鄰氨基苯酚對水生生物毒性效應(yīng)

林紹霞，龔會琴，李 俊，楊鴻波

（貴州省分析測試研究院，貴陽550014）

0 引 言

鄰氨基苯酚分子中含有一個羥基和一個氨基，屬兩性有機化合物，表觀顯示Lewis 酸、堿兩性，是一種重要的工業(yè)原料［1］，廣泛用于毛皮染料及有機合成和染料中間體，如生產(chǎn)酸性媒介藍R、硫化黃棕、熒光增白劑EBF等［2］。不僅是農(nóng)藥伏殺硫磷的主要原料，還可作為脂肪酸化學(xué)修飾劑用于分析脂肪酸，由鄰氨基苯酚與羰基化合物合成的Schiff堿及某些金屬配合物在催化行為、磁學(xué)性質(zhì)和酶模擬等方面也有重要作用。鄰氨基苯酚在污水處理系統(tǒng)中作為解偶聯(lián)劑能優(yōu)化活性污泥產(chǎn)率［3］，進入水體造成水環(huán)境污染，且具有毒性大難以生物降解的特性［4］。已有研究證明，長期使用含氨基苯酚的染發(fā)劑會對人體健康造成危害［5］，因此，歐盟、日本等對化妝品中氨基苯酚最大限量作了明確規(guī)定，我國《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》也對其制定了嚴格限量標(biāo)準(zhǔn)［6］。而目前針對鄰氨基苯酚的報道多集中在污水凈化處理［3］、化學(xué)工藝設(shè)計［7］方面，對鄰氨基苯酚環(huán)境毒性效應(yīng)的研究未見相關(guān)報道，進入水環(huán)境后對水生生物的抑制效應(yīng)及濃度水平鮮有研究。

毒性試驗通過設(shè)計一系列隨化學(xué)物質(zhì)濃度不斷增高而設(shè)置的容器中進行化學(xué)物質(zhì)致死或亞致死效應(yīng)的典型分析，生物體對濃度不斷增高的化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)是重要的測定終點［8］。水生生態(tài)系統(tǒng)中，從食物鏈關(guān)系考慮，大型溞以浮油植物為食，同時又是魚類和大型無脊椎動物的餌料，是水生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)和能量流動的重要環(huán)節(jié)［9］。本研究以水生生態(tài)系統(tǒng)營養(yǎng)級上的3 種代表性生物：單細胞類的羊角月牙藻（Selenastrum capricornutum）、大型溞（Daphnia magna）和稀有鮈鯽（Gobiocypris rarus）為試驗生物，通過研究鄰氨基苯酚對3 種生物食物鏈水平的毒性數(shù)據(jù)，預(yù)測其環(huán)境無影響濃度（PNECs），通過濃度-效應(yīng)曲線測定生物在特定環(huán)境濃度下的生物學(xué)反應(yīng)［10］。旨在為制定鄰氨基苯酚的水生生物基準(zhǔn)值提供參考數(shù)據(jù)，為水環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)制定和水環(huán)境管理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 受試生物

試驗所用的羊角月芽藻、大型溞和稀有鮈鯽種源均購于中科院水生生物研究所，其中羊角月牙藻和大型溞在試驗條件下培養(yǎng)直至滿足試驗要求。試驗生物信息見表1 所示。

表1 試驗生物特征

1.1.2 試驗物質(zhì)

鄰氨基苯酚：淺灰色粉末，純度99%，購于阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.1.3 試驗用水

試驗用水為貴陽市市政居民飲用自來水，經(jīng)曝氣脫氯72 h以上，控制水質(zhì)指標(biāo)范圍：pH6 ～9，水硬度以CaCO3計＜180 mg/L，水中溶解氧（DO）含量為80%～110%，大于空氣中飽和氧含量的80%。

1.1.4 試驗儀器

電子天平（Al204，梅特勒），pH 計（PHB-4，上海雷磁），藻類計數(shù)儀（S200、杭州迅速）、照度計（T-10A，柯尼卡美能達），高效液相色譜儀（1260，安捷倫），人工氣候培養(yǎng)箱（RGX-250，泰斯特），溶解氧測定儀（HQ30d，哈希）。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗環(huán)境條件

羊角月芽藻：按照文獻［11］中制備的無機鹽培養(yǎng)液中進行，并控制試驗溫度（23 ±2）℃；光/暗比14 h/10 h；光照強度4 400 ～8 800Lux［12］。

大型溞：曝氣自來水中進行，并控制溫度20 ℃，持續(xù)黑暗。

稀有鮈鯽：曝氣自來水中進行，溫度（24 ±0. 2）℃；光照12 ～16 h/d；試驗水pH ＝8.0 左右；溶解氧不低于空氣飽和值的60%。

1.2.2 試驗方法

分別用無機鹽營養(yǎng)液、曝氣自來水制備鄰氨基苯酚試驗溶液，并以一定比例間距配制系列梯度試驗溶液，在不同濃度溶液中引入受試生物，進行毒性暴露試驗，并設(shè)置空白對照組。

羊角月芽藻試驗用無機培養(yǎng)分別配制濃度0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/L 鄰氨基苯酚溶液100 mL，引入藻種使藻細胞濃度達1 ×104cells/mL，于試驗開始后24、48、72 h通過觀察溶液中細胞數(shù)，評價羊角月芽藻在受試物溶液中的生長抑制情況，試驗過程中監(jiān)測試驗溶液pH值及溶液中鄰氨基苯酚濃度變化情況。

大型溞試驗用曝氣自來水制備鄰氨基苯酚溶液系列濃度為1. 4、1. 7、2. 0、2. 4、2. 9、3. 5 mg/L 各100 mL，每個溶液中轉(zhuǎn)入處于對數(shù)生長期的幼溞5 只，于試驗開始后24、48 h觀察并記錄試驗溞活動狀況以評價大型溞受抑制效應(yīng)，試驗過程中監(jiān)測溶液pH值、溶解氧和鄰氨基苯酚濃度。

稀有鮈鯽試驗用曝氣自來水制備濃度為0. 80、0.96、1.15、1.38、1.66、2.00、2.40 和2.88 mg/L 溶液各3 L，每個溶液中引入10 尾魚，分別于3、6、24、48、72 和96 h觀察受試魚的中毒癥狀并及時取出死魚，每24 h統(tǒng)計一次受試魚的死亡率，監(jiān)測溶液pH值、溶解氧、鄰氨基苯酚濃度。

1.2.3 計 算

（1）羊角月牙藻抑制濃度。羊角月牙藻生物量增長的抑制百分率

式中：Iy為試驗組生物量增長的抑制百分率，%；Yc為空白對照組測定的藻單位生物量；Yt為試驗組測定的在單位生物量。

藻生長率的抑制百分率

式中：Ic為試驗組藻生長率的抑制百分率，%；μc為空白對照組生長率；μt為試驗組生長率。

式中：μj-i為在時間點i到時間點j之間的平均生長率；Xi為在時間點i時的藻單位生物量；Xj為在時間點j時的藻單位生物量。

（2）半數(shù)效應(yīng)濃度計算。試驗數(shù)據(jù)用SPSS15.0進行處理，計算鄰氨基苯酚對羊角月牙藻、大型溞、稀有鮈鯽半數(shù)毒性效應(yīng)的濃度EC50/LC50和95%置信限。

2 結(jié)果與分析

2.1 鄰氨基苯酚對羊角月牙藻的毒性效應(yīng)

在僅有無機培養(yǎng)基存在的空白對照處理中，羊角月牙藻細胞呈對數(shù)迅速增長，而含鄰氨基苯酚的溶液均對藻細胞生長具有不同的抑制作用。從表2 可見，培養(yǎng)72 h后，空白對照中藻細胞增長為初始時的253倍，隨著溶液中鄰氨基苯酚濃度的增大，藻細胞增長率銳減，當(dāng)鄰氨基苯酚溶液濃度達1.6 mg/L時，培養(yǎng)72 h后，溶液中藻細胞僅增長為初始的6 倍，表明鄰氨基苯酚的存在嚴重抑制了藻細胞對數(shù)增長的規(guī)律。試驗結(jié)果顯示，當(dāng)鄰氨基苯酚濃度達0.8 mg/L時，72 h 對藻生長抑制率已達56.66%，經(jīng)計算得鄰氨基苯酚對羊角月芽藻的生長抑制率達50%時的濃度即72 h 的EC50為0.78 mg/L。

表2 不同暴露條件下羊角月芽藻生物量結(jié)果

在鄰氨基苯酚作用下，羊角月牙藻細胞形態(tài)也發(fā)生變化，如表3 所示。當(dāng)鄰氨基苯酚濃度≥0.8 mg/L時，在暴露24 h后，可觀察到藻細胞明顯變小的現(xiàn)象，影響細胞分裂過程。

表3 不同暴露條件下藻細胞形態(tài)

2.2 鄰氨基苯酚對大型溞的毒性效應(yīng)

為避免試驗溶液中溶解氧、pH值變化對溞的正常活動產(chǎn)生影響，實時監(jiān)測溶液pH值，保證試驗時溶液pH值始終維持在7.5 ±0.2，溶解氧濃度為9.5 mg/L以上，溫度維持在（20 ±0.2）℃，以避免溞出現(xiàn)非毒性作用的異常死亡。

鄰氨基苯酚對大型溞毒性作用如表4 所示，在暴露24 h條件下，鄰氨基苯酚溶液濃度為2.0 mg/L時，溞開始表現(xiàn)出游泳緩慢和死亡的現(xiàn)象，當(dāng)濃度達2.9 mg/L時，對溞的毒性效應(yīng)達到半數(shù)致死；在暴露48 h條件下，鄰氨基苯酚溶液濃度1.4 mg/L 時，溞即開始表現(xiàn)出游泳緩慢和死亡的現(xiàn)象。經(jīng)計算得鄰氨基苯酚對溞半數(shù)效應(yīng)濃度24 h的EC50為2.6 mg/L，95%置信限為2. 4 ～ 2. 9 mg/L；48 h 的EC50為2. 2 mg/L，其95%置信限為2.0 ～2.4 mg/L。

表4 不同暴露條件下大型溞毒性效應(yīng)

2.3 鄰氨基苯酚對稀有鮈鯽的毒性效應(yīng)

為避免水環(huán)境因素對稀有鮈鯽正?；顒拥挠绊?，試驗中各試驗溶液的溶氧量控制在空氣飽和溶解氧的70% ～100%之間，pH 值為8.0 ±0.2，溶液溫度為（24±0.2）℃ 范圍內(nèi)，以準(zhǔn)確表達鄰氨基苯酚對魚的毒性效應(yīng)。表5 所觀察的試驗現(xiàn)象顯示，在暴露96 h后，當(dāng)鄰氨基苯酚溶液濃度為0.96 mg/L時，稀有鮈鯽出現(xiàn)中毒現(xiàn)象。鄰氨基苯酚濃度為2.88 mg/L 時，稀有鮈鯽暴露48 h后即表現(xiàn)出側(cè)翻、頻繁換氣等中毒癥狀，暴露72 h即全部致死。

在鄰氨基苯酚濃度為0.96 mg/L 時，稀有鮈鯽暴露96 h后死亡率達20%，濃度為2.40 mg/L 時，暴露72 h即全部致死，通過建立魚死亡率與鄰氨基苯酚濃度相關(guān)性，計算鄰氨基苯酚對稀有鮈鯽48 h的LC50為2.52 mg/L，95% 置信限為2.13 ～ 2.97 mg/L；72 h 的LC50為1.52 mg/L，95% 置信限為1.22 ～1.89 mg/L；96h的LC50為1.16 mg/L，95%置信限為0.92 ～1.47 mg/L如圖6 所示。在96 h 的試驗周期內(nèi)，使稀有鮈鯽全部死亡的鄰氨基苯酚最低濃度，及最低可觀察效應(yīng)濃度（LOEC）為2.00 mg/L，全部存活的最高濃度，即無觀察效應(yīng)濃度（NOEC）為0.80 mg/L。

表5 不同暴露條件下魚毒性效應(yīng)

表6 不同暴露條件下稀有鮈鯽死亡率

3 討 論

3.1 鄰氨基苯酚的生物毒性效應(yīng)級別

根據(jù)國家環(huán)境保護總局對化學(xué)品管理毒性分級標(biāo)準(zhǔn)［13］，鄰氨基苯酚對羊角月牙藻72 h 的EC50為0.78 mg/L ＜1 mg/L，屬極高毒性級別，對大型溞48 h 的EC50為2.2 mg/L，介于1 ～10 mg/L 間，屬高毒級別；稀有鮈鯽96 h 的LC50為1.16 mg/L，介于1 ～10 mg/L間，亦屬高度級別。從化學(xué)品風(fēng)險控制的角度出發(fā)，危險化學(xué)品毒性劃分應(yīng)以敏感性生物限制為原則進行管控［14］，因此判定鄰氨基苯酚對水生生物毒性時，應(yīng)以敏感性水生生物——羊角月牙藻的毒性效應(yīng)為限制標(biāo)準(zhǔn)，將鄰氨基苯酚視為對水生生物具有極高毒性的一類物質(zhì)進行管理。

3.2 鄰氨基苯酚水生生物危害性

鄰氨基苯酚水生生物毒性的研究未見報道，而對其同分異構(gòu)體——對氨基苯酚的毒性研究顯示，含對氨基苯酚的廢水具有高的生物急性毒性，對梨形四膜蟲、斑馬魚的24 h急性毒性LC50分別為19.5 和32.5mg/L［15］，說明處于食物鏈底端的低等級水生生物對氨基苯酚毒性更為敏感，而本研究得出單細胞藻的敏感性更高的結(jié)論，進一步驗證了氨基苯酚的毒性效應(yīng)規(guī)律。魚類作為這一食物鏈上高級消費者，鄰氨基苯酚通過魚類以直接攝入或食物鏈累計的方式影響魚的生長、發(fā)育和生存。在水生生物危害性試驗中，為避免試驗介質(zhì)的差異導(dǎo)致試驗生物的異常反應(yīng)，需嚴格控制各種非生物因子的影響，如水溶液中溶解氧濃度、溫度、氫離子濃度（pH值）等，以控制試驗影響因素的一致性。隨著鄰氨基苯酚在毛皮染料、農(nóng)藥生產(chǎn)原料、污水處理中解偶聯(lián)劑的應(yīng)用，對水環(huán)境的危害風(fēng)險逐步加大。鄰氨基苯酚對水中微生物有抑制作用，受污染水的可生化性不強，致使水不能直接進行生化處理加以凈化，針對水中鄰氨基苯酚去除方法的研究在不斷探索中［16］。

3.3 鄰氨基苯酚環(huán)境風(fēng)險性

雖然化學(xué)品對水生生物的環(huán)境風(fēng)險取決于毒性效應(yīng)和環(huán)境暴露量兩方面，在暴露量無法評估的情況下，環(huán)境風(fēng)險的監(jiān)管還是依靠代表性生物的急性毒性試驗數(shù)據(jù)為化學(xué)品風(fēng)險管理提供重要參考依據(jù)。本研究結(jié)果顯示，鄰氨基苯酚對淡水生態(tài)系統(tǒng)食物鏈上3 個營養(yǎng)級別上的代表性生物均具有高的毒性，其中對單細胞羊角月牙藻的最為敏感，72 h的EC50為0.78 mg/L，已達到極高毒性級別，對稀有鮈鯽和大型溞的毒性效應(yīng)都為高毒級別，因此對其風(fēng)險監(jiān)管應(yīng)立足與極高毒性級別的管控，屬環(huán)境危害高風(fēng)險物質(zhì)。

4 結(jié) 語

鄰氨基苯酚作為重要的化工原料而廣泛用于生產(chǎn)制備，其向環(huán)境擴散將構(gòu)成嚴重環(huán)境生態(tài)。本研究得出，鄰氨基苯酚對淡水生態(tài)系統(tǒng)食物鏈的3 個營養(yǎng)級別上代表性生物均具有高的毒性，其中對單細胞羊角月牙藻的最為敏感，72 h的EC50為0.78 mg/L，已達到極高毒性級別。對稀有鮈鯽和大型溞的毒性效應(yīng)都為高毒級別。

鄰氨基苯酚是一種致敏性物質(zhì)，與人體接觸會引起氣管類疾病和接觸性的皮膚炎，鄰氨基苯酚吸入過量時，會引起對人的生命造成威脅的高鐵血紅蛋白血癥。若鄰氨基苯酚泄漏到自然環(huán)境中，對環(huán)境造成的危害將不可逆轉(zhuǎn)性。因此，必須完善對鄰氨基苯酚污染水體的控制措施，提高對鄰氨基苯酚管控力度，盡最大可能降低鄰氨基苯酚對水環(huán)境的危害程度。