好氧反硝化菌Achromobacter sp.L16的脫氮特性

李思琦 楊靜丹 劉琳 劉二佳 王曉慧

（1. 北京化工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，北京 100029；2. 北京航天宏圖信息技術(shù)股份有限公司，北京 100195）

異養(yǎng)硝化-好氧反硝化（Heterotrophic nitrification-aerobic denitrification，HN-AD）菌是一類能夠在有機(jī)物存在的條件下將氨氮氧化，在溶解氧存在條件下將亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮代謝為氮?dú)獾奈⑸铮?］，不受傳統(tǒng)反硝化菌厭氧條件的控制，在單個(gè)反應(yīng)器中同時(shí)進(jìn)行硝化和反硝化，且異養(yǎng)菌與自養(yǎng)菌相比生長(zhǎng)速率快，繁殖周期短，節(jié)約工藝處理時(shí)間及成本，好氧反硝化菌的發(fā)現(xiàn)為生物脫氮技術(shù)提供了一種新的思路和方法［2］。

長(zhǎng)期以來(lái)厭養(yǎng)反硝化菌被認(rèn)為是唯一能夠進(jìn)行反硝化作用的細(xì)菌。1980年，Meiberg等［3］在研究HyphomicrobiumX菌對(duì)二甲胺的好氧厭氧降解機(jī)理過(guò)程中發(fā)現(xiàn)其具有好氧反硝化能力，1983年Robertson等［4］在硫自養(yǎng)反硝化菌株分離實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了好氧反硝化菌的存在，隨后證實(shí)泛養(yǎng)硫球菌是一種好氧反硝化菌，打破了傳統(tǒng)厭氧反硝化的壁壘。目前從環(huán)境中分離出來(lái)的好氧反硝化菌主要有假單胞菌屬（Pseudomonas）［5-6］、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）［7］、芽孢桿菌屬（Bacillus）［8-9］、糞產(chǎn)堿菌（Alcaligenes faecalis）［10］、硫桿菌屬（Thiobacillus）等［11］。

本研究從河北某垃圾處理廠的垃圾滲濾液中提取出一株好氧反硝化菌L16，對(duì)其進(jìn)行16S rDNA分析鑒定為無(wú)色桿菌，填補(bǔ)了垃圾滲濾液中好氧反硝化細(xì)菌較少的空缺，系統(tǒng)地研究了碳源、C/N、溫度、轉(zhuǎn)速等理化因素對(duì)該菌株反硝化和硝化能力的影響，以期為該菌株在滲濾液脫氮處理等應(yīng)用方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

菌源提取自河北某垃圾填埋場(chǎng)的垃圾滲濾液，樣品置于采樣瓶中4℃保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

LB富集培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨1.0 g，酵母提取物0.5 g，硝酸鉀KNO32.0 g。

BTB溴百里酚藍(lán)固體培養(yǎng)基（g/L）：KNO31.0 g，琥珀酸鈉 8.5 g，KH2PO41.0 g，F(xiàn)eCl2·6H2O 0.05 g，CaCl20.2 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，1%的溴百里酚藍(lán)1 mL，瓊脂20.0 g。

NI異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基（g/L）：NH4Cl 1.5 g，琥珀酸鈉 11 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，Na2HPO4·12H2O 6.7 g，KH2PO41.0 g，微量元素溶液2 mL。

DM好氧反硝化培養(yǎng)基（g/L）：KNO33.0 g，琥珀 酸 鈉 13 g，KH2PO41.5 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，Na2HPO4·12H2O 7.9 g，微量元素溶液2 mL。

微量元素溶液（g/L）：EDTA 50.0 g，ZnSO42.2 g，CaCl25.5 g，MnCl2·4H2O 2.06 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 5.0 g，（NH4）6Mo7O2·7H2O 1.1 g，CuSO4·5H2O 1.57 g，CoCl2·6H2O 1.61 g。

培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH為7.0-7.3，在121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株篩選 取垃圾滲濾液10 mL按10%（V/V）接種在LB培養(yǎng)基中，30℃，150 r/min條件培養(yǎng)，24 h后取10 mL重新接種至新鮮LB培養(yǎng)基，連續(xù)富集培養(yǎng)5次，用格利斯試劑定性檢測(cè)硝酸鹽是否轉(zhuǎn)化為亞硝氮，培養(yǎng)基變紅，垃圾滲濾液中的菌群有反硝化活性。

富集菌液按倍比稀釋，取10-6和10-7濃度菌液涂布在BTB培養(yǎng)基，30℃恒溫培養(yǎng)3 d。反硝化細(xì)菌消耗硝酸鉀產(chǎn)生堿度，使溴百里酚藍(lán)變藍(lán)，挑取藍(lán)色單菌落在BTB培養(yǎng)基上多次劃線培養(yǎng)純化作為初篩菌株。

挑取初篩純菌株接種于LB培養(yǎng)基，30℃，150r/min條件下富集24 h，4 000 r/min離心3 min，棄去上清液加入無(wú)菌水制備菌懸液。將菌懸液以2%（V/V）接種至DM和NI培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d，復(fù)篩出降解硝氮、氨氮能力最強(qiáng)的菌株，命名為L(zhǎng)16。富集培養(yǎng)保存在甘油管中，在-20℃冰箱里暫存。所有操作在無(wú)菌臺(tái)上進(jìn)行，培養(yǎng)基及其他儀器事先滅菌。

1.2.2 菌株鑒定 將菌株L16富集培養(yǎng)制備菌懸液，在BTB培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)24 h，挑取單菌落通過(guò)掃描電子顯微鏡（JSM-7500F型）觀察菌體形態(tài)。

將菌株L16富集培養(yǎng)制備菌懸液，在BTB培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，通過(guò)16S rDNA分析鑒定。過(guò)程為：利用DNA提取試劑盒提取，用DNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物（27F）5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，下游引物（1429R）5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，PCR體系：10×Ex Taq緩沖液5.0μL，2.5 mmol/L dNTP 混合物 4.0 μL，10 pmol/L 引物各 1.0 μL，模板 2.0 μL，5 U/μL Taq DNA 聚合酶 0.5 μL，無(wú)菌水 36.5 μL，共 50 μL，擴(kuò)增程序 ：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸90 s，經(jīng)過(guò)30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保溫。將PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)條帶單一、大小正確后，經(jīng)切膠回收克隆后測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在EZbiocloud網(wǎng)站上進(jìn)行同源性比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 菌株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化性能研究 將菌株L16富集制備菌懸液以2%（V/V）分別接種至100 mL DM、NI培養(yǎng)基，測(cè)定其好氧反硝化和異養(yǎng)硝化能力，控制單一變量，分別在不同碳源（乙酸鈉、葡萄糖、甘油、檸檬酸鈉和琥珀酸鈉），不同碳氮比（0、5、10、15、20和25），不同溫度（20、30和37℃），不同轉(zhuǎn)速（50、100、150和200 r/min）下，30℃，150 r/min培養(yǎng)48 h（溫度、轉(zhuǎn)速實(shí)驗(yàn)除外），每隔12 h檢測(cè)菌株生長(zhǎng)量，每隔6 h檢測(cè)DM培養(yǎng)基中硝氮、亞硝氮濃度和NI培養(yǎng)基中氨氮濃度，并測(cè)量總氮濃度變化。

1.2.4 測(cè)定方法 生長(zhǎng)量（OD600）采用分光光度法（GB/T 26810-2011），氨氮采用納氏試劑分光光度法（GB HJ535-2009），硝氮采用麝香草酚法分光光度法（GB HJ/T346-2007），亞硝氮采用N-（1-萘基）-乙二胺光度法（GB 7493-87），總氮采用堿性過(guò)硫酸鉀消解紫外分光光度法（GB HJ636-2012）。

氨氮去除率：

硝氮、亞硝氮、總氮去除率計(jì)算公式同上。

2 結(jié)果

2.1 菌株形態(tài)特征

L16菌落培養(yǎng)及掃描電鏡圖如圖1，菌落呈圓形，邊緣整齊，表面光滑，呈乳白色，透明，菌體大小約1.6 μm×0.18 μm。

圖1 菌株L16的形態(tài)特征

2.2 16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)菌株L16測(cè)序得到1 420 bp長(zhǎng)度的16S rDNA基因序列，在EZbiocloud網(wǎng)站上進(jìn)行同源性比對(duì)，菌 株 L16與Achromobacter insuavis、Achromobacter ruhlandii、Achromobacter xylosoxidans、Alcaligenes faecalis、Achromobacter denitrificans及Achromobacter piechaudii相似性均在99%以上，初步確定菌株L16為無(wú)色桿菌（Achromobactersp.）通過(guò)MEGA 7.0軟件，以Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2，菌株L16與Achromobacter insuavisLMG26845具有99.7%同源性。目前分離出多種異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌，無(wú)色桿菌較少，本研究分離的無(wú)色桿菌L16豐富了異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細(xì)菌的多樣性，也表明無(wú)色桿菌在脫氮領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

2.3 菌株脫氮特性

2.3.1 好氧反硝化特性 菌株L16的生長(zhǎng)曲線如圖3-A，前12 h濁度由0.030增長(zhǎng)到0.072，硝氮由569.2 mg/L降至550.0 mg/L，均無(wú)明顯變化，此階段為菌體的適應(yīng)期。從12-36 h培養(yǎng)基細(xì)胞生物量迅速增加，細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，硝氮含量降至8.996 mg/L，亞硝氮含量增加到244.5 mg/L，說(shuō)明菌株L16的好氧反硝化過(guò)程是消耗硝氮產(chǎn)生亞氮進(jìn)而轉(zhuǎn)化為氮?dú)饣蜃陨砩锪糠e累，此過(guò)程硝氮去除率達(dá)98.40%，菌株對(duì)硝氮的去除主要發(fā)生在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，反硝化效果性能突出。36 h后培養(yǎng)基各物質(zhì)含量變化不大，濁度基本穩(wěn)定，且有減小的趨勢(shì)，細(xì)菌在36 h后處于穩(wěn)定期并逐漸進(jìn)入衰減期。

2.3.2 異養(yǎng)硝化特性 菌株L16的生長(zhǎng)曲線與DM培養(yǎng)基中相似，前12 h濁度由0.015增至0.018，氨氮由314.6 mg/L降至285.6 mg/L，去除率9.22%，為細(xì)菌的適應(yīng)期。從12 h-36 h培養(yǎng)基濁度迅速增加，氨氮濃度降至110.6 mg/L，去除率61.5%，此時(shí)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此后進(jìn)入穩(wěn)定期并逐漸進(jìn)入衰減期（圖3-B）。菌株L16是兼具異養(yǎng)硝化-好氧反硝化能力的菌株，其好氧反硝化能力更強(qiáng)。

2.4 環(huán)境因素對(duì)菌株L16好氧反硝化性能的影響

2.4.1 碳源對(duì)菌株L16好氧反硝化能力的影響 碳源對(duì)菌株L16好氧反硝化能力的影響如圖4-A，菌株L16以乙酸鈉、檸檬酸鈉、琥珀酸鈉為唯一碳源時(shí)，硝氮基本完全去除，去除率分別為99.61%、99.15%和99.74%，總氮去除率分別為28.79%、38.85%和29.00%，培養(yǎng)基初始時(shí)總氮包括培養(yǎng)基的硝氮和細(xì)菌胞內(nèi)氮，48 h后硝氮一部分轉(zhuǎn)化為亞硝氮，一部分直接轉(zhuǎn)化為N2排出，其余部分轉(zhuǎn)化為細(xì)菌胞內(nèi)氮，其48 h后總氮含量變化近似于轉(zhuǎn)化為N2部分的氮損失。

圖2 菌株L16系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 菌株L16異養(yǎng)硝化-好氧反硝化特性

以甘油為唯一碳源時(shí)生長(zhǎng)效果最好，對(duì)硝氮去除率僅10.16%，總氮的去除率6.72%，說(shuō)明菌株能夠利用甘油生長(zhǎng)但沒有好氧反硝化能力，可能是因?yàn)樘荚礊槲⑸锷L(zhǎng)提供所需的能量和好氧反硝化過(guò)程中的電子供體，碳源不同，細(xì)菌生長(zhǎng)速率不同，硝酸鹽的還原和中間產(chǎn)物的積累程度也不同，對(duì)反硝化速率影響很大。本研究中無(wú)色桿菌L16在不同碳源的培養(yǎng)基中脫氮效果由高向低依次為檸檬酸鈉、琥珀酸鈉、乙酸鈉、葡萄糖、甘油，檸檬酸鈉培養(yǎng)基中硝氮去除率高，其總氮去除率最高，亞硝氮積累量為296.5 mg/L，剩余部分氮轉(zhuǎn)化為細(xì)胞生物量，菌株L16以檸檬酸鈉為碳源時(shí)好氧反硝化能力最好。

2.4.2 C/N對(duì)菌株L16好氧反硝化能力的影響 碳氮比對(duì)菌株L16好氧反硝化能力的影響如圖4-B，固定DM培養(yǎng)基氮源含量，使用2.4.1中好氧反硝化能力最好的檸檬酸鈉為碳源，改變檸檬酸鈉含量以改變碳氮比。在碳氮比達(dá)到10以上后，對(duì)硝氮的去除能力基本穩(wěn)定，均在97%以上，在碳氮比為20、25時(shí)總氮去除率最高分別為58.90%、56.79%，且亞硝氮積累量也相較于碳氮比為15時(shí)有所降低。

在碳氮比為15時(shí)OD600達(dá)3.304，菌株生長(zhǎng)最好，亞硝氮在碳氮比為15條件下積累量最高，菌株L16在碳氮比為0、5時(shí)基本不生長(zhǎng)，說(shuō)明菌株L16生長(zhǎng)過(guò)程需要外加碳源，是異養(yǎng)的反硝化菌。碳氮比對(duì)菌株生長(zhǎng)情況有顯著影響，低的反硝化能力可能是碳源不足菌體生長(zhǎng)不良導(dǎo)致。本研究中碳氮比為20的培養(yǎng)基中總氮去除率最高，硝氮去除率為97.12%，亞硝氮積累量為231.6 mg/L，在碳氮比為20時(shí)L16的反硝化能力最好。

2.4.3 溫度對(duì)菌株L16好氧反硝化能力的影響 溫度對(duì)菌株L16好氧反硝化能力的影響如圖4-C，在以檸檬酸鈉為碳源，碳氮比為20的DM培養(yǎng)基中實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)溫度為30、37℃的菌株基本將硝態(tài)氮降解完全，去除率分別為97.56%、96.97%，30℃下的菌株生長(zhǎng)及總氮去除能力都比37℃時(shí)要好，可能是高溫導(dǎo)致生物核酸或蛋白的變性，細(xì)胞功能下降，影響脫氮效果。

菌株在3個(gè)培養(yǎng)溫度下均能正常生長(zhǎng)，30、37℃時(shí)OD600達(dá)到2.772和2.562，而20℃時(shí)為1.512，在20℃生長(zhǎng)情況較其他溫度稍差，且基本不降解硝態(tài)氮，同時(shí)也沒有亞硝態(tài)氮的產(chǎn)生，說(shuō)明低溫對(duì)于菌株L16的生長(zhǎng)和好氧反硝化有明顯的抑制作用，可能是低溫抑制了酶活性，影響其脫氮效果。30℃條件下總氮去除率為43.87%，亞硝氮積累223.0mg/L，對(duì)菌株L16好氧反硝化能力較好的培養(yǎng)溫度應(yīng)在30℃左右。

2.4.4 溶解氧對(duì)菌株L16好氧反硝化能力的影響 溶解氧對(duì)菌株L16好氧反硝化能力的影響如圖4-D，調(diào)整培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)速來(lái)改變?nèi)芙庋鯘舛龋瑘D中表明溶解氧含量越高，細(xì)菌生長(zhǎng)狀況越好，驗(yàn)證了菌株L16為好氧菌。各培養(yǎng)基對(duì)于硝態(tài)氮的去除趨勢(shì)一致，且去除效果基本相同，將氮轉(zhuǎn)化為氣體的能力與溶解氧含量成正比，最后硝態(tài)氮都穩(wěn)定在10 mg/L以下，去除率分別為97.79%、97.30%、99.83%和98.15%，在培養(yǎng)后期均有降解亞硝酸鹽的能力，菌株L16在150 r/min下脫氮效果最好，可能是因?yàn)镠N-AD 菌株在好氧條件下進(jìn)行反硝化，但亞硝酸鹽還原過(guò)程對(duì)氧極其敏感，高濃度溶解氧會(huì)抑制亞硝酸鹽的還原，低濃度溶解氧又抑制異養(yǎng)菌株的生長(zhǎng)，過(guò)高過(guò)低的溶解氧量都會(huì)影響菌株的脫氮能力。其中150 r/min轉(zhuǎn)速的培養(yǎng)基積累亞硝態(tài)氮含量少，且硝態(tài)氮去除能力最強(qiáng)，亞硝氮積累量為245.5 mg/L，總氮去除率48.44%，菌株L16最適的轉(zhuǎn)速在150 r/min左右。

2.5 環(huán)境因素對(duì)菌株L16異養(yǎng)硝化性能的影響

2.5.1 碳源對(duì)菌株L16異養(yǎng)硝化能力的影響 碳源對(duì)菌株L16異養(yǎng)硝化能力的影響如圖5-A，菌株L16以氨氮為氮源，以檸檬酸鈉為碳源時(shí)對(duì)氨氮和總氮去除率最高，這與前面好氧反硝化性能影響實(shí)驗(yàn)一致，可能是由于檸檬酸鈉參與細(xì)胞三羧酸循環(huán)，能夠更加有效的被菌體利用。

以葡萄糖為碳源的菌株生長(zhǎng)最好，但以甘油和葡萄糖為碳源的菌株去除氨氮的能力較差，以乙酸鈉、檸檬酸鈉、琥珀酸鈉為碳源的培養(yǎng)基中后期氨氮穩(wěn)定在35 mg/L以下，對(duì)氨氮的去除率分別為62.33%、67.90%和62.02%，菌株L16在不同碳源的培養(yǎng)基中脫氮效果由高向低依次為檸檬酸鈉、乙酸鈉、琥珀酸鈉、葡萄糖和甘油，在以檸檬酸鈉為碳源的培養(yǎng)基中對(duì)氨氮去除率最高，總氮去除率為54.72%，菌株L16以檸檬酸鈉為碳源時(shí)異養(yǎng)硝化能力最好。

2.5.2 C/N對(duì)菌株L16異養(yǎng)硝化能力的影響 C/N對(duì)菌株L16異養(yǎng)硝化能力的影響如圖5-B，培養(yǎng)基以檸檬酸鈉為碳源，隨碳氮比的增加，菌株生長(zhǎng)情況越好，且對(duì)氨氮和總氮去除率也逐漸升高，說(shuō)明碳氮比能夠顯著影響菌株的生長(zhǎng)情況及其異養(yǎng)硝化能力。

菌株L16在C/N為0、5時(shí)基本不生長(zhǎng)，氨氮去除能力也低，可能是碳氮比小時(shí)碳源不充分，細(xì)菌生長(zhǎng)受限制，異養(yǎng)硝化能力受影響。48 h后，碳氮比為15、20和25的培養(yǎng)基中氨氮的去除效果分別為95.79%、96.31%和97.51%，在C/N為25時(shí)OD600達(dá)1.477，菌株生長(zhǎng)最好，且總氮去除率也最高為90.58%，考慮到實(shí)際應(yīng)用中高碳氮比投加碳源的成本以及可能造成水體化學(xué)需氧量的升高，可以取碳氮比為20作為菌株L16異養(yǎng)硝化能力的碳氮比，其總氮去除率也可達(dá)到86.79%。

2.5.3 溫度對(duì)菌株L16異養(yǎng)硝化能力的影響 溫度對(duì)菌株L16異養(yǎng)硝化能力的影響如圖5-C，取檸檬酸鈉為碳源，碳氮比為20，菌株在3個(gè)培養(yǎng)溫度下均能正常生長(zhǎng)，且20℃下生長(zhǎng)情況最好，3種溫度下氨氮去除率分別為95.56%、97.19%和96.87%，低溫對(duì)于菌株L16的硝化作用基本沒有影響，其異養(yǎng)硝化作用受溫度影響小，其中培養(yǎng)溫度為30℃時(shí)的氨氮去除率最大，總氮去除率最高為78.24%，對(duì)菌株L16異養(yǎng)硝化能力較好的培養(yǎng)溫度可以在20-37℃左右。

2.5.4 轉(zhuǎn)速對(duì)菌株L16異養(yǎng)硝化能力的影響 轉(zhuǎn)速對(duì)菌株L16異養(yǎng)硝化能力的影響如圖5-D，各培養(yǎng)基對(duì)于氨氮去除效果基本相同，去除率分別為90.87%、83.23%、89.87%和93.41%，轉(zhuǎn)速對(duì)菌株L16的硝化作用沒有太大影響，異養(yǎng)硝化能力最好的是轉(zhuǎn)速200 r/min的培養(yǎng)基，總氮去除率為87.50%；其次是轉(zhuǎn)速為50 r/min的培養(yǎng)基，總氮去除率為86.33%，菌株L16的異養(yǎng)硝化能力對(duì)溶解氧的要求不高，菌株L16異養(yǎng)硝化能力較好的轉(zhuǎn)速可以在50-200 r/min左右。

圖4 環(huán)境因素對(duì)菌株L16好氧反硝化能力的影響

2.6 菌株L16好氧反硝化-異養(yǎng)硝化性能的優(yōu)化

以單因素實(shí)驗(yàn)中脫氮能力最強(qiáng)的環(huán)境因子作為實(shí)驗(yàn)條件，即以硝酸鹽為氮源、檸檬酸鈉為碳源、C/N為20、培養(yǎng)溫度為30℃、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為150 r/min條件下培養(yǎng)48 h，優(yōu)化環(huán)境因素影響后L16對(duì)硝酸鹽去除率99.74%，總氮去除率為58.90%。

L16在以氨氮為氮源、檸檬酸鈉為碳源、C/N為20、培養(yǎng)溫度為30℃、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為200 r/min條件下氨氮去除率提高到93.41%，總氮去除率86.33%（圖 6）。

3 討論

在探究環(huán)境因素對(duì)菌株L16的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化性能的影響實(shí)驗(yàn)中，L16在碳源為檸檬酸鈉的培養(yǎng)基中脫氮效果最好，這與Enterobacter asburiaeYT［12］和Acinetobactersp. T1［13］結(jié)果一致，其他研究也有以丁二酸鈉［14］、琥珀酸鈉［15］、葡萄糖［16］為唯一碳源時(shí)效果最好，說(shuō)明碳源為微生物生長(zhǎng)提供所需的能量和好氧反硝化過(guò)程中的電子供體，對(duì)微生物的生長(zhǎng)和脫氮能力影響很大。L16在碳氮比為20的培養(yǎng)基中脫氮效果最好，低于田雪雪等［17］分離的醋酸鈣不動(dòng)桿菌N7，與克雷伯氏菌y5［1］和y6［18］結(jié)果相似，目前有些研究中分離在低碳氮比（5-10）下進(jìn)行好氧反硝化的菌株［19-24］，有效解決生物法處理低C/N比廢水存在碳源不足、脫氮效率不高的問題。L16在 30℃下培養(yǎng)脫氮效果最好，在大部分好氧反硝化菌生長(zhǎng)最適溫度范圍內(nèi)［8，25-29］，也有學(xué)者在從低溫環(huán)境下提取出嗜冷菌株［30-34］，能耐10-15℃低溫。L16異養(yǎng)硝化-好氧反硝化最適轉(zhuǎn)速分別在200 r/min和150 r/min左右，與假單胞菌 WUST-7［6］和發(fā)光細(xì)菌 NNA4［35］結(jié)果相似，轉(zhuǎn)速對(duì)細(xì)菌脫氮能力的影響可能是由于亞硝酸鹽還原過(guò)程對(duì)氧敏感，高濃度溶解氧會(huì)抑制亞硝酸鹽的還原，低濃度溶解氧又抑制異養(yǎng)菌株的生長(zhǎng)，過(guò)高過(guò)低的溶解氧量都會(huì)影響菌株的脫氮能力［10］。以最佳環(huán)境因子作為培養(yǎng)條件優(yōu)化L16的脫氮能力，硝酸鹽氮去除率99.74%，氨氮去除率提高到93.41%，說(shuō)明環(huán)境因素顯著影響L16的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化能力。

圖5 環(huán)境因素對(duì)菌株L16異養(yǎng)硝化能力的影響

圖6 菌株L16好氧反硝化-異養(yǎng)硝化性能的優(yōu)化

4 結(jié)論

（1）從垃圾滲濾液中提取出一株HN-AD菌，對(duì)其進(jìn)行16S rDNA同源性分析，結(jié)果為無(wú)色桿菌（Achromobacter insuavisLMG26845）。對(duì)其好氧反硝化下硝氮去除率達(dá)98.4%，同時(shí)具有異養(yǎng)硝化能力，異養(yǎng)硝化的氨氮去除率為61.5%。

（2）對(duì)菌株L16的好氧反硝化能力進(jìn)行影響因素分析，在以乙酸鈉、檸檬酸鈉、琥珀酸鈉為碳源，C/N為15-5，培養(yǎng)溫度為30-37℃，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為100 r/min-200 r/min，其中以檸檬酸鈉為碳源，C/N為20，培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)的脫氮能力最強(qiáng)。

（3）對(duì)菌株L16的異養(yǎng)硝化能力進(jìn)行影響因素分析，在以乙酸鈉、檸檬酸鈉和琥珀酸鈉為碳源，C/N為15-25，培養(yǎng)溫度為20-37℃，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為50 r/min-200 r/min，其中以檸檬酸鈉為碳源，C/N為25，培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)的脫氮能力最強(qiáng)。

（4）對(duì)菌株L16異養(yǎng)硝化-好氧反硝化能力優(yōu)化，在脫氮能力最佳的環(huán)境因素下，L16的好氧反硝化硝酸鹽氮去除率為99.74%，總氮去除率58.90%。L16異養(yǎng)硝化的氨氮去除率提高到93.41%，總氮去除率86.33%。