膽木化學成分對HUVEC細胞活性氧和通透性的影響

麥世瑛 王怡然 李永輝 譚銀豐 張旭光 張俊清 李錦云

摘要?目的：研究膽木化學成分對HUVEC細胞通透性、ROS生成水平的影響，探討膽木對HUVEC的保護作用。方法：設有對照組和觀察組，通過FITC標記的右旋糖酐（Dextran）試劑盒檢測膽木成分對AngⅡ誘導HUVEC單層通透性的影響;以DCFH-DA試劑盒檢測膽木化學成分對ROS的抑制作用，采用LPS誘導HUVEC細胞的ROS。結(jié)果：膽木生物堿及酚酸類成分對LPS引起的ROS水平增加有抑制趨勢，10?μg/mL的喜果苷促進作用有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。膽木成分具有促進HUVEC細胞通透性增加的作用，其中異常春花苷內(nèi)酰胺、喜果苷和原兒茶酸對HUVEC細胞通透性有明顯的促進作用。結(jié)論：膽木抗炎作用可能與其促進活性氧生成及通透性增加有關(guān)。

關(guān)鍵詞?膽木;活性氧;通透性;ROS;烏檀;生物堿;酚酸;增殖

Effects?of?Chemical?Constituents?of?Nauclea?Officinalis?on?Reactive?Oxygen?Species?and?Permeability?of?HUVEC?Cells

MAI??Shiying1，WANG?Yiran1，LI?Yonghui1，TAN?Yinfeng1，ZHANG?Xuguang1，ZHANG?Junqing1，LI?Jinyun2

（1?Hainan?Provincial?Key?Lab?of?R&D?on?Tropic?Herbs，Hainan?Medical?University，Haikou?571199，China;?2?Hainan?Senqi?Pharmaceutical?Co.，Ltd，Haikou?570216，China）

Abstract?Objective：To?observe?the?effects?of?chemical?components?from?Nauclea?officinalis?on?the?HUVEC?monolayer?permeability?and?reactive?oxygen?species（ROS）production?induced?by?pro-inflammatory?factors，and?to?investigate?the?protective?effect?of?Nauclea?officinalis?on?HUVEC.Methods：A?control?group?and?an?experimental?group?were?set?up.FITC-Dextran?kit?was?used?to?detect?the?effects?of?components?from?Nauclea?officinalis?on?AngII-induced?HUVEC?monolayer?permeability;?DCFH-DA?kit?was?used?to?detect?the?inhabitation?effects?of?components?from?Nauclea?officinalis?on?ROS.The?ROS?in?HUVEC?cells?were?induced?by?LPS.Results：The?results?showed?that?the?composition?of?Nauclea?officinalis?inhibited?the?increase?of?ROS?induced?by?LPS，but?the?promotion?effect?of?10?μg/mL?of?vincosamide?was?significant.The?composition?of?Nauclea?officinalis?had?the?effects?of?promoting?the?increase?of?HUVEC?cell?permeability.Among?them，strictosamid，vincosamiide?and?protocatechuic?acid?had?significant?promoting?effects?on?HUVEC?cell?permeability.Conclusion：The?anti-inflammatory?effects?of?Nauclea?officinalis?may?be?related?to?the?promotion?of?active?oxygen?production?and?increased?permeability.

Keywords?Nauclea?officinalis;?Reactive?oxygen?species;?Permeability;?ROS;?Nauclea;?Alkaloids;?Phenolic?acid;?Proliferation

中圖分類號：R284文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.01.008

膽木（Nauclea?officinalis?Pierre?ex?Pitard.）為茜草科烏檀屬植物，又名烏檀、熊膽樹、黃膽木、山熊膽等，以枝、皮入藥，具有清熱解毒、消腫止痛的功效，用于治療咽喉炎、支氣管炎、急性扁桃體炎等，有“植物抗生素”之稱，主要用于感冒中上呼吸道感染的預防和治療[1-2]。機體存在炎性反應時，前期損傷因子直接或間接造成組織和細胞的破壞[3-4];后期通過相關(guān)細胞的增殖、遷移與愈合等途徑促進炎性反應的修復[5]。高氧化活性的含氧自由基（ROS）作為調(diào)節(jié)細胞增殖的重要信號因子[6]，有研究表明其產(chǎn)量的適度增加能促進內(nèi)皮細胞增殖[7]。因此本研究主要觀察膽木成分抗炎活性、活性氧水平、通透性之三者間的關(guān)系及膽木成分在其中發(fā)揮的作用。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?細胞株?人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC細胞）購自上海哥凡生物科技有限公司（貨號GF067）。將HUVEC細胞維持在含有10%胎牛血清和10%肝素鈉的青霉素/鏈霉素補充的F-12k中，并在細胞培養(yǎng)箱（37?℃，95%空氣和5%CO2）中培養(yǎng)。每2～3?d更換培養(yǎng)基，并在匯合度達70%～80%時進行傳代培養(yǎng)，按1∶2或1∶3傳代。

1.1.2?藥物及試劑?綠原酸（批號PRF9012741，質(zhì)量分數(shù)99.48%）購買于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，原兒茶酸（批號P104382-5?g，質(zhì)量分數(shù)≥97%）購買于煉石商城;喜果苷、短小舌根草苷和異長春花苷內(nèi)酰胺為本課題組分離得到（質(zhì)量分數(shù)≥95%）。AngⅡ購買于煉石商城（貨號A800620-10?mg，純度：90%），胎牛血清（FBS）購自Gibco（美國，貨號16000044），PBS（美國Hyclone，貨號SH30256.01），F(xiàn)-12k培養(yǎng)液購自武漢博士德生物工程有限公司（貨號PYG0093），肝素鈉購自Solarbio（貨號H8060-1?g）;細胞生長因子（ECGS）（貨號KGY1052）購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，青、鏈霉素混合液（Biosharp，貨號BL505A），胰蛋白酶（含EDTA）（美國Hyclone，貨號SH30042.01），CCK-8試劑盒（Biosharp），活性氧試劑盒（南京建成），LPS其他常用生化試劑均為國產(chǎn)分析純。各測試樣品以DMSO溶解并稀釋至合適濃度，-20?℃保存?zhèn)溆?。水為去離子超純水。

1.1.3?儀器?LabTower?EDI15超純水一體機（美國賽默飛世爾科技）;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）;KQ-100V超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）;梅特勒XS105DU電子分析天平（瑞典梅特勒）;Waters?e2696/2996高效液相色譜儀;DZF-6053臺式真空干燥箱（上海藍豹）;LC-20A制備液相（日本島津）;Jasco?V-650紫外分光光度計（日本分光）;色譜柱為Waters?Symmetry?C18（4.6×150?mm，5?μm）;TGL-16G臺式高速離心機（上海安亭儀器廠）;CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國，Thermo公司）;SPECTRA?MAX?190酶標儀（中國）;CKX41倒置顯微鏡（日本奧林巴斯）;蔡司VERT.A1倒置熒光顯微鏡（中國）。

1.2?方法

1.2.1?膽木成分的制備?膽木莖枝（4.7?kg）粉碎，用水提?。?0?L/5?h/次，共3次），濃縮得浸膏118?g。分別用二氯甲烷、乙酸乙酯萃取浸膏，濃縮后分別為19.6?g和16.7?g。經(jīng)反復硅膠柱色譜，制備色譜等分離萃取浸膏，共得到5個化合物：喜果苷[8]，異常春花苷內(nèi)酰胺[9]，短小蛇根草苷[10]，綠原酸[11]，原兒茶酸[12]。

1.2.2?采用CCK-8方法評價膽木化學成分對HUVEC細胞的促進增殖作用?參照文獻[13]，采用CCK-8的方法評價膽木化學成分對HUVEC細胞的促進增殖作用。具體方法：細胞以1.5×104個細胞/0.2?mL/孔的密度接種在96孔板中。分別取用不同濃度的樣品（濃度設定如圖1所示）或DMSO作為對照處理細胞，并在細胞培養(yǎng)箱中孵育。24?h后，棄掉舊培養(yǎng)液，向每個孔中加入100?μL?CCK-8稀釋液，并將平板再次放回培養(yǎng)箱，分別于1?h、2?h、3?h、4?h使用SPECTRA?MAX?190酶標儀（Molecular?Devices，China）測量450?nm處樣品的吸光度。

1.2.3?以FITC標記的右旋糖酐（Dextran）試劑盒檢測膽木成分對AngⅡ誘導HUVEC單層通透性的影響?將HUVEC用0.5%胰蛋白酶消化并制成密度為4×105/mL細胞懸液，各吸250?μL接種于試劑盒的嵌套小室內(nèi)，將嵌套置于24孔培養(yǎng)板的小井中，小井中加入500?μL培養(yǎng)液，放入37?℃含5%?CO2濕度為95%～100%的孵箱內(nèi)培養(yǎng)，嵌套和24孔培養(yǎng)板的小井構(gòu)成2個相對隔離的小室：嵌套小室和外室。嵌套小室和外室可通過生長在嵌套小室的內(nèi)皮細胞單層進行物質(zhì)交換。嵌套小室上內(nèi)皮細胞生長成致密連接狀態(tài)后，在嵌套小室內(nèi)室更換新鮮含藥物（或樣品）的培養(yǎng)基（不含F(xiàn)BS）饑餓培養(yǎng)，模型組、空白組及外室更換成新鮮不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基。24?h后藥物組及模型組加入250?μL稀釋好（均用含2%?FBS的F-12k稀釋）的Ang?Ⅱ（10-6M），并設正常對照組（只加250?μL含2%?FBS的F-12k），加入稀釋好的FITC-Dextran作為通透性指示劑。分別于0.5?h、1?h、2?h、4?h后收集外室培養(yǎng)液，熒光酶標儀檢測激發(fā)波長488?nm，發(fā)射波長：530?nm的熒光值，n=3，內(nèi)皮細胞單層對FITC-Dextran的相對通透率按以下公式計算（以模型組為對照），相對通透率=（藥物組-模型組）/（模型組-空白組）×100%。

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（2018-12-27收稿?責任編輯：芮莉莉）

基金項目：海南省自然科學基金項目（20168270）;海南省研究生創(chuàng)新研究項目（Hys2017-182）作者簡介：麥世瑛（1994.05—），女，碩士，藥師，研究方向：藥物活性成分研究，E-mail：854363381@qq.com通信作者：李永輝（1974.09—），男，博士，研究員，研究方向：藥物分析與聽代謝動力學研究，E-mail：lyhssl@126.com