基于RAD-seq 技術分析北京油雞的遺傳進化

張會永，李國輝，殷建玫，薛 倩，朱云芬，蘇一軍，朱 靜，沈海玉，竇新紅，韓 威

（江蘇省家禽科學研究所，江蘇揚州 225125）

由于各地區(qū)地形地貌、氣候條件和民族文化的不同，中國的地方雞品種表現(xiàn)出不同的表型特征，形成了豐富多彩、種質(zhì)特性各異的禽種資源。地方雞種的遺傳多樣性可為家禽新品種的培育以及現(xiàn)有品種的改良等提供遺傳基礎和支撐[1]，從分子水平對地方雞不同品種間群體遺傳關系和品種內(nèi)群體遺傳變異進行DNA 分析，將對地方雞種種質(zhì)特性評估及研究起到極大的推動作用，對地方雞雞種資源的保種及育種工作具有重要的理論和實際意義。

簡化基因組測序（RAD-seq）技術是在二代測序基礎上發(fā)展起來的一項基于全基因組酶切位點的簡化基因組測序技術，該技術流程簡單，不受有無參考基因組的限制，可大大簡化基因組的復雜性，通過一次測序就可以獲得數(shù)以萬計的多態(tài)性標記[2]。RAD-seq 技術在玉米[3]、棉花[4]、三刺魚[5]、牛[6]、老虎[7]、家蠶[8]、馬[9]等研究中發(fā)揮著重要作用。Zhai 等[10]研究表明RAD-seq 技術在雞上可進行雞品種多態(tài)性圖譜構建和群體遺傳學研究。

北京油雞原產(chǎn)于北京城北側(cè)安定門和德勝門外近郊一帶，2000 年被列入國家級畜禽品種資源保護名錄[11]。2001 年北京油雞被農(nóng)業(yè)部（現(xiàn)為農(nóng)業(yè)農(nóng)村部）列為國家級畜禽品種資源重點保護品種。北京油雞形成于清朝，曾作為清朝御膳用雞，故又名“中華宮廷黃雞”[12]，在長期的選擇和馴化過程中形成了與其他地方雞品種截然不同的的外貌特征，肉味鮮美、蛋質(zhì)優(yōu)良，是我國家禽庫極其寶貴的遺傳資源。本研究利用RAD-seq 技術對北京油雞與其他20 個雞品種進行SNPs 檢測，通過比較找出北京油雞保種群在遺傳進化中的差異基因，鑒定馴化過程中的受選擇基因，為開展北京油雞種質(zhì)特性評價、保種及育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗選擇北京油雞（BY）及對照組18 個地方雞品種和2 個引進品種（白耳黃雞BE、藏雞ZZ、茶花雞CH、仙居雞XJ、固始雞GS、大骨雞DG、邊雞BJ、東鄉(xiāng)綠殼蛋雞DX、惠陽胡須雞HX、金湖烏鳳雞JH、狼山雞LS、蕭山雞XS、瓦灰雞WH、大圍山微型雞WX、文昌雞WC、瓢雞PJ、斗雞DJ、鹿苑雞LY、和隱性白羽肉雞RW、安卡AK）作為研究對象。對上述每個品種按照家系選擇個體間無親緣關系的個體各30 個（10 公、20 母），翅靜脈采血1.5 mL，ACD抗凝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1 RAD-seq 簡化基因組測序 采用常規(guī)酚-氯仿法提取上述血液樣品基因組DNA，并做好標記，采用ddRAD方法構建pair-end 文庫，長度范圍在300～500 bp，并進行簡化基因組測序。

1.2.2 SNP 質(zhì)控 對上述測序結(jié)果利用GATK 和samtools程序進行SNP 的鑒定。質(zhì)控條件：Q20＞95%，ddRAD depth＞60%，SNP Callrate＞70%（在所有雞種群體中的檢出率），Callrate＞90%（在單個雞種中的檢出率），MAF＞0.05。

1.2.3 統(tǒng)計分析 應用Haploview 軟件進行連鎖不平衡（LD）分析，采用Pop Gen 軟件計算觀察雜合度、近交系數(shù)（Fis）和群體遺傳分化系數(shù)，應用MEGA 軟件進行群體聚類分析。采用PLINK 軟件進行選擇信號檢測，以100 kb為窗口、10 kb為step 進行滑動的θπ 比率和Fst 分布計算。

2 結(jié)果

2.1 基因組SNP 鑒定 通過數(shù)據(jù)質(zhì)控，在北京油雞群體中鑒定出SNP 標記295 849 個。由圖1 可知，這些SNP 主要分布在1、2、3、4、5 和Z 染色體上。總體上講，SNP 分布數(shù)量與染色體長度呈正相關。

2.2 群體遺傳多樣性分析 群體遺傳多樣性統(tǒng)計量結(jié)果（表1）表明，北京油雞的觀察雜合度為0.200 4，呈中度雜合度；核苷酸多樣度為0.205 9，呈中度多態(tài)；近交系數(shù)為0.026 5，近交水平在21 個雞種中最低，結(jié)果表明北京油雞在保種過程中得到了較好的保護。

表1 觀察雜合度、核苷酸多樣度和近交系數(shù)

2.3 連鎖不平衡分析 基于SNP 通過pair-wise 算法計算得到的LD 度（r2）來評估LD（連鎖不平衡）的水平，結(jié)果如圖2 所示，LD 隨距離增長逐漸下滑至平緩，SNP 距離為0～50 kb 范圍內(nèi)的LD 水平比在50～300 kb范圍內(nèi)的LD 水平高，但未超r2=0.33 的臨界水平，在總體范圍內(nèi)，北京油雞群體各等位基因不存在強烈的連鎖不平衡現(xiàn)象。

2.4 群體遺傳分化分析 計算北京油雞群體全部檢測到的SNP 位點和其他18 個地方雞種、2 個引進品種的群體遺傳分化系數(shù)，結(jié)果表明：北京油雞群體遺傳分化系數(shù)平均為0.154，較其他群體發(fā)生了顯著分化。MEGA模型聚類分析結(jié)果（圖3）也表明北京油雞形成一個獨立分支。

2.5 選擇信號分析 根據(jù)北京油雞群體核苷酸多樣度比率和群體遺傳分化系數(shù)對群體受到選擇信號進行功能分析，結(jié)果表明受到強烈選擇的前200 個基因主要集中在1、2、3、4、5 染色體上。受選擇基因主要富集在脈管系統(tǒng)、分泌系統(tǒng)、細胞形態(tài)發(fā)生分化、心血管系統(tǒng)、蛋白質(zhì)磷酸化等生物學通路（圖4、5）。

3 討 論

3.1 地方雞種基因組SNP 鑒定 本實驗利用RAD-seq技術測定了19 個地方雞種和2 個國外引進品種的基因組序列，結(jié)果在北京油雞群體中鑒定出SNP 標記259 412 個，打破了微衛(wèi)星標記及線粒體DNA 序列變異遺傳信息覆蓋整個雞基因組范圍極其微小的缺點（微衛(wèi)星標記僅有約30 個，線粒體DNA 的D-loop 區(qū)域全長也僅約1 200 bp）。本實驗檢測到的SNP 位點主要分布在1、2、3、4、5 和Z 染色體上，為遺傳多樣性最為豐富的區(qū)域，這為在基因組水平上分析北京油雞遺傳進化奠定基礎。

3.2 遺傳多樣性和遺傳結(jié)構分析 在19 個地方雞種中，北京油雞的觀察雜合度、核苷酸多樣度處于中下水平，僅高于鹿苑雞、固始雞、邊雞、東鄉(xiāng)綠殼蛋雞、河南斗雞，這說明在特殊的生長背景下，北京油雞在世代繁衍過程中保持了純正的血統(tǒng)。本研究遺傳結(jié)構分析驗證了這一點，即北京油雞在系統(tǒng)分化樹上形成了一個獨立的分支。北京油雞的近交系數(shù)（0.026 5）在19 個地方雞品種中處于最低水平，表明北京油雞種群在保種過程中保種效果較好，保持了遺傳多樣性的相對穩(wěn)定。

3.3 選擇信號分析 我國養(yǎng)雞業(yè)歷史悠久，經(jīng)過長期的自然與人工選擇形成當前豐富的遺傳資源。我國現(xiàn)有地方雞品種114 個，每個地方雞品種都有獨有的遺傳體系。選擇即是對基因的選擇，受到選擇的特征、特性必然會在基因中留下痕跡。本研究分析了北京油雞群體前200個受到強烈選擇的基因，發(fā)現(xiàn)這些基因主要富集于脈管系統(tǒng)、分泌系統(tǒng)、細胞形態(tài)發(fā)生分化、心血管系統(tǒng)、蛋白質(zhì)磷酸化等信號通路。

決定肉味的因素包括肌肉中肌內(nèi)脂肪（IMF）、肌苷酶（IMP）的含量及其香味物質(zhì)，與此相關的基因有ACAA2、PPARG、PLIN2、ATF4、TPK1。劉琛[13]研究發(fā)現(xiàn)ACAA2基因表達量與雞肉IMF 含量呈極顯著正相關。石恒波[14]研究認為，PPARG基因是調(diào)控脂肪酸代謝的核心轉(zhuǎn)錄因子，且不同亞型調(diào)控脂肪代謝的信號通路不同；PPARG基因影響脂滴形成，是脂肪細胞脂肪酸沉積的決定因子。鐘婷婷等[15]在不同H-FABP基因型滇南小耳豬脂滴蛋白相關基因表達差異研究中發(fā)現(xiàn)，PLIN2為一種磷脂蛋白，可促進脂滴的形成，也能保護甘油三酯不被水解。陳超等[16]研究發(fā)現(xiàn)作為堿性亮氨酸拉鏈蛋白家族的ATF4基因在豬脂肪合成與沉積中發(fā)揮重要作用。硫胺素是重要的香味前體物質(zhì)，當受熱時可產(chǎn)生多種含硫和含氮揮發(fā)性香味物質(zhì)。硫胺激酶基酶（TPK1）是體內(nèi)合成代謝的關鍵酶之一，催化硫胺素的磷酸化，對最終硫胺素含量具有重要影響[17]。本研究對北京油雞選擇信號的分析也可作為北京油雞肉質(zhì)鮮美的佐證。

本研究對19 個地方雞品種的受精率統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，北京油雞的受精率高于其他地方雞品種，說明北京油雞的繁殖性狀受到選擇，與精子相關的基因有SPATA4、SYCP3、IFT27。畢瑜林[18]在北京油雞種公雞精液品質(zhì)相關候選基因的SNPs 分析及轉(zhuǎn)錄研究中發(fā)現(xiàn)，SPATA4基因C3422A 位點與精子畸形率、精子密度、精液pH、體重及睪丸重顯著相關，其中AA 基因型是種公雞體重、睪丸重選擇的優(yōu)勢基因型，可以用來輔助篩選高精液品質(zhì)雞群。SYCP3、IFT27在精子的生成過程中起重要作用[19]。這些基因的發(fā)現(xiàn)佐證了北京油雞是一個具備高精液品質(zhì)的品種，這個優(yōu)異的繁殖性狀有助于北京油雞的開發(fā)利用。

此外，選擇信號分析還表明，北京油雞的感官知覺受到了選擇（TRPM3）[20]，聽覺受到了選擇（ATP2B2）[21]。在免疫抗病方面也有不俗的表現(xiàn)，與此相關的受選擇的基因有ATG7、EREG、RPS6，其中，ATG7能正調(diào)控巨自噬[22]和調(diào)控凋亡過程[23]；EREG可以正調(diào)控先天性免疫反應，通過激活ErK/MAPK 和Akt 信號系統(tǒng)刺激纖維母細胞、肝祖細胞等增殖，并在抗炎、創(chuàng)傷修復和肝臟再生中發(fā)揮重要作用[24]；RPS6參與免疫反應T細胞增殖及調(diào)控細胞凋亡[25]。

通過簡化基因組測序技術找出北京油雞在遺傳進化過程中受到選擇的基因，并對這些受到選擇的基因進行功能注釋分析，使得在分子水平上對地方雞品種北京油雞有了進一步的認識，對我國北京油雞保種、評價及其開發(fā)利用有了科學依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究通過RNA-Seq 技術在分子水平上揭示了北京油雞的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構，進一步對其種質(zhì)特性進行挖掘，初步解析了北京油雞優(yōu)異的肉品質(zhì)、精液品質(zhì)等的形成機理，為北京油雞的種質(zhì)特性評價、保種工作及其開發(fā)利用提供了分子理論依據(jù)。