食品微生物檢測(cè)中PCR技術(shù)的應(yīng)用研究

閆小風(fēng)

摘 要：現(xiàn)階段，隨著社會(huì)的發(fā)展，我國(guó)的科學(xué)技術(shù)的發(fā)展也有了很大的改善。在人們生活水平不斷提升的背景下，人們對(duì)于食品的需求量也變得越來(lái)越大，如果食品中微生物超標(biāo)或含有致病微生物，將會(huì)引發(fā)食物中毒等問(wèn)題，對(duì)人類的身體健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅。

關(guān)鍵詞：食品微生物檢測(cè);PCR技術(shù);應(yīng)用研究

【中圖分類號(hào)】TS207.4 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1674-3733（2020）02-0216-01

引言：隨著我國(guó)市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)及食品生產(chǎn)加工產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，新技術(shù)作為食品生產(chǎn)加工質(zhì)量檢測(cè)的重要手段，其重要性不言而喻。通過(guò)近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，新技術(shù)在運(yùn)用過(guò)程中的規(guī)范性與方法性對(duì)食品微生物檢測(cè)、食品安全與風(fēng)險(xiǎn)的消除影響非常大。

1 我國(guó)食品面臨的主要安全問(wèn)題

隨著我國(guó)市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)建設(shè)的迅速發(fā)展，人們的生活水平不斷提升，人們對(duì)食品的營(yíng)養(yǎng)功效與安全問(wèn)題越發(fā)關(guān)注。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)資料顯示，歷年來(lái)我國(guó)都有因食品安全問(wèn)題造成的重大事件，甚至是死亡事故的出現(xiàn)。如何加強(qiáng)食品安全檢測(cè)已成為諸多專家學(xué)者共同研究的議題之一。食品安全的有效保障不是簡(jiǎn)單的流程，需從時(shí)代發(fā)展角度出發(fā)，對(duì)因人為操作、環(huán)境污染及微生物污染等造成的食物性中毒進(jìn)行科學(xué)檢測(cè)及防范，減少對(duì)身體的危害。目前，食品安全問(wèn)題已成為世界組織共同研究與探討的核心，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行分析了解，發(fā)現(xiàn)我國(guó)食品安全主要面臨以下問(wèn)題：①人為因素造成的食品問(wèn)題。在食品制造加工過(guò)程中，因生產(chǎn)者自身疾病造成的食品病菌傳染，這種隱患隨著食品的銷售傳遞到消費(fèi)者口中。②環(huán)境污染對(duì)食品造成的影響。目前，我國(guó)環(huán)境相對(duì)較為惡劣，大氣污染、水質(zhì)污染、工業(yè)污染等都會(huì)對(duì)食品造成影響。③微生物導(dǎo)致的食品問(wèn)題。微生物具有很強(qiáng)的生存能力，往往通過(guò)融入食品而進(jìn)入人體內(nèi)部，對(duì)人體細(xì)胞、組織結(jié)構(gòu)造成嚴(yán)重危害。因此，通過(guò)有效技術(shù)對(duì)食品進(jìn)行檢驗(yàn)、檢測(cè)十分重要。

2 PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 巢式PCR

巢式PCR能夠利用兩種不同的引物對(duì)DNA檢測(cè)片段進(jìn)行擴(kuò)增，利用第1套引物擴(kuò)增15-30個(gè)循環(huán)，然后根據(jù)DNA片段設(shè)定第2套引物，同樣擴(kuò)增15-30個(gè)循環(huán)，第2套引物即為內(nèi)引物。通過(guò)巢式PCR能夠全面增強(qiáng)反應(yīng)的特異性，也能夠增強(qiáng)物異性和敏感性，對(duì)微生物的檢測(cè)和DNA的擴(kuò)增具有非常明顯的效果。通常情況下，巢式PCR技術(shù)在第1次擴(kuò)增中必須打開(kāi)反應(yīng)管，然后除去第1套引物才能夠增加第2套引物，所以巢式PCR自身的操作非常復(fù)雜。利用巢式PCR技術(shù)可以確保外引物的溫度明顯上升，并且直接將兩套引物同時(shí)增加到PCR反應(yīng)之中，如果內(nèi)引物不能夠繼續(xù)結(jié)合，則形成雙酶鏈，確保整個(gè)引物反應(yīng)系統(tǒng)穩(wěn)定性增強(qiáng)。在引物擴(kuò)增完畢后才能夠在低溫作用下內(nèi)引物會(huì)開(kāi)始工作，如此的反復(fù)循環(huán)能夠快速的降低變性溫度，避免巢式PCR在循環(huán)的過(guò)程中產(chǎn)生產(chǎn)物檢驗(yàn)。

2.2 熒光定量PCR

熒光定量PCR主要就是通過(guò)熒光能量傳遞，能夠?qū)γ告準(zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)熒光能量從供體發(fā)射基團(tuán)直接轉(zhuǎn)移到受體，就能夠?qū)ξ⑸锏拇笮蛄谐跏紳舛冗M(jìn)行快速判斷，達(dá)到一定的檢測(cè)效果。熒光PCR包括探針與非探針兩種檢測(cè)方式。其中，探針熒光PCR具有定量性，能夠根據(jù)大序列特異性雜交探針擴(kuò)增產(chǎn)物，準(zhǔn)確判斷引物的特點(diǎn)。非探針熒光定量PCR則可以直接增加過(guò)量的熒光染料，保證對(duì)DNA雙鏈特異性感染進(jìn)行分析，熒光定量PCR檢測(cè)非常簡(jiǎn)便易行，而且檢測(cè)結(jié)果非常準(zhǔn)確。不摻入SYBR染料的分子并不會(huì)發(fā)射出熒光信號(hào)，通過(guò)這樣的設(shè)計(jì)能夠保證熒光信號(hào)得到增強(qiáng)，確保PCR產(chǎn)物的反應(yīng)全面同步。目前最常見(jiàn)的熒光PCR非探針類主要以美國(guó)公司生產(chǎn)的SYBR染料為主，因?yàn)槠涮禺愋耘c引物的性質(zhì)非常明顯。非雙鏈DNA發(fā)生時(shí)，熒光性會(huì)得到全面提升，與常規(guī)的PCR特異性沒(méi)有明顯差別，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果顯示，利用SYBR能夠?qū)Ψ巧抽T(mén)氏菌進(jìn)行全面檢測(cè)。探針式熒光檢測(cè)能夠以寡核苷酸為主通過(guò)在兩端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)，在PCR反應(yīng)溶液中，通過(guò)增加一對(duì)引物來(lái)增強(qiáng)熒光探針的特異性，沒(méi)有擴(kuò)增之前，探針屬于完整的，所以報(bào)告集團(tuán)的熒光信號(hào)能夠被淬滅基團(tuán)完全吸收。當(dāng)PCR擴(kuò)增之后會(huì)相互分離，熒光檢測(cè)系統(tǒng)可以快速接收熒光信號(hào)，確保DNA信息鏈不斷增加，形成全新的熒光分子，保證熒光信號(hào)與PCR產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)同步。由于同一探針兩面分為活躍端與寧?kù)o端。如果在PCR溶液中，加入特異模板之后能夠破壞探針的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，這樣就會(huì)使溶液產(chǎn)生熒光，而且熒光的強(qiáng)度與溶液模板成正比。通過(guò)分子信標(biāo)的方式，能夠直接根據(jù)非熒光染料，作為淬滅分子，降低熒光本底。

2.3 多重PCR檢測(cè)技術(shù)的改進(jìn)

雖然多重PCR技術(shù)在應(yīng)用于檢測(cè)食品微生物上能夠產(chǎn)生明顯作用，但是其本身也存在著明顯的不足，主要表現(xiàn)在引物之間會(huì)出現(xiàn)相互抑制的情況，與非靶序列進(jìn)行結(jié)合會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。食品成分相對(duì)較為復(fù)雜或微生物含量較低，會(huì)對(duì)樣品產(chǎn)生直接影響，從而導(dǎo)致靈敏度不斷下降，甚至是形成假陰性結(jié)果，對(duì)于該檢測(cè)技術(shù)的普及應(yīng)用是非常不利的。在對(duì)多重PCR檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行改善時(shí)，相關(guān)研究人員為了對(duì)反應(yīng)條件和多重PCR體系進(jìn)行優(yōu)化，借助免疫磁珠吸附技術(shù)以便獲得更為理想的前處理效果，并降低各種抑制因子的作用。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR可以有效免除后處理，其本身?yè)碛懈咝А⑻禺愐约皽?zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)，然而因?yàn)樵O(shè)備成本過(guò)高，并且最終檢測(cè)結(jié)果還有可能受到其他方面因素的影響，如外源DNA，所以需要簡(jiǎn)化樣品處理過(guò)程，最大程度降低檢測(cè)成本。利用變性梯度凝膠電泳可將堿基數(shù)不同的DNA分離開(kāi)，然后根據(jù)DNA分布情況等了解微生物，如此操作不僅變得更加簡(jiǎn)單，而且還具有非常高的準(zhǔn)確性。另外，由于分析的樣品容量相對(duì)較小，所以只能夠應(yīng)用于相對(duì)較小的DNA片段的分析中，并且在制備樣品時(shí)圖譜條帶會(huì)發(fā)生改變。

結(jié)語(yǔ)：隨著食品微生物檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，如何提高檢測(cè)的效率和精確度已經(jīng)成為食品微生物檢測(cè)發(fā)展的重要因素，目前PCR技術(shù)在實(shí)踐和應(yīng)用的過(guò)程中還存在某些缺陷，但是隨著技術(shù)的快速發(fā)展與完善，食品微生物檢測(cè)的整體水平也會(huì)不斷提升?？偠灾?，微生物的快速檢測(cè)在食品衛(wèi)生微生物檢測(cè)方面的作用越來(lái)越重要，PCR技術(shù)能夠融合免疫學(xué)分子生物學(xué)計(jì)算機(jī)技術(shù)，快速建立食品微生物檢測(cè)模型，確保食品微生物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)更高、效率更高、靈敏度更高，為我國(guó)的食品安全做出重要的貢獻(xiàn)。

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