高溫和HgCl2 復(fù)合處理對水稻花期生理特性和 水通道蛋白基因表達(dá)的影響

胡挺帥，鄭夢琪，鄭嘉琪，羅心怡，張志友，潘偉槐，郭天榮，莫億偉

(紹興文理學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江 紹興 312000)

近年來，連續(xù)高于35 ℃的高溫天氣已成為中國南方水稻種植的自然災(zāi)害之一[1]。2013 年7 月下旬至8 月上旬，江淮稻區(qū)出現(xiàn)持續(xù)異常高溫天氣，給水稻產(chǎn)量造成極大損失[2]。前人[3-4]研究發(fā)現(xiàn)，水稻抽穗開花期、花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期和籽粒充實期對高溫脅迫最為敏感；高溫引起的水分脅迫對籽粒及胚乳的發(fā)育影響較大[5]，且籽粒形態(tài)和產(chǎn)量還受穗期和花期水分虧損程度的影響[6]。稻穗水分和養(yǎng)分主要由劍葉供給[7]，水分供應(yīng)離不開水通道蛋白活性和基因的表達(dá)。水通道蛋白主要有質(zhì)膜嵌入蛋白(plasma membrane intrinsic protein，PIP)、液泡膜嵌入蛋白(tonoplast intrinsic protein，TIP)、類Nod26 嵌入蛋白(nudolin 26-like intrinsic protein，NIP)和膜嵌入小分子堿性蛋白(small basic intrinsic protein，SIP)[8]。研究表明，在稻穗花期，OsTIPs基因家族表達(dá)量最高，其次是OsPIP基因家族[9]；超表達(dá)水通道蛋白基因可提高水稻和煙草對水分脅迫的耐性，增強(qiáng)植物體內(nèi)的水分運(yùn)輸速率[10-11]。水通道蛋白抑制劑HgCl2處理可導(dǎo)致水分脅迫[12]，但對花期水通道蛋白活性及水分運(yùn)輸機(jī)制尚不清楚。為此，本研究以轉(zhuǎn)OsPIN1a的基因水稻為材料，探討高溫脅迫及HgCl2處理對水稻花期的生理特性和水通道蛋白基因家族表達(dá)的影響，旨在探明花期高溫脅迫和水通道蛋白活性與稻穗水分供應(yīng)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

供試水稻材料中花11為轉(zhuǎn)OsPIN1a基因水稻[13]，由紹興文理學(xué)院生物實驗中心保存。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計

2018 年，在紹興文理學(xué)院生物實驗基地進(jìn)行試驗。盆栽種植，常規(guī)水肥管理。從稻株主莖和次二莖處于幼穗分化第7 期時開始，選取穗型大小基本一致的30 個稻穗掛牌標(biāo)記發(fā)育時期，采用記號筆點(diǎn)穎和掛牌相結(jié)合的方法標(biāo)記開花時間[14]。參考張桂蓮等[15]的方法，在開花前6 d 進(jìn)行高溫與水通道蛋白抑制劑處理：對照處理(CK)，人工氣候箱設(shè)置晝夜溫度為30 ℃(7: 00—17: 00)/28 ℃(17: 00 至翌日7: 00)；高溫處理(TR1)，晝夜溫度為38 ℃(7: 00— 17: 00)/33 ℃(17: 00 至翌日7: 00)；復(fù)合處理(TR2)，高溫處理配以 0.1 mmol/L HgCl2處理(每天8: 00，用0.1 mmol/L HgCl2噴施葉片1 次，直到葉片有水滴滴下為止)。處理期間相對濕度控制在80%左右，光照強(qiáng)度為900 μmol/(m2·s)。處理結(jié)束后置于自然條件下培養(yǎng)。在花前6 d 至花后6 d 內(nèi)(稱前6 d、前4 d、前2 d、0 d、后2 d、后4 d 和后6 d，盛花期當(dāng)天標(biāo)記為0 d)，每隔2 d 取稻穗或劍葉，用于試驗分析。試驗重復(fù)3次。

1.2.2 相對含水量的測定

每次隨機(jī)取新鮮稻穗5～6 個，劍葉10～15 片，分別稱量鮮質(zhì)量(W1)；用清水浸泡12 h 后，用吸水紙吸干表面水分，稱重(W2)；再105 ℃殺青10 min，75 ℃烘干至恒重，稱干質(zhì)量(W3)。計算各處理下稻穗和劍葉的相對含水量C。C=(W1－W3)/(W2－W3)× 100%[9]。試驗重復(fù)3次。

1.2.3 柱頭和花粉粒的線粒體活性染色和淀粉粒結(jié)構(gòu)觀察

用50 mmol/L 磷酸緩沖液(pH 7.2)配制0.5%詹納斯綠B 染液，剪取開花當(dāng)天的穎花，去掉穎殼后，用詹納斯綠B 染液對柱頭和花粉粒染色10 min，再用磷酸緩沖液浸泡2 次，清洗表面殘留染料，在光學(xué)鏡下觀察有活性線粒體的染色情況。成熟籽粒干燥后，參考馮芳玖等[13]的方法，每種處理選取20個稻穗，統(tǒng)計結(jié)實率和千粒質(zhì)量，用掃描電鏡(JSM-6360LV)觀察不同處理籽粒中部胚乳細(xì)胞內(nèi)的淀粉粒結(jié)構(gòu)。試驗重復(fù)3次。

1.2.4 水通道蛋白基因的表達(dá)分析

經(jīng)TR1 或TR2 處理后，取劍葉中部的葉片，用RNA 試劑盒(Takara Bio Inc.，Dalian)提取RNA后，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，備用。

利用實時熒光定量PCR 分析液泡膜水通道蛋白基因OsTIP1–1、OsTIP2–1、OsTIP2–2、OsTIP3–1、OsTIP4–1、OsTIP4–2、OsTIP4–3、OsTIP5–1和質(zhì)泡膜水通道蛋白基因OsPIP1–1、OsPIP1–2、OsPIP1–3、OsPIP2–1、OsPIP2–4、OsPIP2–5、OsPIP2–6、OsPIP2–7在處理后相對表達(dá)量的變化。熒光定量PCR 試劑盒為Thermo Scientific DyNAmo ColorFlash SYBR Green qPCR Kit (Thermo)，儀器為Stratagene Mx3005P 熒光定量PCR 儀，反應(yīng)體系及條件參照試劑盒說明書，以水稻Actin基因作為內(nèi)參基因，相應(yīng)水通道蛋白基因定量表達(dá)PCR 引物見表1。

表1 水通道蛋白基因表達(dá)定量PCR檢測引物序列 Table 1 The primers sequences for real time RT-PCR

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 15.0進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫與HgCl2 處理對稻穗和劍葉相對含水量的影響

從圖1-a 可知，花前稻穗相對含水量較高，盛花期稻穗相對含水量較低，TR1 和TR2 處理的相對含水量分別比對照的下降了9.62%和22.25%，差異均達(dá)顯著水平(P＜0.05)。開花當(dāng)天劍葉相對含水量略有下降，其他時間點(diǎn)內(nèi)均保持較高的相對含水量，TR1 和TR2 處理的劍葉相對含水量均低于對照的(圖1-b)。說明高溫脅迫加快了稻穗和劍葉水分的散失；經(jīng)TR2 處理后，稻穗和劍葉的相對含水量更低，說明高溫結(jié)合水通道蛋白抑制劑處理能降低稻穗和劍葉的相對含水量。

圖1 不同處理的稻穗和劍葉相對含水量 Fig.1 The relative water content of different treatments in panicle and flag leaves of rice

2.2 高溫與HgCl2 處理對水稻結(jié)實率和千粒質(zhì)量的影響

從表2 可知，TR1 和TR2 的結(jié)實率均顯著低于CK 的。其中，TR1 的結(jié)實率比對照的下降25.48%，TR2 的結(jié)實率比對照的下降43.63%。TR1 和TR2的千粒質(zhì)量也均顯著低于CK 的，分別比對照的下降了6.36%和9.33%。說明高溫與HgCl2脅迫對結(jié)實率和千粒質(zhì)量均有較大的影響。

表2 不同處理的結(jié)實率和千粒質(zhì)量 Table 2 The seed setting percentage and 1 000 grain weight of rice in different treatments

2.3 高溫與HgCl2 處理對柱頭和花粉粒線粒體活性的影響

從圖2 可知，在適宜溫度下，柱頭與花粉粒均被詹納斯綠B 染成深藍(lán)綠色(圖2-a、圖2-d)，有活性的線粒體集中在代謝活躍的花粉管和柱頭尖端部分，萌發(fā)的花粉管染色遠(yuǎn)比不萌發(fā)的花粉管的染色深。受高溫或高溫與HgCl2復(fù)合處理后，花粉粒與柱頭染色明顯變淺，整個柱頭呈淡紫色(圖2-b、圖2-c)，說明其線粒體的活性明顯降低；落在花柱上的花粉粒數(shù)量和萌發(fā)花粉粒的數(shù)量也明顯減少(圖2-e、圖2-f)，說明高溫或高溫與HgCl2復(fù)合處理后，線粒體活性降低，導(dǎo)致柱頭與花粉粒的活性下降。

圖2 不同處理的水稻柱頭與花粉粒 Fig.2 The rice pollen and stigma of different treatments

2.4 高溫與HgCl2 處理對劍葉液泡膜水通道蛋白基因表達(dá)的影響

從圖3 可知，花期前后4 d 內(nèi)，對劍葉OsTIPs家族中的8 個基因表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)適溫下OsTIP1–1、OsTIP2–2、OsTIP3–1、OsTIP4–1、OsTIP4–3和OsTIP5–1的表達(dá)量均呈先上升后下降的趨勢；OsTIP2–1在花前4 d 不表達(dá)，在花前2 d 才逐漸表達(dá)；OsTIP4–2的表達(dá)量則不斷下降。說明OsTIPs不同基因間的表達(dá)模式不同。受高溫脅迫后，除OsTIP4–3和OsTIP5–1外，其他基因的表達(dá)量從花前2 d 至花后4 d，均顯著低于對照處理的；受高溫與HgCl2復(fù)合處理后，OsTIPs的各基因表達(dá)量下降得更快，說明高溫和HgCl2復(fù)合處理更能抑制OsTIPs的表達(dá)。

圖3 不同處理的劍葉液泡膜水通道蛋白基因的相對表達(dá)量 Fig.3 The expression of OsTIPs of rice flag leaves with different treatments

2.5 高溫與HgCl2 處理對質(zhì)膜水通道蛋白基因表達(dá)的影響

從圖4 可知，適溫下，OsPIP1–1、OsPIP1–2、OsPIP1–3、OsPIP2–1、OsPIP2–4和OsPIP2–6的表達(dá)量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并在開花當(dāng)天達(dá)到最大值。OsPIP2–5在此期間的表達(dá)量不斷增加，OsPIP2–7在開花前后的表達(dá)量較高，開花當(dāng)天的表達(dá)量則較低。經(jīng)高溫處理后，從花前2 d 至花后4 d，各相應(yīng)基因的表達(dá)量均下降；受高溫與HgCl2復(fù)合處理后，相關(guān)基因的表達(dá)量下降更為明顯。說明劍葉質(zhì)膜水通道蛋白基因的表達(dá)受高溫和水通道蛋白抑制劑的影響。

圖4 不同處理的劍葉質(zhì)膜水通道蛋白基因的相對表達(dá)量 Fig.4 The expression of OsPIPs of rice flag leaves of different treatments

2.6 高溫與HgCl2 處理對稻米淀粉粒結(jié)構(gòu)的影響

從圖5 可知，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，適溫下，淀粉粒發(fā)育良好，各淀粉粒之間結(jié)合緊密，胚乳細(xì)胞內(nèi)淀粉粒多邊形晶體結(jié)構(gòu)明顯(圖5–a)；受高溫脅迫后，淀粉粒間出現(xiàn)明顯的空隙(圖5–b)，說明淀粉粒的發(fā)育受到影響；受高溫與HgCl2復(fù)合處理后，淀粉粒變成圓球形，無法形成規(guī)則的晶體結(jié)構(gòu)，各淀粉粒之間不能緊密結(jié)合(圖5–c)，導(dǎo)致充實不良，這可能是導(dǎo)致千粒質(zhì)量降低的原因。

圖5 不同處理的淀粉粒結(jié)構(gòu) Fig.5 The structure of starch granules of different treatments

3 結(jié)論與討論

本研究發(fā)現(xiàn)，開花當(dāng)天OsTIPs和OsPIPs家族中多個基因的表達(dá)量顯著高于花前和花后的，表明開花時這2 個基因家族大量表達(dá)，這與DING 等[16]的研究結(jié)果基本一致。受高溫和HgCl2復(fù)合處理后，劍葉OsTIPs和OsPIPs家族表達(dá)水平均顯著低于對照或高溫處理的，稻穗和劍葉的相對含水量也降低，這可能與水通道蛋白基因表達(dá)及活性降低有關(guān)。如：超表達(dá)水稻質(zhì)膜水通道蛋白OsPIP1–1可顯著提高水稻根系導(dǎo)水能力[10]，超表達(dá)TsPIP1–1及TsTIP1–1，可提高轉(zhuǎn)基因植株的相對含水量[17]；若敲除AtTIP1–1，轉(zhuǎn)基因植株極易受水分脅迫的傷害[18]；可見，OsTIPs和OsPIPs的高表達(dá)與高活性的維持對稻穗和劍葉水分供應(yīng)有著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，高溫與HgCl2復(fù)合處理，導(dǎo)致柱頭上的花粉粒顯著減少，這與張桂蓮等[15]的研究結(jié)果一致。高溫脅迫導(dǎo)致花藥開裂受阻，散落在柱頭上的花粉粒顯著減少，而耐熱的突變體花粉數(shù)量和活性則優(yōu)于熱敏感品種[19]。柱頭上花粉粒減少直接影響最終的結(jié)實率[20]。

本研究結(jié)果表明，高溫或高溫與HgCl2復(fù)合處理后，花粉粒與柱頭的線粒體染色較淺或無法染色，說明高溫與HgCl2脅迫后，可能使柱頭和花粉粒細(xì)胞內(nèi)的線粒體氧化磷酸化過程受到破壞[21]，導(dǎo)致柱頭和花粉?；钚越档蚚22]。研究發(fā)現(xiàn)，HgCl2結(jié)合到水通道蛋白Cys 位點(diǎn)后，通過抑制水通道蛋白活性，降低水分運(yùn)輸速率[23]。散落在柱頭上的花粉粒萌發(fā)后形成花粉管的過程是快速極性生長過程，需要充足的能量和水分供應(yīng)[24-25]，需要高活性的線粒體通過氧化磷酸化提供ATP。當(dāng)ATP 供應(yīng)或水分供應(yīng)不足時，花粉管生長和受精過程受阻。此外，高溫還可能引起光合產(chǎn)物向籽粒運(yùn)輸受阻，從而使結(jié)實率降低，淀粉粒充實不良。這與前人[1,3,26]發(fā)現(xiàn)高溫脅迫導(dǎo)致水稻產(chǎn)量、結(jié)實率和千粒質(zhì)量下降的結(jié)果相一致。但高溫引起的水分脅迫如何影響柱頭和花粉?；钚缘纳頇C(jī)制還需作進(jìn)一步研究。