(jié)時，兩種凍結(jié)處理方式均未造成豬肉肌原纖維蛋白和肌漿蛋白的明顯降解，說明凍結(jié)樣品保水性的差別并不能通過肌原纖維蛋白和肌漿蛋白的降解進(jìn)行解釋。

2.6 不同凍結(jié)方式對豬肉組織結(jié)構(gòu)的影響

圖5 不同凍結(jié)方式及貯藏時間的樣品掃描電子顯微鏡圖Fig. 5 Scanning electron micrographs of pork samples subjected to different freezing methods at different freezing storage times

通過掃描電子顯微鏡和光學(xué)顯微鏡觀察豬肉纖維橫截面，分別可以得到冰晶在肉中的分布狀況和形態(tài)變化。從圖5可以看出，與貯藏3 d的冷鮮肉相比，空氣冷凍和液浸冷凍處理樣品的肌束都不同程度變小，組織間有較為明顯的間隔和空洞，是冰晶升華留下的空間[31]，冰晶尺寸的增大會引起肌束的擠壓從而導(dǎo)致兩種凍結(jié)樣品的保水性降低[32]。在貯藏3 d和3 個月時，液浸凍結(jié)樣品的肌間空隙小于空氣凍結(jié)樣品，這是因?yàn)榭諝饫鋬鰳悠返募±w維空隙中的水分相對液浸冷凍樣品來說更多流向肌纖維外的空隙，從而空氣冷凍樣品水分損失更多，與保水性的結(jié)果是一致的。圖6中的現(xiàn)象與圖5大體相同且更為明顯，均與2.2節(jié)測定的保水性相關(guān)的指標(biāo)變化情況一致。

圖6 不同凍結(jié)方式及貯藏時間的樣品組織結(jié)構(gòu)Fig. 6 Microstructures of pork samples subjected to different freezing methods at different freezing storage times

3 結(jié) 論

在凍藏期間，液浸冷凍處理的豬肉保水性優(yōu)于空氣冷凍處理樣品；不同凍結(jié)方式對豬肉pH值和水分遷移影響顯著，液浸冷凍處理樣品pH值在貯藏過程中無顯著性變化，而空氣冷凍處理樣品的pH值顯著降低，引起肌原纖維距離減小，這可能是引起凍結(jié)肉保水性降低的一個重要原因；液浸冷凍處理樣品在貯藏過程中不易流動水向自由水和結(jié)合水遷移，而空氣冷凍處理樣品中不易流動水和結(jié)合水向自由水遷移，直接導(dǎo)致了凍結(jié)肉保水性的不同。凍藏3 個月內(nèi)，不同凍結(jié)方式處理樣品的肌原纖維蛋白和肌漿蛋白未出現(xiàn)明顯降解，不能直接解釋兩種凍結(jié)樣品的保水性不同。不同凍結(jié)方式處理對樣品冰晶結(jié)構(gòu)變化影響較大，液浸凍結(jié)樣品的肌間空隙小于空氣凍結(jié)樣品，進(jìn)一步解釋了液浸冷凍處理樣品保水性較好的原因。

綜合指標(biāo)分析，凍藏期間，液浸冷凍處理樣品的保水性更好，與pH值、水分分布、組織結(jié)構(gòu)等有直接關(guān)系，與肌原纖維蛋白和肌漿蛋白降解無直接關(guān)系。深入探討更長貯藏時間的不同凍結(jié)處理樣品的保水性相關(guān)指標(biāo)以及影響指標(biāo)的變化是進(jìn)一步研究的方向。