DNA 甲基化影響不同豬種胚胎期肌肉發(fā)育差異的研究進展

李秀金，王金輝，黃運茂，張續(xù)勐*

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動物科技學(xué)院，廣東廣州 510225；2.廣東省水禽健康養(yǎng)殖重點實驗室，廣東廣州 510225）

中國是世界最早飼養(yǎng)豬的國家之一，復(fù)雜遼闊的國土和多年的選育使我國具有豐富的地方豬種資源。中國地方豬種除了適應(yīng)當?shù)貧夂颦h(huán)境外，也兼具優(yōu)良的肉質(zhì)性狀，但普遍存在產(chǎn)肉量較低、生長較慢等問題。《中國畜禽遺傳資源志》（豬志）的數(shù)據(jù)顯示，西方瘦肉型豬瘦肉率在60% 以上，而中國地方豬的瘦肉率則大多在40% 左右。多年來，不同豬種肌肉發(fā)育的差異調(diào)控機制一直是動物遺傳領(lǐng)域的研究熱點。

除基因表達調(diào)控外，表觀修飾也是決定動物性狀的重要調(diào)控機制。表觀修飾是指在細胞核DNA 中核苷酸序列沒有改變的情況下，基因功能可逆、可遺傳的改變，這些改變包括DNA 修飾（如DNA 甲基化修飾）、組蛋白修飾（如組蛋白甲基化、乙酰化）和RNA 干擾等[1]。哺乳動物在胚胎期組織發(fā)育發(fā)生劇烈變化的同時也伴隨著劇烈的表觀修飾變化，而這些表觀修飾的變化和關(guān)鍵基因的表達相互調(diào)控，對胚胎的正常發(fā)育和出生后的性狀具有重要作用[2]。本文結(jié)合研究團隊近年來的研究，介紹了DNA 甲基化對哺乳動物胚胎期肌肉發(fā)育的影響及不同豬種骨骼肌DNA 甲基化的研究進展，并對利用表觀遺傳手段提高中國地方豬種產(chǎn)肉量的方法進行展望。

1 豬骨骼肌發(fā)育的基本過程

豬胚胎期骨骼肌有2 輪發(fā)育過程：①初級肌纖維的形成階段：豬妊娠后第14～22 天經(jīng)歷體節(jié)-軸旁中胚層-生肌節(jié)的發(fā)育過程，初級肌纖維在妊娠后第35 天左右開始形成，并在妊娠第49 天左右達到增殖頂峰，這一過程一直持續(xù)到妊娠第60 天。②次級肌纖維形成階段：大約在豬妊娠第45～90 天，次級肌纖維圍繞初級肌纖維形成并分化發(fā)育，這個過程在妊娠第75 天左右達到頂峰，妊娠第91 天后肌纖維數(shù)目幾乎不再改變[3-5]。這一現(xiàn)象同樣出現(xiàn)在牛、雞等動物中，即肌纖維總數(shù)在胚胎期或孵化時（雞）就已經(jīng)確定（圖1）[6]。肌纖維在出生后主要進行成熟過程，該過程主要涉及到肌纖維肥大及類型的變化[7]。因此，豬胚胎期骨骼肌的2 輪發(fā)育直接決定了肌纖維形成總數(shù)，進而對出生后產(chǎn)肉性狀尤其是瘦肉量起著決定性作用。

2 DNA 甲基化對胚胎早期骨骼肌發(fā)育的影響

在英國科學(xué)家沃丁頓提出的表觀遺傳模型中，將細胞的命運決定過程比喻成一個球體從山頂向下滑落的過程，山體不同地形決定了球體的走向，而這個地形就是表觀修飾。球體從山頂?shù)缴较?，從多能性到特異細胞類型，?jīng)歷了多重表觀修飾以及基因表達的相互調(diào)控所觸發(fā)的時間、空間的精密調(diào)控過程，確保胚胎在合適的時間和地點，形成正確的特異性分化的細胞群體，進而形成不同組織（圖2）[8]。

在脊椎動物中，DNA 甲基化主要出現(xiàn)在CpG 二分體的C 位點，它受到DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）家族的催化。在這個家族當中，DNMT1 主要的功能是在復(fù)制過程中保持DNA 甲基化狀態(tài)。而與此相反，DNMT3A 和DNMT2B 則是從頭甲基化酶，用來進行基因組甲基化特征的構(gòu)建。這3 個酶都是發(fā)育過程中重要的調(diào)控因子，它們中任何一個缺失都會導(dǎo)致小鼠胚胎致死或者出生后不久死亡[9]。近年來，一些激活DNA 去甲基化過程的機制也被報道，包括移除甲基化的堿基或者通過DNA 修復(fù)后的脫氨基或者氧化作用。TET 家族是指能夠酶催化甲基化的C（mC）氧化成羥甲基化的C（hmC），最后變成甲?；汪然腃 的蛋白家族，進一步支持了DNA 去甲基化過程中DNA 修復(fù)的作用[10]。

DNA 甲基化的重編程在人和小鼠的胚胎發(fā)育過程中均有報道[11]。受精后，大多數(shù)DNA 甲基化印跡被擦除，而著床后DNA 甲基化會迅速上升[12]。著床后獲得甲基化的基因主要參與了胚胎早期發(fā)育的生物學(xué)過程，而著床后失去甲基化的基因則主要參與了組織特異分化的生物學(xué)過程中（圖3）[2]。前期對豬原始生殖細胞的DNA甲基化研究中發(fā)現(xiàn)，與人、小鼠類似，豬原始生殖細胞的DNA 甲基化水平也出現(xiàn)了顯著變化：在妊娠15 d 著床前后，出現(xiàn)了劇烈的DNA 甲基化下降的現(xiàn)象，在妊娠20 d 達到最低點，此后開始上升[13]。

增強子能增加其連鎖基因的轉(zhuǎn)錄頻率，也是重要的表觀修飾形式之一。有研究顯示，MyoD啟動子上游20 kb 的核心增強子對MyoD在小鼠胚胎合適的時空表達起到了關(guān)鍵作用[14]。在小鼠胚胎中敲除這段增強子將會導(dǎo)致MyoD的表達晚1～2 d，進而引起成肌進程延遲1～2 d[15]。在小鼠胚胎和成肌細胞系中，MyoD的核心增強子是幾乎完全去甲基化的，而在非肌肉細胞系和非肌肉組織中，增強子的甲基化程度則處于較高的狀態(tài)（圖4）[16]。

3 不同豬種骨骼肌發(fā)育的DNA 甲基化

目前已有多種檢測分析基因組層面DNA 甲基化的測序方法，例如全基因組甲基化測序（WGBS）、還原亞硫酸氫鹽測序（RRBS）[17-18]、甲基化DNA 免疫沉淀測序（MeDIP-seq）[19]、甲基結(jié)合域測序（MBD-seq，MethylCap-seq）[20-21]和BeadChip array[22]等。然而，RRBS 在MspI 酶切和片段大小選擇的過程中減少可研究的基因組比例，其在組織樣品中的分析效率較低，并且需要較深的測序深度[23]。MeDIP-seq 則受限于需要基于前人的研究來設(shè)計探針，并且不能掃描甲基化程度較低的區(qū)域和重復(fù)區(qū)域[24]。將DNA 通過重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)換后再進行高通量測序可使DNA 甲基化的檢測精確到單堿基水平，該方法近年來已成為甲基化研究的最佳方法之一?？偟膩碚f，利用WGBS 法研究DNA 甲基化最準確、分辨率最高。

最近幾年，已有科學(xué)家利用不同方法對不同品種豬不同組織的甲基化情況進行了研究。Li 等[25]利用MeDIP-seq 法研究了3 個品種豬不同部位的脂肪和骨骼肌，發(fā)現(xiàn)品種間、性別間和解剖學(xué)位置間存在DNA甲基化的相似性和特異性，并且鑒定了差異甲基化區(qū)域。使用熒光標記甲基化敏感擴增基因多態(tài)性方法（F-MSAP）對成年豬肌肉、心臟、肝臟、腎、肺和胃DNA 甲基化進行的研究發(fā)現(xiàn)，不同組織間DNA 甲基化的變化與組織發(fā)育過程中特定基因的表達有關(guān)[26]。在利用MeDIP-seq 法對瘦肉型、脂肪型、小型豬DNA 甲基化和轉(zhuǎn)錄組進行聯(lián)合分析的研究中，Wu 等[27]研究發(fā)現(xiàn)DNA 甲基化可能通過調(diào)控骨骼肌中基因的表達影響豬肥胖和體型大小的趨勢。導(dǎo)致產(chǎn)肉量不同的豬種胚胎早期肌肉發(fā)育差異的調(diào)控機制目前依然不明晰。由于胚胎著床后的早期胚胎發(fā)育時期對于組織分化過程十分關(guān)鍵，且經(jīng)歷了劇烈的DNA 甲基化變化，因此關(guān)注于這一時期的DNA 甲基化研究有望揭示導(dǎo)致產(chǎn)肉量不同的豬種肌肉發(fā)育和基因表達模式差異的原因。

作者所在團隊通過對五指山和長白豬的DNA 甲基化和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的整合分析證實了DNA 去甲基化酶Tet1在分離的豬胚胎成肌細胞和C2C12 細胞中通過Myogenin啟動子去甲基化，上調(diào)Myogenin表達，從而促進成肌細胞的分化。該研究揭示了產(chǎn)肉量差異豬種的胚胎期肌肉發(fā)育的調(diào)控機制：因為五指山豬成肌基因較長白豬早去甲基化（胚胎18～21 d，五指山豬成肌基因甲基化程度從70%下降到42%，長白豬成肌基因甲基化從70% 下降到56%），成肌基因早表達導(dǎo)致成肌細胞較長白豬早進入分化過程。由于成肌細胞沒有足夠時間進行增殖，導(dǎo)致胚胎期初級肌纖維和肌纖維總數(shù)較少，因此五指山豬出生后的產(chǎn)肉量也較少（圖5）[28-30]。

4 對于不同豬種胚胎期骨骼肌WGBS 研究的思考

作者所在團隊對于不同豬種胚胎期肌肉發(fā)育的WGBS 研究有2 個新的發(fā)現(xiàn)：一個是在所研究的胚胎18、21、28 d，長白豬基因總體的DNA 甲基化水平均高于五指山豬（在胚胎期18～28 d，長白豬DNA 甲基化范圍為72%～77%，五指山豬DNA 甲基化范圍為69%～73.5%）[28]。前人在豬與小鼠、二花臉與大白豬的DNA 甲基化比較研究中，發(fā)現(xiàn)物種、品種特異的DNA甲基化模式[31-32]。 因此，推測存在這一現(xiàn)象的原因是長白豬具有品種特異性甲基化模式。另一個發(fā)現(xiàn)是長白豬和五指山豬2 個豬種中DNA 甲基化水平并不總和基因表達相一致。DNA 甲基化已經(jīng)被證實在很多物種和細胞類型中影響基因表達[33-34]。本團隊的研究發(fā)現(xiàn)，只有在轉(zhuǎn)錄起始位點（±0.2 kb）附近，基因表達和DNA 甲基化呈負相關(guān)關(guān)系，而在基因區(qū)，基因表達和DNA 甲基化則呈正相關(guān)關(guān)系[28]。這一發(fā)現(xiàn)也與之前在人類和牛中的發(fā)現(xiàn)一致[35-36]。

在本團隊的研究中，五指山豬成肌基因DNA 甲基化降低并且上調(diào)表達的進程較長白豬早[28]，其中包含了重要的成肌細胞分化條件因子Myogenin，成肌細胞分化標志基因Myh1以及決定成肌命運分化的H3f3a[37]，而后者也是作者所在團隊的蛋白組學(xué)研究中五指山與長白豬胚胎骨骼肌表達差異最大的蛋白[38]。哺乳動物的發(fā)育伴隨著特異的從頭開始的甲基化或去甲基化事件，這些事件被認為有利于細胞分化進程[39]。之前的研究也發(fā)現(xiàn)，在胚胎發(fā)育階段，保持干性的基因獲得甲基化，而組織分化特異的基因逐漸失去甲基化[2]。因此，本團隊研究進一步證實了成肌基因轉(zhuǎn)錄起始位點附近較早的DNA 去甲基化，以及成肌基因基因區(qū)較早較高的甲基化可能會觸發(fā)五指山豬成肌基因早于長白豬表達，導(dǎo)致成肌分化進程較早開啟，這也與本團隊研究發(fā)現(xiàn)的五指山豬出現(xiàn)肌纖維分化較早的現(xiàn)象相符[38]。

除了骨骼肌，其他的組織器官在小型豬中均小于長白豬，它們的發(fā)育差異可能具有相似的調(diào)控機制，尤其是在DNA 甲基化層面。然而作為肉用型動物，關(guān)于不同品種豬之間差異的研究主要涉及肌肉的主要性狀差異[30,35,40]，其他組織則鮮見報道。兩品種豬的總?cè)焉锲诙际?14 d 左右，然而五指山豬卻較早出現(xiàn)初級肌纖維[38]。差異的基因表達模式是導(dǎo)致這一現(xiàn)象的最重要原因，加之DNA 甲基化在細胞命運決定和胚胎期基因表達起始過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[41]。因此，本團隊的研究通過WGBS 發(fā)現(xiàn)五指山豬具有較早的成肌基因去甲基化進程，體外實驗也進一步證實了成肌基因較早的去甲基化會導(dǎo)致成肌細胞較早分化[28]。而這個表觀遺傳介導(dǎo)的胚胎肌肉發(fā)育模式是否適用于其他組織的發(fā)育仍需進一步研究。

5 豬胚胎期肌肉發(fā)育的DNA 甲基化研究展望

豬的肌纖維總數(shù)在出生前就已經(jīng)決定，而無論是中國地方豬種還是西方瘦肉型豬種，它們的胚胎期均為114 d 左右，因此相似胚胎時期內(nèi)的肌肉發(fā)育進程的差異很可能導(dǎo)致了不同豬種出生后產(chǎn)肉量的差異。除了基因表達調(diào)控以外，表觀遺傳學(xué)也是決定生物性狀重要的調(diào)控機制。隨著轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、全基因組甲基化等測序技術(shù)的發(fā)展，通過在胚胎早期肌肉發(fā)育階段探究不同豬種差異的DNA 甲基化模式，可以溯源并篩選出導(dǎo)致不同豬種胚胎期成肌關(guān)鍵基因差異表達模式背后的原因，例如作者所在團隊發(fā)現(xiàn)的DNA 去甲基化酶Tet1的差異表達。利用近年來不斷發(fā)展的基因編輯手段（如CRISPR-Cas9 技術(shù)），構(gòu)建可誘導(dǎo)基因表達的基因編輯豬品系（如Cre-loxP基因敲入豬），在懷孕母豬胚胎期控制候選基因（如Tet1）的表達時間，從而改變胚胎早期DNA 甲基化修飾模式和成肌關(guān)鍵基因的表達時間，將為提高中國地方豬種產(chǎn)肉量提供新的方向。