探索色譜-質譜聯用技術在中藥學專業(yè)本科教學中的應用

張美玲

（溫州醫(yī)科大學藥學院，浙江溫州325035）

0 前 言

與西藥相比，傳統中藥療效確切，毒副作用小，有效彌補了西醫(yī)治療過程中的不足，符合現代人的防病治病思想。中藥的功效不僅取決于某個單一成分，而是多種組分相互作用的結果。因此，明確有效成分十分關鍵。但是，中藥化學成分復雜，大部分成分與治療效果無關，而且還干擾有效成分信息。中藥種類繁多，有效成分含量差異較大。同一品種的中藥，如果起源，生長環(huán)境和加工方法等不同，成分和含量也不盡相同。因此，中藥有效成分分析是中藥研究的首要任務，選擇合適的分析方法尤為重要。

藥物分析中常用的分析技術包括紫外分光光度法、紅外光譜法、熒光分光光度法等光譜技術，還有色譜及色譜-光譜等聯用技術。但各種技術都有一定的適用范圍和優(yōu)缺點，中藥品種眾多，有效成分含量差別較大，如何根據具體藥物選擇合適分析方法是中藥學專業(yè)本科生應該具備的能力。隨著儀器檢測靈敏度的提高，新方法的更新，國外儀器的引進，不同方法之間的聯用，使中藥分析過程中遇到的難題逐漸得到解決，從而加快推進我國中藥市場化。紫外分光光度法、紅外光譜法、熒光分光光度法，色譜法（氣相色譜法和高效液相色譜法）等也是中藥專業(yè)學生必須掌握的分析方法。然而一些簡單的光譜和色譜技術面臨一系列問題：樣品純度要求高，分析時間長、分離效率不高、色譜柱易污染。色譜-質譜聯用技術具有強大的分離能力和結構鑒定能力，兩者互取所長，使樣品的分離、定量及定性成為快速準確的方法［1-4］。

據了解，國內院校在中藥學專業(yè)本科實驗教學中開設色譜-質譜聯用技術的實驗不多。該類儀器不僅是進行中藥專業(yè)研究的重要工具，而且也是建立相應實驗課程的最好硬件資源?？紤]到現代中藥分析發(fā)展的需要以及專業(yè)的特點，改變了傳統的教學模式，引入色譜-質譜聯用技術實驗，充分利用浙江省藥學實驗示范中心的大型儀器共享平臺，積極進行教學模式的改革［5-6］。

1 傳統的實驗模式存在的問題

我校藥學院針對中藥專業(yè)本科生開設有儀器分析實驗課，其中有關色譜學方面的實驗內容包括氣相色譜法測丙酮的含量和高效液相色法測定苯的含量等。以氣相色譜法測丙酮的含量實驗為例，實驗課程內容為：帶教老師講述儀器的基本結構和原理；闡述程序升溫色譜技術與恒溫色譜法的區(qū)別；設定試驗參數；演示手動進樣；面積歸一法計算丙酮含量等。由于受實驗條件的限制，仍然是以帶教老師講述演示為主，實驗過程處于觀摩狀態(tài)，無法發(fā)揮學生的主觀能動性和學習興趣，學生很難做到理論聯系實踐，只是懂得課本上的理論而提高不了學生的獨立操作能力和科研思維水平。為此將“氣相色譜法測丙酮的含量”實驗改為“氣相色譜法測定藿香正氣水中乙醇含量”。讓學生查找文獻或對照藥典，自己設計實驗，通過不同的中藥選用不同的儀器進行測定。帶教老師首先引導學生了解藿香正氣水的基本成分和功效：其為夏季常用傳統中成藥，主要成分包括藿香、白術、陳皮、厚樸、白芷、桔梗、茯苓、大腹皮、半夏、甘草、紫蘇等，具有散寒解表、化濕和中、祛暑的作用，可以用來治療外感風寒、內傷濕滯引起的頭痛發(fā)熱、惡心嘔吐、腹痛腹瀉等；同時讓學生明白其制造工藝中需要用酒精作為溶媒，其酒精含量常高達40% ～50%，乙醇具有揮發(fā)性，引入采用氣相色譜法測定其含量。因中藥制劑中所有的組分并非全部出峰，故采用內標法定量。通過該實驗，學生不僅掌握了氣相色譜儀的結構和工作原理，也了解了色譜常用的三種定量方法之一：面積歸一法。熟悉了該類儀器的適用范圍，并且是對常規(guī)，耳熟能詳的中藥進行測定，學生的學習興趣和積極性得到提高［7］。

2 “色譜-質譜聯用技術”在中藥學專業(yè)本科教學中的實踐

由于色譜-質譜聯用儀器昂貴，維護及維修費用成本高且公套數少。在本科教學中使用該類儀器，一旦出現損壞則會影響科研進度，所以在高校色譜-質譜聯用儀這類高端儀器基本上只用于科研工作中。為了證實“色譜-質譜聯用技術”在中藥專業(yè)實踐的可行性，嘗試在本科三年級中藥專業(yè)的學生中開展該類儀器的使用。這部分學生已完成了分析化學、藥物分析、波譜解析和中藥制劑分析等理論課和基礎實驗課，了解了基本的分析儀器理論知識，也掌握了相關的實驗技能。根據實驗設置的目的，結合中藥學科研及社會應用情況設置具體實驗項目，見表1。

表1 實驗項目列表

2.1 氣相色譜技術（GC）

氣相色譜技術（GC）利用物質的沸點和極性不同實現混合物的分離，用于測定中藥的揮發(fā)油、氨基酸、脂肪酸等分子量小或易揮發(fā)物質，成為科研機構藥物含量測定、溶劑和農藥殘留分析、雜質檢查等中藥質量控制常用技術。本實驗中，將“氣相色譜法測丙酮的含量”這個實驗改為“氣相色譜法測定藿香正氣水中乙醇含量”，該操作簡單，方法快捷。圖1 所示為利用氣相色譜法測藿香正氣水中的乙醇，乙醇出峰時間為2.417 min。

2.2 高效液相色譜技術（HPLC）

圖1 氣相色譜法測藿香正氣水中乙醇峰（2.417 min）

中藥材及其復方制劑中有效成分的含量是衡量其質量的重要指標。高效液相色譜法（HPLC）能夠測量揮發(fā)性好和熱穩(wěn)定性差的樣品，是中藥研究的最重要的方法之一。在具體實踐中，選用常用中藥六味地黃丸為研究對象，六味地黃丸主要成分為熟地黃、山藥、山萸肉、丹皮、澤瀉、茯苓，具有滋陰補腎的功效，包括湯劑、小蜜丸、大蜜丸、口服液、濃縮丸等多種劑型。六味地黃丸中丹皮酚含量是《中國藥典》規(guī)定的檢測其質量的重要指標。HPLC 在這方面應用廣泛，能測定黃酮類、生物堿類、皂苷類、醌類、香豆素類及各種成分。因此，結合藥典，本實驗利用高效液相色譜法測定六味地黃丸中丹皮酚的含量來拓展學生能力。從而保證學生掌握高效液相色譜儀的使用，掌握該類儀器在中藥制劑定量分析中的應用［8-10］。圖2 所示為利用高效液相色譜測到的丹皮酚的色譜峰，出峰時間為3.150 min。

圖2 高效液相色譜測六味地黃丸中丹皮酚（3.15 min）

2.3 氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）

氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）方法，發(fā)展成熟，目前已經成為中藥化學成分研究的重要手段。GC-MS具有高分離效能、強選擇性、高靈敏度等優(yōu)勢，在中藥揮發(fā)性成分的分析和含量、中藥中農藥和試劑殘留測定等領域發(fā)揮著重要作用，廣泛應用于中藥復雜組分的分離與鑒定［11］。本科生實驗選取道地藥材溫郁金作為研究對象，因為溫郁金為著名的“浙八味”之一，主產于浙江溫州，藥用歷史悠久。其功能主治以清心解郁、保肝利膽為主。溫郁金的主要成分為揮發(fā)油，組織學生查找文獻，設計方法，借助氣相色譜質譜法鑒定溫郁金中揮發(fā)油的成分（見圖3），利用面積歸一法計算揮發(fā)油的成分，幫助學生掌握該儀器的結構原理和適用范圍。

2.4 高效液相色譜-質譜聯用（HPLC-MS）

圖3 溫郁金中揮發(fā)油的氣相色譜質譜聯用譜圖

液相色譜-質譜聯用技術（HPLC-MS）克服了GCMS的局限性，具有快速、靈敏度更高、測量范圍廣、定性和定量能力強等優(yōu)點，是中藥化學成分分析、中藥代謝物和代謝組學研究的理想工具，具有廣闊的應用前景。姜黃素是從姜科、天南星科中的一些植物的根莖中提取的一種化學成分，為二酮類化合物。

姜黃素血藥濃度檢測方法有UV，HPLC-UV，HPLC-ECD，用于體內分析時步驟多且誤差大，學生實踐性差，帶領學生摸索HPLC-MS測定姜黃素的大鼠血漿中的濃度的方法，通過比較分析，找出步驟簡單且靈敏度更高的方法［12-15］。實驗采用ACQUITY I-Class UPLC和XEVO TQS-micro 三重四極桿質譜儀（Waters Corp，Milford，MA，USA）。Masslynx 4. 1 軟件（Waters Corp.）進行數據采集和儀器控制。色譜柱為UPLC BEH C18 （2.1 mm ×50 mm，1.7 μm），柱溫設為40℃。流動相由乙腈和0.1%甲酸組成，梯度洗脫，流速為0.4 mL/min。從初始到0.2 min，乙腈保持在10%；經過1.3 min，乙腈從10%升到75%；乙腈在75%保持0.5 min；經過0.5 min，乙腈從75%返回到10%；乙腈在10%平衡1.5 min?？偣策\行時間為4.0 min。氮氣作為去溶劑化氣體（800 L/h）和錐形氣體（50 L/h）。毛細管電壓設為2.2 kV，離子源溫度為150 ℃和去溶劑化溫度為400 ℃。電噴霧離子源（ESI），正離子檢測，采用多反應監(jiān)測（Multiple reaction monitoring）方式進行定量分析，姜黃素m/z 369.202→177.051 錐孔電壓為32 V，碰撞電壓為26 V），圖4 所示為大鼠血漿中姜黃素超高效液相色譜質譜聯用圖譜。

3 開放大型儀器培養(yǎng)技術型人才

圖4 大鼠血漿中姜黃素超高效液相質譜聯用譜圖

本次實驗探索借助浙江省藥學實驗示范中心的大型儀器共享平臺，讓色譜質譜聯用技術貫穿中藥專業(yè)本科教學實驗，希望為學生畢業(yè)以后順利融入社會打下基礎。浙江省藥學實驗示范中心配備有Waters XEVO TQ-S micro 三重四級桿液質聯用儀，Agilent 5975B-6890N 氣相色譜質譜聯用，Waters UPLC HClass系統，Agilent 1260 HPLC（配DAD、電化學檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器）等。主要通過以下手段實施：①定期舉辦色譜質譜聯用技術理論、實踐培訓班，由經驗豐富的、管理質譜聯用儀器的專業(yè)人員任教，或者邀請對應的儀器公司工程師舉辦儀器專題講座；②編寫大型分析儀器使用教材，目前大多數有關大型分析儀器的教材偏重理論和研究，可由有管理質譜聯用等大型儀器經驗的專業(yè)人員編寫教材，在編寫過程中首先充分考慮學生在實際操作中的困難，以固定型號儀器為樣本，盡可能舉一反三，在實用性方面，文字表達簡練，圖文并茂，并有相關儀器使用教程的視頻講解；③將色譜質譜聯用技術融入本科實驗中?？紤]到現有大型儀器的情況及課程銜接等因素，實驗帶教老師對實驗講義做了修改并進行了可行性分析。④ 浙江省藥學實驗示范中心的大型儀器共享平臺向本科生開放，讓優(yōu)秀的學生融入科學研究中，使學生有更多的機會接觸大型儀器，提高實驗操作能力。

4 結 語

通過色譜-質譜聯用技術在中藥學專業(yè)本科教學中的實踐與探索，取得了較好的教學效果，實踐表明，色譜-質譜聯用可以充分用于本科教學實驗，也可以推斷大型儀器設備資源充分用于本科教學實驗。利用大型儀器作為支撐，將本科教學中的簡單驗證實驗納入綜合性研究性實驗，給學生提供了足夠的空間思考，討論和相互學習。本科生利用大型儀器在上課時間內完成各類綜合實驗，這對提高實驗技能，開拓專業(yè)視野，培養(yǎng)創(chuàng)新思維有很大幫助。將繼續(xù)探索和實踐大型儀器設備在本科實驗教學中的使用，提高實驗教學質量，培養(yǎng)更多高水平的技術人才。