改良Videman法復(fù)制兔膝骨關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究

劉 晶 林巧璇 盧莉銘 郭澤興 劉 洪 張良志 修忠標(biāo)

1福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建 福州 350004；2福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州350122；3中醫(yī)骨傷及運(yùn)動(dòng)康復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州350122；4福建省骨傷研究所，福建 福州350004* 通信作者：修忠標(biāo)，E-mail：xzbdoctor@sina.com

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是指由多種因素引起的以進(jìn)行性軟骨損害、軟骨下骨硬化、滑膜炎癥為表現(xiàn)的最常見慢性骨關(guān)節(jié)病，臨床以關(guān)節(jié)疼痛、腫大、僵硬伴關(guān)節(jié)功能障礙等為主［1］。KOA患病率高，全球約有2.5億人患有KOA，中國(guó)KOA患病率為8.1%［2］。目前，隨著全球人口老齡化進(jìn)程加快，KOA發(fā)病率也呈上升趨勢(shì)，已成為全球第四大致殘性疾病［3］。由于KOA發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，該病的臨床癥狀經(jīng)久難愈，反復(fù)發(fā)作。積極探索其發(fā)病機(jī)制，從而開發(fā)新治療技術(shù)和治療方法，對(duì)提高KOA的臨床療效具有重要作用。因此，制作穩(wěn)定的、符合疾病發(fā)展規(guī)律的KOA理想動(dòng)物模型是保證機(jī)制研究成功開展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。KOA模型制作最常用的動(dòng)物為新西蘭大白兔，造模方法主要分為力學(xué)失衡法及化學(xué)藥物刺激法［4-6］。其中經(jīng)典的Videman造模法通過伸直位固定建立膝KOA模型［7］，模擬了KOA發(fā)病過程中的軟組織慢性勞損，不受手術(shù)創(chuàng)傷及炎癥的影響，是開展實(shí)驗(yàn)研究的相對(duì)理想模型［8］。然而，既往研究已表明Videman造模法在實(shí)踐過程中存在造模時(shí)石膏固定不牢靠、下肢缺血壞死發(fā)生率高，造模結(jié)束后石膏不易拆卸等不足［9-10］。本團(tuán)隊(duì)在采用Videman造模法建立KOA兔模型用于針刀干預(yù)機(jī)制研究中，也發(fā)現(xiàn)了同樣的問題。基于此，本團(tuán)隊(duì)開展改良Videman造模法建立KOA模型制作的研究，通過行為學(xué)、影像學(xué)、軟骨形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行模型評(píng)價(jià)，并比較2種造模方法的石膏固定、石膏拆卸平均耗時(shí)及造模成功率，為建立穩(wěn)定、可靠、有效的KOA兔模型提供科學(xué)方法和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

普通級(jí)健康雄性6月齡新西蘭白兔60只，體質(zhì)量（2.0±0.5）kg，訂購(gòu)于上海松聯(lián)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司［生產(chǎn)許可證號(hào)碼：SCXK（滬）2017-0008］，委托福建省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SYXK（閩）2016-0005］飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單籠喂養(yǎng)，飼養(yǎng)房溫度20～25℃，濕度30%～60%，自然光照，自由進(jìn)食、飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常組、傳統(tǒng)Videman法組（簡(jiǎn)稱傳統(tǒng)組）和改良Videman法組（簡(jiǎn)稱改良組），每組20只。本實(shí)驗(yàn)已通過福建省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（FJATCM-IAEC2019037），實(shí)驗(yàn)過程對(duì)動(dòng)物的處置遵循科技部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要試劑與儀器

HE染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；水合氯醛（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；4%多聚甲醛、10%EDTA、0.9%NaCl注射液（南京丁貝生物有限公司）；光學(xué)顯微鏡、自動(dòng)脫水機(jī)、組織包埋機(jī)、Leica2025石蠟切片（德國(guó)Leica公司）；黏附載玻片、蓋玻片（江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司）；手術(shù)刀片（上海醫(yī)療器械批發(fā)部有限公司）；一次性包埋盒、包埋模具（上海源葉生物技術(shù)有限公司）；高分子石膏（陜西安信醫(yī)學(xué)技術(shù)開發(fā)有限公司）；普通石膏（浦江健宇衛(wèi)生材料有限公司）；數(shù)顯關(guān)節(jié)角度尺（上海三量工具有限公司）；DR機(jī)（日本島津公司）；3.0T磁共振（德國(guó)西門子公司）。

1.3 造模方法

傳統(tǒng)組將兔左后肢膝關(guān)節(jié)用高分子石膏管型固定于伸直位［7］。改良組在傳統(tǒng)Videman造模法的基本原理上進(jìn)行改良。具體方法：①將兔子仰臥于固定架上，助手面朝兔尾端坐下；先用2層脫脂棉包繞膝關(guān)節(jié)；然后右手握住實(shí)驗(yàn)兔左后肢踝關(guān)節(jié)并牽拉，使膝關(guān)節(jié)處于伸直中立位0°位置；再用左手將石膏托（采用普通石膏制作，長(zhǎng)約8 cm，寬約6 cm，厚度6～8層，提前塑型備用）放置在膝前側(cè)，石膏托的上1／4中心位于髕骨中點(diǎn)。② 操作者立于助手的右側(cè)，用高分子石膏繃帶單層螺旋纏繞大腿根部到趾尖上2 cm，然后塑型，保持膝關(guān)節(jié)伸直中立位0°，踝關(guān)節(jié)背曲60°。③ 最后使用防啃咬繃帶環(huán)形纏繞高分子石膏表面，防止兔啃咬石膏。見圖1。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)及方法

1.4.1 動(dòng)物一般情況觀察 造模6周期間，定期觀察造模期間兔一般狀況，記錄兔石膏脫落、左后肢血運(yùn)、會(huì)陰部感染及飲食等情況。

1.4.2 石膏固定、石膏拆卸平均耗時(shí) 記錄傳統(tǒng)組與改良組石膏固定操作時(shí)間、石膏拆卸時(shí)間，計(jì)算平均完成1只兔石膏固定及拆卸所需時(shí)間并進(jìn)行比較。

1.4.3 Lequesne MG膝關(guān)節(jié)級(jí)別評(píng)分 造模結(jié)束后1 d，采用 Lequesne MG 評(píng)分［11］評(píng)估造模前后膝關(guān)節(jié)功能，包括疼痛刺激反應(yīng)（0～3分）、步態(tài)改變（0～3分）、關(guān)節(jié)活動(dòng)（0～3分）、關(guān)節(jié)腫脹（0～2分）。Lequesne MG膝關(guān)節(jié)評(píng)分總分反映膝關(guān)節(jié)功能障礙程度，總分越高，膝關(guān)節(jié)功能障礙影響越大。

1.4.4 影像學(xué)觀察 造模結(jié)束后1 d，采用腹腔注射10%水合氯醛溶液（3 mL／kg）麻醉實(shí)驗(yàn)兔行左膝關(guān)節(jié)X線、MRI檢測(cè)。X線檢測(cè)方法：拍正位片取仰臥位，屈髖 30°，伸膝 0°，髖外展 15°，保持髕骨位于正前方，放射球管距離膝關(guān)節(jié)110 mm；拍側(cè)位片取患側(cè)臥位，患側(cè)（左后肢）肢體伸直，健側(cè)（右后肢）肢體屈髖70°，屈膝45°，放射球管距離膝關(guān)節(jié)110 mm；檢測(cè)參數(shù)設(shè)置為照射電壓50 kV、照射電流250 mA、照射量32 mAs、照射時(shí)間128 ms。MRI檢測(cè)方法：取仰臥位，膝關(guān)節(jié)處于外翻位，固定角度為15°，掃描儀中心定位于髕骨下極處。掃描序列及參數(shù)包括：① T1-tse-cor（FOV：100 mm×100 mm，ST：2 mm，TR：831 ms，TE：11 ms）；② PD-tse-fs-tra（FOV：100mm×100 mm，ST：3 mm，TR：4 930 ms，TE：20 ms）；③ T2-tse-sag（FOV：100 mm×100 mm，ST：2 mm，TR：6 860 ms，TE：84 ms）；④ T2-de3d（FOV：130 mm×130 mm，ST：0.6 mm，TR：19 ms，TE：9 ms）。 觀察造模前后左膝關(guān)節(jié)間隙、關(guān)節(jié)腔積液、軟骨面光滑度等變化，磁共振膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的分級(jí)參考MOAKS評(píng)分［12］，包括① 關(guān)節(jié)軟骨缺損：0分為無(wú)，1分為＜10%，2分為10%～75%，3分為＞75%；② 滑膜炎：0分為正常，1分為輕度，2分為中度，3分為重度；③ 關(guān)節(jié)積液：0分為生理量，1分為少量，2分為中量，3分為大量；④ 骨贅：0分為無(wú)，1分為輕，2分為中，3分為重；⑤ 其他關(guān)節(jié)周征象，包括鵝足滑囊炎、髕下囊信號(hào)異常、髕前囊信號(hào)異常，1分為有，0分為無(wú)。MOAKS評(píng)分總分反映KOA損傷程度，總分越高，KOA程度越重。

1.4.5 形態(tài)學(xué)觀察 于造模結(jié)束后 1 d，麻醉下耳緣靜脈空氣栓塞處死，將實(shí)驗(yàn)兔放置于冰面上，迅速解剖左側(cè)膝關(guān)節(jié)。行髕前正中切口，逐層分離軟組織至關(guān)節(jié)囊，用尖刀切斷股四頭肌在髕骨上緣附著處的肌腱，血管鉗提起髕骨上緣，沿髕骨兩側(cè)向下分離至脛骨平臺(tái)，切斷前后交叉韌帶側(cè)副韌帶，暴露股骨髁軟骨面和髕前滑膜，肉眼觀察關(guān)節(jié)軟骨、滑膜表面的形態(tài)、厚度以及色澤等大體的變化。軟骨肉眼觀評(píng)分參照PELLETIER等［13］的研究：關(guān)節(jié)軟骨表面光滑呈淡藍(lán)色或無(wú)色半透明狀，計(jì)0分；關(guān)節(jié)軟骨表面軟化但平滑，計(jì)1分；關(guān)節(jié)軟骨變薄，出現(xiàn)小纖維束狀變，計(jì)2分；關(guān)節(jié)軟骨明顯纖維束狀變，計(jì)3分；關(guān)節(jié)軟骨呈磨損性纖維束狀變，伴軟骨下骨外露及骨硬化，計(jì)4分。評(píng)分越高說明軟骨退變?cè)絿?yán)重。然后清除股骨遠(yuǎn)端周邊肌肉及韌帶，用咬骨鉗取下股骨遠(yuǎn)端。生理鹽水清洗、濾紙吸干后投入4%多聚甲醛中固定48 h。固定后用流水沖洗標(biāo)本4 h，用10%EDTA對(duì)軟骨進(jìn)行常規(guī)脫鈣處理。脫鈣完全后修切并進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，以厚度5 μm進(jìn)行組織石蠟切片制備，將組織切片置于60℃烘箱中干燥30 min后，放入二甲苯中脫蠟10 min；然后梯度乙醇溶液中入水各3 min；瀝干后浸入蘇木精液中染色10～20 min，蒸餾水沖洗；1%鹽酸酒精分色數(shù)秒，流水沖洗20 min至水清澈；PBS返藍(lán)，蒸餾水沖洗；入伊紅染料復(fù)染1 s，使細(xì)胞質(zhì)染成紅色，中性樹膠封片，待封片劑凝固后拍照，圖像采集分析。每張片選擇3個(gè)視野，參照Mankin’s評(píng)分［14］進(jìn)行分?jǐn)?shù)統(tǒng)計(jì)。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：正常0～2分，輕度病變3～7分，中度病變8～11分，重度病變12～14分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料服從正態(tài)分布以（±s）表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，3組間采用單因素方差分析，方差齊用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊用Tamhane’s T2檢驗(yàn)；非正態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組兔造模期間一般情況比較

見表1。

表1 3組兔造模期間一般情況比較Table 1 Comparison of general situation in three groups of rabbits during modeling

2.2 3組兔左膝關(guān)節(jié)Lequesne MG評(píng)分比較

見表2。

表2 3組兔左膝關(guān)節(jié)Lequesne MG評(píng)分比較（±s） 分Table 2 Comparison of Lequesne MG scores of left knee joint in three groups （±s）Scores

表2 3組兔左膝關(guān)節(jié)Lequesne MG評(píng)分比較（±s） 分Table 2 Comparison of Lequesne MG scores of left knee joint in three groups （±s）Scores

注：與正常組比較，1） P＜0.05。Note:Compared with the normal group,1)P＜0.05.

L e q u e s n e M G評(píng)分0 7.5 0 0±1.3 1 4 1）7.5 5 6±1.1 4 9 1）組別正常組傳統(tǒng)組改良組n 2 0 1 2 1 8

2.3 3組X線和MRI影像學(xué)比較

見圖2和圖3。

圖2結(jié)果提示，造模結(jié)束后1天，與正常組相比，改良組與傳統(tǒng)組關(guān)節(jié)間隙均變窄（P＜0.05）；圖3結(jié)果提示，關(guān)節(jié)腔內(nèi)積液增多、股骨髁軟骨面欠光滑，MOAKS評(píng)分顯著升高（P＜0.05）。改良組與傳統(tǒng)組影像學(xué)結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 3組左膝關(guān)節(jié)X線檢測(cè)關(guān)節(jié)間隙比較Figure 2 Comparison of X-ray images of left knee joint space in three groups of rabbits

2.4 3組組織形態(tài)學(xué)比較

見圖4和圖5。

圖4結(jié)果提示，與正常組相比，改良組與傳統(tǒng)組軟骨面無(wú)光澤，關(guān)節(jié)面變粗糙，部分有缺損，髕前滑膜增厚，色澤發(fā)黃，軟骨肉眼觀評(píng)分均升高（P＜0.05）。圖5結(jié)果提示，軟骨表層不平整，軟骨細(xì)胞排列欠規(guī)整，偶見軟骨細(xì)胞簇集，Mankin’s評(píng)分均升高（P＜0.05）。改良組與傳統(tǒng)組的形態(tài)學(xué)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 石膏固定時(shí)間和拆卸時(shí)間比較

見表3。

3 討 論

理想的KOA動(dòng)物模型能夠有效地模擬疾病發(fā)展過程。目前常用的KOA建模方法包括關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥物法，如注射木瓜蛋白造模法［5］；外科手術(shù)法，如 Hulth 法［6］；關(guān)節(jié)制動(dòng)法，如 Videman 法［7］。其中Videman造模法制作的KOA模型無(wú)關(guān)節(jié)內(nèi)影響和手術(shù)創(chuàng)傷，更接近病情自然發(fā)展過程。研究表明Videman造模法固定6周是制作KOA模型的理想方法［15-16］。但是實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)Videman造模法易造成兔下肢缺血性壞死、石膏脫落、拆卸困難等不足，其他學(xué)者也遇到類似問題［9-10］。

圖3 3組兔左膝關(guān)節(jié)MRI檢測(cè)MOAKS評(píng)分比較Figure 3 Comparison of MRI images and MOAKS scores of left knee joint in three groups of rabbits

圖4 3組兔軟骨及滑膜肉眼觀評(píng)分比較Figure 4 Comparison of the macropathology scores of cartilage and synovium in three groups of rabbits

為解決上述問題，改良Videman造模法參考傳統(tǒng)Videman造模法的基本原理進(jìn)行改良，具有以下3個(gè)特點(diǎn)。①膝前放置石膏托，有效防止石膏脫落：因?yàn)橥皿x骨底離髖關(guān)節(jié)僅3～4 cm，只要管型石膏上緣脫離髕骨底上 1 cm左右，兔膝關(guān)節(jié)就可以彎曲活動(dòng)，影響造模效果。傳統(tǒng)Videman造模法從髖部向下打石膏，用踝關(guān)節(jié)的彎曲角度（保持踝關(guān)節(jié)背曲60°）以阻止管型石膏滑落，但實(shí)際造模過程中石膏常常向下脫落導(dǎo)致造模失敗。分析原因考慮為兔因左后肢固定導(dǎo)致兔不適感而反復(fù)甩動(dòng)導(dǎo)致脫落；另外在長(zhǎng)期制動(dòng)過程中，因?yàn)橥眉∪馕s也可出現(xiàn)石膏脫落。而改良Videman造模法通過在膝前放置石膏托，起到良好固定作用，只要保證石膏托不滑離膝關(guān)節(jié)，就可以保證膝關(guān)節(jié)伸直位。②使用高分子石膏，減少下肢缺血壞死率：傳統(tǒng)Videman造模法使用普通石膏，成型較慢，塑型時(shí)間較久，需要疊加至一定厚度才具有固定效果，且其透氣性差，影響血液循環(huán)［9］。并且傳統(tǒng)Videman造模法為了防止石膏脫落，會(huì)加壓纏繞，尤其在踝關(guān)節(jié)處加壓，容易導(dǎo)致下肢缺血性壞死［10］。改良Videman造模法使用有機(jī)高分子石膏，成型快，塑型時(shí)間短，厚度薄且硬度高，耐磨損，只需要薄薄一層高分子石膏帶環(huán)形纏繞塑型即可確保石膏托不滑動(dòng)，纏繞中也不需要加壓，從而降低下肢缺血壞死發(fā)生率。③石膏拆卸容易：傳統(tǒng)Videman造模法的管型石膏需要專門的切割工具進(jìn)行拆卸，難度較大，耗時(shí)長(zhǎng)，且容易損傷兔皮膚。改良Videman造模法僅薄薄一層高分子石膏，僅用普通鉗子即可完成拆卸，方便拆卸并大大縮短拆卸時(shí)間。

圖5 3組兔股骨髁軟骨HE染色光鏡觀察Mankin’s評(píng)分比較（×100）Figure 5 Comparison of Mankin's scores and HE staining observed by light microscope of femoral condyle cartilage in three groups of rabbits （×100）

表3 2組石膏固定及拆卸時(shí)間比較（±s）Table 3 Comparison of fixation and disassembly time of gypsum between two groups （±s）min

表3 2組石膏固定及拆卸時(shí)間比較（±s）Table 3 Comparison of fixation and disassembly time of gypsum between two groups （±s）min

注：與傳統(tǒng)組比較，1） P＜0.05。Note:Compared with the traditional group,1)P＜0.05.

石膏固定1 3.5 0 0±1.3 8 1 4.8 3 3±1.1 5 0組別傳統(tǒng)組改良組n 1 2 1 8石膏拆卸3 0.8 3 3±1.8 5 0 2.9 4 4±1.1 6 2 1）

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：改良Videman造模法對(duì)比傳統(tǒng)Videman造模法，具有簡(jiǎn)單舒適、拆裝便利、固定牢靠和造模成功率高的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)能夠保證與傳統(tǒng)Videman造模法一致的造模質(zhì)量，可作為研究KOA機(jī)制的理想造模方法。然而改良組也會(huì)出現(xiàn)了石膏滑落、會(huì)陰部感染死亡和下肢腫脹壞死脫落等情況。為了提高造模成功率，總結(jié)分析了改良Videman造模法過程中的經(jīng)驗(yàn)和教訓(xùn)，以下幾點(diǎn)需要注意：①石膏托制作長(zhǎng)度 6～8 cm，寬度5～6 cm，厚度 6～8層為宜，放置在以膝關(guān)節(jié)髕骨為中心，髕上2 cm到髕下6 cm位置。通過測(cè)量，髕底到髂前上棘的距離為3～4 cm，髕尖到踝關(guān)節(jié)中心的距離為9～10 cm，因此石膏托長(zhǎng)度最長(zhǎng)可達(dá)12～14 cm。但過長(zhǎng)導(dǎo)致整體質(zhì)量太大，限制兔髖部的活動(dòng)，影響兔排尿，容易發(fā)生會(huì)陰部感染；過短容易滑落，需重打石膏，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因此本研究采取長(zhǎng)度6～8 cm，取得良好的效果。石膏托需要保證與大腿皮膚一定的接觸面積才能穩(wěn)定，測(cè)量兔子大腿平均周徑為10～12 cm，而太寬加重石膏質(zhì)量，太窄容易滑動(dòng)。本次研究采取石膏托寬度為大腿平均周徑的1／2，取得很好的效果。石膏托需要一定的硬度才能夠起到良好的支撐作用，太厚增加石膏重量，太薄石膏容易折斷。本次研究表明石膏托厚度在6～8層即具有良好的硬度，且不會(huì)過重影響兔髖部活動(dòng)。石膏托宜放置在以膝關(guān)節(jié)髕骨為中心，髕上2cm到髕下6 cm位置，石膏托上緣太靠近髖關(guān)節(jié)，會(huì)影響髖部的活動(dòng)，太靠近髕骨，容易出現(xiàn)滑落。本次實(shí)驗(yàn)過程中改良組就出現(xiàn)1只兔因石膏托上緣太靠近髖關(guān)節(jié)，限制兔髖部的活動(dòng)，影響兔排尿而發(fā)生會(huì)陰部感染。②纏繞高分子石膏切勿加壓，尤其是在石膏托下緣處。初期打石膏特別追求石膏的牢靠，刻意在纏繞高分子石膏條時(shí)加壓，尤其是擔(dān)心石膏托向下滑動(dòng)，故在石膏托下緣處加壓纏繞，這樣極容易造成下肢缺血性壞死。本次實(shí)驗(yàn)過程中改良組就出現(xiàn)1只兔因石膏托下緣纏繞高分子石膏條時(shí)過緊，影響下肢血液循環(huán)而出現(xiàn)下肢腫脹壞死。③高分子石膏條僅需纏繞1層即可。因?yàn)槔p繞1層石膏條即可固定牢靠，不僅節(jié)約石膏費(fèi)用，還透氣輕便，拆卸方便。

本實(shí)驗(yàn)從兔左膝關(guān)節(jié)行為學(xué)、影像學(xué)、形態(tài)學(xué)角度揭示改良Videman造模法能夠達(dá)到與傳統(tǒng)Videman造模法一致的造模效果，通過對(duì)比固定與拆卸石膏操作耗時(shí)情況、造模過程中動(dòng)物的死亡率，驗(yàn)證了改良Videman造模法操作簡(jiǎn)單、成功率高、死亡率低的優(yōu)勢(shì)，為KOA機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。