新冠病毒SARS-CoV-2 檢測(cè)方法研究進(jìn)展

王淑燕，李 娜，張欣悅，王 強(qiáng)

（1.蘭州大學(xué)功能有機(jī)分子化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室化學(xué)化工學(xué)院，蘭州730000；2.四川大學(xué)華西藥學(xué)院，成都610227）

0 引 言

自2019 年新冠肺炎出現(xiàn)以來，疫情已波及全球100 多個(gè)國(guó)家，截至2020 年5 月8 日，全球范圍內(nèi)已有累計(jì)確診新冠肺炎病例3 767 744 例，累計(jì)死亡病例259 593 例。該病作為一種急性呼吸道傳染病已列入《中華人民共和國(guó)傳染病預(yù)防法》所規(guī)定的乙類傳染病，按照甲類傳染病管理，由新冠病毒所引起的肺炎，主要通過呼吸道飛沫傳播和人體密切接觸傳播，長(zhǎng)期存在于密閉性較好的環(huán)境中則可通過氣溶膠傳播，人群普遍易感染，具有乏力、干咳、發(fā)熱等主要感染特征，潛伏期1 ～14 d，大多為3 ～ d 天［1］，國(guó)際病毒分類委員會(huì)（ICTV）將此新型冠狀病毒正式命名為SARS-CoV-2，此前該病毒被世衛(wèi)組織暫時(shí)命名為2019-nCoV。SARS-CoV-2 是迄今為止人類發(fā)現(xiàn)的第7 種可以感染人體的冠狀病毒，其他6 種分別為HCoV-229E、HCoVNL63、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、SARS-CoV 和MERSCoV［2-3］，SARS-CoV-2 病毒臨床特征不顯著，傳染性強(qiáng)且感染人群多，在疫情防控及臨床治療中面臨著極大的困難，研發(fā)操作簡(jiǎn)易、測(cè)量快速的檢測(cè)手段刻不容緩，因此，各醫(yī)院及各研發(fā)團(tuán)隊(duì)陸續(xù)用不同的方法研制出多種新冠病毒檢測(cè)試劑盒，從而達(dá)到快速檢測(cè)的目的。而新冠病毒和SARS病毒全基因組水平的高度同源性［4］也為試劑盒的設(shè)計(jì)提供了幫助，新冠病毒是一種RNA 病毒，試劑盒檢測(cè)原理通常是逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法（RT-PCR）達(dá)到擴(kuò)增病原體的核酸（RNA）的目的，并通過熒光等發(fā)光物質(zhì)作為探針對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)?，F(xiàn)有多個(gè)科研機(jī)構(gòu)已公布了新冠病毒的基因組序列［5］，并已用于檢測(cè)試劑盒的研制。本文首先介紹了新冠病毒SARS-CoV-2 結(jié)構(gòu)及與生物體的作用機(jī)理，其次詳細(xì)介紹了各種病毒檢測(cè)方法，最后對(duì)當(dāng)前檢測(cè)方法存在的問題及可能改進(jìn)之處進(jìn)行了總結(jié)與展望。

1 新冠病毒SARS-CoV-2 結(jié)構(gòu)及與生物體的作用機(jī)理

SARS-CoV-2 冠狀病毒為β 屬有包膜的單股正鏈RNA病毒，直徑在60 ～140 nm，顆粒為圓形或橢圓形，常為多形性［1］，因病毒包膜具有可以向四周延伸的凸起，形似花冠，故得名為冠狀病毒（見圖1）。冠狀病毒主要通過核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，N）、小包膜蛋白（envelope protein，E）、刺突表面糖蛋白（spike protein，S）和基質(zhì)蛋白（matrix protein，M）組成。其中S蛋白易與細(xì)胞結(jié)合并促進(jìn)病毒的遺傳物質(zhì)侵入受體細(xì)胞［6］，而N蛋白在病毒的轉(zhuǎn)錄中起一定的作用。

圖1 （a）新型冠狀病毒武漢株02（C-F13-nCoV Wuhan strain 02），NPRC 2020.00002 的透射電子顯微鏡結(jié)構(gòu)［7］（經(jīng)許可復(fù)制，Copyright? 2020 中國(guó)國(guó)家病原微生物資源庫，中國(guó)國(guó)家微生物科學(xué)數(shù)據(jù)中心），（b）SARS-CoV-2 的結(jié)構(gòu)示意圖（經(jīng)許可復(fù)制，Copyright? 2020 Centers for Disease Control and Prevention，the United States）

2020 年，Wrapp研究組用冷凍電鏡技術(shù)揭示新冠病毒表面S 蛋白三維結(jié)構(gòu)［8］，且對(duì)S 蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，如圖2（a）、2（b）所示，發(fā)現(xiàn)其受體結(jié)合域（receptor-binding domain，RBD）通過上下移動(dòng)的方式來決定是否與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，即向上時(shí)S 蛋白可以通過RBD與受體結(jié)合，使得細(xì)胞膜與病毒包膜相互融合，細(xì)胞中因侵入病毒的遺傳物質(zhì)而被感染，而向下時(shí)結(jié)合部位則會(huì)隱藏。

圖2 （a）RBD 朝下、（b）RBD 朝上［8］及（C）冷凍電鏡下ACE2 的三維結(jié)構(gòu)［9］（經(jīng)許可復(fù)制，Copyright? 2020 the American Association for the Advancement of Science）

為了進(jìn)一步對(duì)冠狀病毒識(shí)別，Yam R［9］等也通過冷凍電鏡技術(shù)首次成功解析出細(xì)胞表面受體-血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（Angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）的全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)［見圖2（c）］，其為多數(shù)冠狀病毒入侵生物體的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。Walls，A. C.等人對(duì)SARS 病毒（SARS-CoV）及新冠病毒（SARS-CoV-2）S 蛋白的結(jié)構(gòu)、序列及功能等多方面進(jìn)行比較，證明新冠病毒入侵宿主細(xì)胞的機(jī)制和SARS 病毒相似，即病毒的S 蛋白利用細(xì)胞表面的ACE2 進(jìn)入受體［10］，這和Munster 組通過實(shí)驗(yàn)證明的ACE2 是SARS-CoV-2 的功能受體結(jié)果一致［11］。Rao 等［12］報(bào)道了新冠病毒RNA 依賴性RNA聚合酶（RdRp）的結(jié)構(gòu)，作為具有潛力的藥物靶點(diǎn)，RdRp結(jié)構(gòu)的成功解析，為新冠病毒的治療提供了基礎(chǔ)。

準(zhǔn)確解析出新冠病毒S 蛋白、ACE2 受體及藥物靶點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)，揭示病毒的作用機(jī)理，對(duì)進(jìn)一步研制疫苗或設(shè)計(jì)有效的治療方案具有指導(dǎo)性意義。

2 檢測(cè)方法

新冠病毒的主要檢測(cè)方法包括抗原抗體、測(cè)序、PCR、CRISPR以及其他的一些檢測(cè)技術(shù)并制成便于攜帶的檢測(cè)試劑盒。截至2020 年4 月22 日，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局共批準(zhǔn)新冠病毒核酸檢測(cè)試劑19 個(gè)，抗體檢測(cè)試劑11 個(gè)。需要說明的是：鑒于抗體檢測(cè)試劑方法學(xué)特點(diǎn)，產(chǎn)品僅用作對(duì)新型冠狀病毒核酸檢測(cè)陰性疑似病例的補(bǔ)充檢測(cè)指標(biāo)或疑似病例診斷中與核酸檢測(cè)協(xié)同使用，不作為新型冠狀病毒感染的肺炎確診和排除的依據(jù)，不適用于一般人群的篩查，僅限醫(yī)療機(jī)構(gòu)使用。不僅中國(guó)的新冠病毒檢測(cè)試劑盒在不斷的更新進(jìn)步，國(guó)外一些研究機(jī)構(gòu)的研究成果也促進(jìn)了檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，如德國(guó)分子診斷公司Qiagen 使用床邊分子檢測(cè)（Molecular Point-of-Care）技術(shù)，僅需1 h就可以完成測(cè)試；美國(guó)的雅培公司研制出的“ID NOW”新冠病毒核酸檢測(cè)產(chǎn)品，稱其能夠在5 min 內(nèi)完成新冠病毒陽性樣本的測(cè)試；以色列希伯來大學(xué)研究人員使用磁性納米粒子材料提取拭子中的RNA分子，檢測(cè)速度較原來提升了4 ～10 倍。表1 詳細(xì)列舉了我國(guó)已批準(zhǔn)的新冠病毒檢測(cè)試劑盒。

表1 我國(guó)已獲批新冠病毒檢測(cè)試劑清單

病原體的檢測(cè)一般可分為病毒分離培養(yǎng)檢測(cè)、針對(duì)病毒RNA的分子生物學(xué)檢測(cè)和基于病毒抗原-抗體反應(yīng)的免疫學(xué)檢測(cè)，下面將詳細(xì)介紹各種檢測(cè)方法。

2.1 分離培養(yǎng)檢測(cè)

分離培養(yǎng)法自1913 年首次用于牛痘病毒的培養(yǎng)，經(jīng)過百年的發(fā)展，檢測(cè)準(zhǔn)確性較高，是病毒鑒定檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”［13］，但由于該方法對(duì)技術(shù)的要求高，測(cè)樣所耗時(shí)間長(zhǎng)，操作步驟繁瑣，故無法適應(yīng)于病原體的快速檢測(cè)。分離培養(yǎng)SARS-CoV-2 并用電鏡技術(shù)進(jìn)行觀察研究，為病毒致病機(jī)理、疫苗和藥物的研究做出重要貢獻(xiàn)，目前已有數(shù)篇SARS-CoV-2 病毒分離鑒定的文章，如Lu等［14］通過人氣道上皮細(xì)胞（HAE）對(duì)病毒進(jìn)行分離培養(yǎng)，并使用電鏡來觀察病毒的形態(tài)變化，3 次傳代后收集標(biāo)本上清液進(jìn)行檢測(cè)來確定是否為新型冠狀病毒。當(dāng)然，不同的細(xì)胞受SARS-CoV-2 病毒的感染程度不同，發(fā)表在Cell 上的文章表明［15］，只有低于10%的呼吸道細(xì)胞和腸道細(xì)胞會(huì)同時(shí)產(chǎn)生ACE2 及有助于激活新冠病毒S蛋白的TMPRSS2 酶，這些細(xì)胞可分為鼻腔黏液中的杯狀細(xì)胞、肺部的Ⅱ型肺泡細(xì)胞及小腸內(nèi)的吸收性腸上皮細(xì)胞。與此同時(shí)也有研究表明，ACE2 和TMPRSS2 酶可以在包括鼻氣道中的細(xì)胞中表達(dá)，尤其是鼻腔黏液中的杯狀細(xì)胞和纖毛細(xì)胞中，這兩種蛋白含量最高，研究人員推測(cè)這有可能是SARS-CoV-2 的最初感染途徑［16］。因此，樣本來源可優(yōu)先選擇這些部位的細(xì)胞進(jìn)行新冠病毒的分離培養(yǎng)，一般分離培養(yǎng)過程是收集人氣道上皮細(xì)胞培養(yǎng)4 ～6周后，于其頂面接種加入病毒載體的支氣管肺泡灌洗液樣品上清液，3 次傳代后可收集樣本觀察檢測(cè)。對(duì)新冠病毒傳染范圍廣這一特點(diǎn)，醫(yī)療團(tuán)隊(duì)需要可以迅速檢測(cè)病原體的方法避免貽誤最佳治療時(shí)機(jī)，該方法無法滿足這一條件，不適用于新冠病毒的快速檢測(cè)。

2.2 分子生物學(xué)檢測(cè)

這是一種病原體檢測(cè)從蛋白質(zhì)及細(xì)胞層面進(jìn)入到核酸序列檢測(cè)上的方法，目前發(fā)展比較熱門的領(lǐng)域當(dāng)屬核酸擴(kuò)增技術(shù)、測(cè)序技術(shù)及基因芯片。SARS-CoV-2是單鏈的RNA 病毒，因此需逆轉(zhuǎn)錄先合成互補(bǔ)的cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)［5］。

2.2.1核酸擴(kuò)增技術(shù)

核酸擴(kuò)增技術(shù)又分為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)和恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。PCR 在20 世紀(jì)80 年代就已經(jīng)開發(fā)應(yīng)用于核酸擴(kuò)增［17］，其具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果精準(zhǔn)等優(yōu)點(diǎn)，因此在此基礎(chǔ)上又衍生出實(shí)時(shí)熒光PCR、多重PCR 等技術(shù)，是病原體檢測(cè)中最為常見的檢測(cè)手段。恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)只需要一些簡(jiǎn)單的水浴、空氣浴等恒溫儀器就可以完成基因序列的擴(kuò)增過程，可以不用依賴昂貴笨重的熱循環(huán)儀器。恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)通常包括轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增技術(shù)（transcription mediated amplification，TMA）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）等?；诓《竞怂岬姆肿由飳W(xué)檢測(cè)，也已研制出多種檢測(cè)試劑盒用于新冠病毒的檢測(cè)，截至2020年4 月22 日國(guó)家獲批的19 個(gè)核酸檢測(cè)試劑盒中，熒光PCR 法就占到了12 個(gè)，是一種非常普遍的檢測(cè)方法。下面簡(jiǎn)要介紹核酸檢測(cè)試劑盒的3 種研制技術(shù)。

（1）熒光PCR法。熒光PCR是在常規(guī)PCR檢測(cè)的基礎(chǔ)上加入了熒光物質(zhì)，通過監(jiān)測(cè)發(fā)光信號(hào)來進(jìn)行分析的一種方法。TaqMan 是最為常用的一種探針染料，基本原理是設(shè)計(jì)合成能與目標(biāo)基因特異性結(jié)合的探針，分別于其5′端和3′端標(biāo)記熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)，PCR擴(kuò)增時(shí)由于Taq 酶將探針5′端的熒光基團(tuán)切割導(dǎo)致其與探針分離，從而發(fā)出熒光。用于新冠病毒檢測(cè)的熒光檢測(cè)試劑盒，以新冠病毒ORF1ab 基因和N基因中的序列為靶位點(diǎn)進(jìn)行特異性引物的設(shè)計(jì)，并以寡核苷酸作為熒光探針對(duì)病毒的核酸進(jìn)行檢測(cè)。若要確認(rèn)一個(gè)病例為陽性，則需滿足在同一份檢測(cè)標(biāo)本中新冠病毒的ORF1ab 及N 基因的熒光PCR 檢測(cè)結(jié)果均為陽性，若檢測(cè)條件受限，至少應(yīng)對(duì)新冠病毒的ORF1ab基因進(jìn)行檢測(cè)［18］。熒光PCR 檢測(cè)技術(shù)是一種最為常見的核酸檢測(cè)方式，已廣泛應(yīng)用于生物及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，在此次新冠病毒的檢測(cè)中也發(fā)揮了巨大的作用。

（2）微流控芯片法。微流控芯片是集樣品的制備、反應(yīng)、擴(kuò)增、檢測(cè)等基本操作單元于一塊微米級(jí)芯片上，是操作、檢測(cè)一體化的整合技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)多個(gè)樣品在幾分鐘內(nèi)平行檢測(cè)［19］，通過液體聯(lián)通各個(gè)單元，具有液體流動(dòng)可控、樣品消耗少、檢測(cè)速度快、成本低等優(yōu)點(diǎn)，可用于病原體核酸的檢測(cè)。和受限于傳熱速度的常規(guī)PCR 技術(shù)相比，微流控PCR 芯片由于本身的體積及熱容較小，因而傳熱速度快，有效的縮短了病原體的檢測(cè)時(shí)間［20］。微流控芯片技術(shù)在病原體的檢測(cè)過程中標(biāo)本的取樣量少，通常需要5 ～50 μL就可以完成檢測(cè)，且檢測(cè)靈敏度高及制作成本低廉，是新冠病毒檢測(cè)中的一種不可或缺的方法。

（3）恒溫?cái)U(kuò)增法。以環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）為例，在恒溫65 ℃的條件下，1 h內(nèi)就可以將目標(biāo)DNA 從幾個(gè)拷貝擴(kuò)增到109拷貝［21］。LAMP 測(cè)序過程中不需要昂貴笨拙的熱循環(huán)儀器，只需要在恒溫65 ℃就可以完成，且擴(kuò)增產(chǎn)物通過顏色變化或是否產(chǎn)生沉淀等現(xiàn)象可以用肉眼觀察，如Besuschio 等［22］利用鈣黃綠素可以與LAMP 反應(yīng)體系中的Mg2+結(jié)合使得顏色由黃變綠這一特點(diǎn)來判斷檢測(cè)結(jié)果。此方法檢測(cè)速度快，尤其是靈敏度比較高，因此在核酸檢測(cè)試劑盒中應(yīng)用比較廣泛。

核酸檢測(cè)中的熒光PCR技術(shù)特異性較強(qiáng)，擴(kuò)增和檢測(cè)同時(shí)完成，但受傳熱速度及裝置熱容的限制，整個(gè)擴(kuò)增過程需要幾個(gè)小時(shí)，耗時(shí)較長(zhǎng)，只能相對(duì)定量，可以用于新冠病毒確診檢測(cè)；微流控芯片技術(shù)靈敏度高，如Cooper等［23］實(shí)現(xiàn)了血液中低至1 拷貝/mL 的快速分離檢測(cè)，特異性較好，且檢測(cè)速度快，有報(bào)道稱其能夠在17 min內(nèi)完成34 個(gè)PCR的循環(huán)［24］，可以實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量，適應(yīng)于病毒確診檢測(cè)，但檢測(cè)通量較低，如多個(gè)芯片的同時(shí)檢測(cè)會(huì)受到一定的限制，因此在常規(guī)的檢測(cè)中沒有優(yōu)勢(shì)；LAMP 技術(shù)是在PCR 技術(shù)之后逐漸發(fā)展起來的一種恒溫高效、特異性強(qiáng)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，靈敏度也比較高，在使用RT-LAMP 技術(shù)進(jìn)行口蹄疫病毒檢測(cè)［25］的案例中的檢測(cè)靈敏度達(dá)到103拷貝/μL，但檢測(cè)成本相對(duì)較高，可以用于病毒的初篩檢測(cè)。

2.2.2 測(cè)序技術(shù)

先頭的特務(wù)連早已剪斷了鬼子的電話線。當(dāng)他們排著整齊的隊(duì)伍走出包圍圈時(shí)，一出機(jī)場(chǎng)就遭到日軍哨兵盤問，十六師副師長(zhǎng)顧宏用日語說：我們是皇協(xié)軍，奉命由胡村調(diào)防上葉。

測(cè)序技術(shù)首先在20 世紀(jì)70 年代由英國(guó)科學(xué)家Sanger等［26］建立，開創(chuàng)了鏈終止法，基于化學(xué)降解法的第一代測(cè)序由此形成，但測(cè)序成本較高，為滿足測(cè)序要求而發(fā)展起來的下一代測(cè)序技術(shù)（next generation sequencing，NGS），包括邊合成邊測(cè)序的第2 代測(cè)序技術(shù)［27］，單分子實(shí)時(shí)測(cè)序的第3 代［28］及納米孔單分子測(cè)序的第4 代測(cè)序技術(shù)［29］。美國(guó)疾病預(yù)防控制中心（CDC）在GenBank 上公布了Sanger 測(cè)序及納米孔測(cè)序的新冠病毒序列［30］，Lu 等［14］也通過納米孔測(cè)序在內(nèi)的測(cè)序技術(shù)對(duì)新冠病毒感染者的全長(zhǎng)基因組進(jìn)行了分析。

從第1 代測(cè)序技術(shù)優(yōu)化到第4 代的固態(tài)納米測(cè)序技術(shù)，準(zhǔn)確度提高，測(cè)量成本降低，測(cè)序時(shí)間變短，方便人們準(zhǔn)確獲取基因組信息并用于疾病的治療。

2.2.3 基因芯片

基因芯片又稱DNA微陣列、DNA芯片，取樣后利用核酸分子雜交技術(shù)，通過熒光標(biāo)記序列與事先設(shè)計(jì)好固定在基底上的探針在一定條件下雜交，并對(duì)信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)樣品中mRNA或DNA 的相對(duì)濃度［31］。該技術(shù)從樣品的制備到完成反應(yīng)后結(jié)果的檢測(cè)都集中在芯片中，經(jīng)過一次分析可得到多個(gè)基因序列，相較于傳統(tǒng)檢測(cè)具有自動(dòng)化程度高、效率高、成本低等優(yōu)點(diǎn)［32］。

2.3 免疫學(xué)檢測(cè)

在新冠病毒爆發(fā)的前期，唯一的核酸診斷檢測(cè)手段是逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)，在病人早期診斷中發(fā)揮了巨大作用，是最有效的檢測(cè)途徑。但病人到了后期產(chǎn)生一定抗體后，就可以采用免疫學(xué)檢測(cè)方法?；诿嘎?lián)免疫檢測(cè)法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和膠體金檢測(cè)法的IgM 和IgG 抗體檢測(cè)試劑盒也已經(jīng)上市，這是與針對(duì)病毒RNA的分子生物學(xué)檢測(cè)高度互補(bǔ)的另一種檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)基于血清中抗原和抗體的特異性結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)，通過已知的抗原（抗體）來檢測(cè)病原體的抗體（抗原），因此可以用來方便、迅速鑒定病原體［33-34］。相較于傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法及繁雜的分子生物學(xué)檢測(cè)，此方法明顯在操作步驟上得到了簡(jiǎn)化。尤其是隨著大量無癥狀感染者（核酸檢測(cè)呈陽性，包含感染過新冠病毒但自身已經(jīng)產(chǎn)生保護(hù)性抗體的痊愈者和未發(fā)病的感染者）的出現(xiàn)，核酸檢測(cè)外加做抗體檢測(cè)十分必要，有利于人群分層管理：因?yàn)镮gG存在于人體血清中時(shí)間長(zhǎng)，而IgM 當(dāng)疾病感染人體結(jié)束后通常消失。如果IgM 呈陰性而IgG 呈陽性，意味著受檢者曾感染過病毒但已產(chǎn)生抗體，不再需要隔離。如果IgG 和IgM 都呈陽性，那么受檢者可能是已感染病毒尚未發(fā)病，需要進(jìn)行醫(yī)學(xué)觀察與隔離（處于潛伏期的最終會(huì)發(fā)病，具有傳染性；有些隱性感染者則不會(huì)發(fā)病，直到最后自愈，不具有傳染性）。

（1）酶聯(lián)免疫檢測(cè)法。酶聯(lián)免疫檢測(cè)法（ELISA）是抗原抗體反應(yīng)與酶科學(xué)相互結(jié)合的一種常見的免疫分析方法，即固相載體表面的抗原或抗體仍具有免疫學(xué)活性，而經(jīng)酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留著酶的活性，同時(shí)也具有免疫學(xué)活性［35］。在檢測(cè)時(shí)標(biāo)本中的抗體（抗原）與固相載體表面的抗原（抗體）發(fā)生特異性反應(yīng)形成抗原抗體復(fù)合物，加入酶標(biāo)記的抗原或抗體后也在固相載體表面發(fā)生復(fù)合，由于固相載體中受標(biāo)檢測(cè)物與酶的量成一定的比列關(guān)系，通過酶催化底物顏色的深淺變化進(jìn)行定性或定量的分析從而達(dá)到檢測(cè)的目的。眾所周知，酶的催化效率比較高，因此該方法在靈敏度方面具有很大的優(yōu)勢(shì)，是一種比較常見的新冠病毒檢測(cè)手段。

（3）膠體金法。膠體金檢測(cè)試紙條的結(jié)構(gòu)一般為：以塑料板作為底板，在其中間粘貼硝酸纖維素膜（NC膜），并在NC膜兩端粘貼試劑墊以及吸水膜，試劑墊與NC膜間的連接處粘貼膠紙用于控流。金標(biāo)物與樣本中的待測(cè)物發(fā)生特異性結(jié)合而成的聚合物，在NC膜上擴(kuò)散，到達(dá)C、T 線結(jié)合包被物后會(huì)顯示出裸眼觀測(cè)的條帶［37］。此種方法的試劑盒易于商品化和標(biāo)準(zhǔn)化，操作簡(jiǎn)便，反應(yīng)快速，適應(yīng)于大規(guī)模人群的篩查，在此次新冠病毒的檢測(cè)中應(yīng)用較為廣泛。

免疫學(xué)檢測(cè)通過對(duì)人體血清中病原體所產(chǎn)生的特異性抗體的檢測(cè)，在傳統(tǒng)的臨床病原體檢測(cè)中非常常見，以上列舉的三類具體實(shí)施方案也各有優(yōu)缺點(diǎn)：酶聯(lián)免疫檢測(cè)法對(duì)設(shè)備要求低、檢測(cè)靈敏度高、操作方法簡(jiǎn)便、特異性較強(qiáng)且檢測(cè)成本低，但由于操作步驟多，因此耗時(shí)較長(zhǎng)，通常只能定性或半定量檢測(cè)，該技術(shù)比較適合基層的檢測(cè)機(jī)構(gòu)用于大規(guī)模的篩查；化學(xué)發(fā)光法是一種比較先進(jìn)的免疫檢測(cè)技術(shù)，能夠達(dá)到定量檢測(cè)的目的，具有自動(dòng)化程度高、操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、方法穩(wěn)定及靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但儀器及試劑成本較高，無法大規(guī)模篩查；膠體金法操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)迅速，但靈敏度相對(duì)不高且無法定量檢測(cè)，可以用于輔助快速篩查。

2.4 其他新型檢測(cè)技術(shù)

如圖3 所示，Munster團(tuán)隊(duì)報(bào)道了一種通過檢測(cè)不同細(xì)胞被病毒所感染的差異性來迅速篩查冠狀類病毒的方法［11］。具體來說，新冠病毒S 蛋白的RBD（受體結(jié)合域）是與人體細(xì)胞中的受體直接作用的中介，通過檢測(cè)與病毒結(jié)合的ACE2（血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2）、與MERS病毒結(jié)合的DPP4（二肽基肽酶）等受體與RBD的作用情況，即RBD 有3 個(gè)分支，結(jié)合ACE2 后就屬于分支1，通過這種方法，就能快速的確認(rèn)新冠病毒的檢測(cè)結(jié)果。而這種新方法只需要檢測(cè)S 蛋白R(shí)BD 的序列，取代了傳統(tǒng)方法中對(duì)于S蛋白全長(zhǎng)序列的合成，因此大大提高了檢測(cè)速度。

圖3 病毒S 蛋白通過RBD 與ACE2 受體結(jié)合進(jìn)入人體細(xì)胞［11］（經(jīng)許可復(fù)制，Copyright? 2020 Springer Nature）

基于CRISPR/Cas 系統(tǒng)檢測(cè)RNA 的基因編輯技術(shù)，在很多領(lǐng)域得到了迅速發(fā)展，此技術(shù)可以進(jìn)行生物體內(nèi)的基因編輯修飾［38］。CRISPR系統(tǒng)可以特異性的檢測(cè)RNA從而鑒定所檢測(cè)的樣本中是否有特定序列的存在，進(jìn)而達(dá)到病原體檢測(cè)的目的。其中，張鋒團(tuán)隊(duì)由此開發(fā)的SHERLOCK （specific highsensitivity enzymatic reporter unlocking）技術(shù)比較經(jīng)典［39］。即gRNA會(huì)識(shí)別新冠病毒的S基因和ORF1ab基因，并引導(dǎo)Cas13 對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行切割，通過確認(rèn)是否被切斷從而得到新冠病毒檢測(cè)的結(jié)果［40］，詳細(xì)過程見圖4。檢測(cè)時(shí)首先在42 ℃下通過恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對(duì)核酸樣本進(jìn)行擴(kuò)增，其次在樣本中加入Cas13、gRNA 等分子在37 ℃下反應(yīng)30 min，最后使用試紙進(jìn)行檢測(cè)。需要說明的是單獨(dú)使用CRISPR檢測(cè)技術(shù)通常無法達(dá)到臨床檢驗(yàn)的靈敏度，因此需要和擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合來進(jìn)行新冠病毒的檢測(cè)，目前張鋒等人已經(jīng)公開了結(jié)合擴(kuò)增技術(shù)的新冠病毒CRISPR 檢測(cè)法，國(guó)內(nèi)也有如吐露港等公司開發(fā)的基于CRISPR 的檢測(cè)技術(shù)，但都需要臨床樣本的實(shí)際檢驗(yàn)。

圖4 以編程方式切割與其CRISPR RNA（crRNA）互補(bǔ)的RNA［41］（經(jīng)許可復(fù)制，Copyright? 2019 Elsevier）

3 小結(jié)與展望

新冠病毒的感染是全球面臨的一次嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，快速診斷，及時(shí)治療是打贏這場(chǎng)攻堅(jiān)戰(zhàn)的關(guān)鍵。面對(duì)傳染性強(qiáng)且感染人數(shù)眾多這一現(xiàn)狀，準(zhǔn)確測(cè)量快速的檢測(cè)試劑盒的研制至關(guān)重要，目前世界各地均已研制出多種核酸和抗體檢測(cè)試劑盒。

核酸檢測(cè)是病原體診斷的一種依據(jù)，也是目前確診最重要的手段，作為檢測(cè)最重要的標(biāo)準(zhǔn)，扮演著難以取代的作用。在病毒核酸檢測(cè)中，有的疑似新冠肺炎患者前幾次檢測(cè)呈陰性，但在多次檢測(cè)后最終呈陽性。核酸檢測(cè)中的“假陰性”頻發(fā)受到了廣泛關(guān)注，原因除了患者自身的病程發(fā)展之外，還有一個(gè)重要的原因在于目前核酸檢測(cè)手段過程中有很多的不確定性，應(yīng)當(dāng)科學(xué)看待，不排除部分試劑盒質(zhì)量不高的情況。例如：美國(guó)在疫情初期就曾回收過發(fā)放的不合格試劑盒。同時(shí)也應(yīng)該考慮到新冠病毒感染的特點(diǎn)，導(dǎo)致樣本在采集中出現(xiàn)問題。首先，病人采樣的時(shí)間段也影響采集的病毒數(shù)量，比如早期，中期和晚期，早期例如潛伏期時(shí)沒有癥狀，病毒數(shù)量可能較少，中期采集到的病毒數(shù)量就相應(yīng)多。例如SARS病人3 周后的血液病毒數(shù)量反而減少了。其次，采樣方式也會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。已經(jīng)知道在常用的采樣中，咽拭子，唾液，痰液，肺泡灌洗液中以肺泡灌洗液采集陽性率最高。目前常用的檢測(cè)手段是咽拭子采集疑似病患樣品，采樣的部位是上呼吸道咽，不是病毒容易侵犯的下呼吸道。同樣，病毒在血液、尿液、糞便中也能檢出，但因?yàn)椴⒉皇侵饕腥静课?，病毒含量較少，不能作為檢測(cè)依據(jù)。同時(shí)，由于RNA 很不穩(wěn)定，容易降解，采集后樣品的處理和提取是否合理也是影響因素。核酸檢測(cè)除了樣品采集方面的問題外，還在檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)、防護(hù)要求等方面，想要滿足大范圍的檢測(cè)比較困難。就檢測(cè)時(shí)間而言，不算樣本的處理時(shí)間，PCR 的升溫降溫過程就需要2 h；此外，防護(hù)要求相對(duì)較高，需要2 級(jí)防護(hù)且專門配備PCR儀的實(shí)驗(yàn)室及3 級(jí)防護(hù)且經(jīng)過嚴(yán)格培訓(xùn)的人員要求。而抗體作為人體應(yīng)激反應(yīng)的產(chǎn)物均勻分布在血液中，與核酸檢測(cè)相比更容易獲取樣本且檢測(cè)時(shí)間較短，極大的降低了醫(yī)護(hù)人員在取樣及檢測(cè)過程中被感染的風(fēng)險(xiǎn)，目前針對(duì)“假陰性”的一個(gè)行之有效的辦法就是在核酸檢測(cè)的基礎(chǔ)上補(bǔ)充新型冠狀病毒特異抗體檢測(cè)［42］。因此，在實(shí)驗(yàn)過程中，任何一個(gè)環(huán)節(jié)都不容忽視，否則會(huì)產(chǎn)生“假陰性”等問題。隨著疫情大范圍爆發(fā)且出現(xiàn)無癥狀感染患者，新的檢測(cè)手段也層出不窮。如基于等離子體光熱生物傳感器（plasmonic photothermal biosensor）的檢測(cè)方法［43］，基于電解質(zhì)場(chǎng)效應(yīng)晶體管（FET）的生物傳感檢測(cè)［44］和北京大學(xué)伊成器課題組提出的基于轉(zhuǎn)座酶的TRACE（Transposase assisted RNA/DNA hybrid Co-tagmEntation）建庫測(cè)序技術(shù)等。

為保障檢測(cè)結(jié)果的質(zhì)量，除了采用合格的試劑盒與合理的采樣手段，還需要做到樣本的采集與輸送必須嚴(yán)格遵循程序；對(duì)可疑樣本，可以選用不同的檢測(cè)方法反復(fù)確認(rèn)；檢測(cè)后定期抽取檢測(cè)樣本交由第三方實(shí)驗(yàn)室評(píng)估以保障檢測(cè)的準(zhǔn)確性等。各類方法揚(yáng)長(zhǎng)避短，發(fā)揮出最大的優(yōu)勢(shì)，使新冠病毒的檢測(cè)更迅速、檢測(cè)結(jié)果更可靠。