HPLC法同時測定不同采集地衢枳殼中12種黃酮類成分的含量

馮敬騫　胡衛(wèi)南　徐禮萍　李姜言　王思為　宋劍鋒

中圖分類號 R282 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）05-0571-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.05.13

摘 要 目的：建立同時測定衢枳殼中12種黃酮類成分含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Agilent Extend C18，流動相為0.1%甲酸水溶液-乙腈溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃，檢測波長為330 nm，進(jìn)樣量為10 μL。測定不同采集地的10批衢枳殼樣品中12種黃酮類成分（圣草次苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮內(nèi)酯、木犀草素、橙皮內(nèi)酯、川陳皮素、桔皮素、橙皮油內(nèi)酯）的含量。結(jié)果：圣草次苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮內(nèi)酯、木犀草素、橙皮內(nèi)酯、川陳皮素、桔皮素、橙皮油內(nèi)酯檢測的質(zhì)量濃度線性范圍分別為1.65～16.51、4.50～45.02、35.41～354.12、4.11～41.12、2.29～22.86、34.96～349.56、1.42～14.15、1.50～15.04、1.83～18.28、1.51～15.08、1.61～16.12、1.28～12.84? ? ? μg/mL（r均大于0.999 7）;檢測限分別為0.165 1、0.450 2、3.541 2、0.411 2、0.228 6、3.495 6、0.141 5、0.150 4、0.182 8、0.150 8、0.161 2、0.128 4 μg/mL;定量限分別為0.547 8、1.487 4、11.663 3、1.360 3、0.758 3、11.594 9、0.466 3、0.497 1、0.601 2、0.499 9、0.532 3、0.424 6? μg/mL;精密度（n=6）、重復(fù)性（n=6）、穩(wěn)定性（24 h，n=7）試驗(yàn)的RSD均小于3%;平均加樣回收率分別為99.50%、99.61%、98.18%、98.85%、98.48%、98.50%、98.25%、99.91%、103.13%、98.82%、98.44%、100.29%（RSD=1.49%～2.38%，n=6）。10批不同采集地衢枳殼樣品中，上述12個成分的含量分別為1.995 5～2.648 8、4.317 7～5.005 1、33.215 5～34.054 6、3.140 4～3.471 5、3.221 2～3.748 8、42.746 6～44.026 6、0.202 7～0.239 4、0.191 2～0.208 8、0.080 3～0.097 9、0.291 9～0.307 1、0.119 9～0.149 1、0.082 7～0.089 8 mg/g。結(jié)論：建立的含量測定方法準(zhǔn)確、可靠、簡便、高效，可用于同時測定衢枳殼中12個黃酮類成分的含量，并為衢枳殼質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞 衢枳殼;黃酮類成分;柚皮苷;新橙皮苷;含量測定;高效液相色譜法

Simultaneous Determination of the Contents of 12 Flavonoids in Quzhiqiao from Different Collection Places by HPLC

FENG Jingqian1，HU Weinan2，XU Liping2，LI Jiangyan3，WANG Siwei4，SONG Jianfeng2（1.School of Medicine， Quzhou College of Technology， Zhejiang Quzhou 324000， China;2.Quzhou Institute for Food and Drug Control， Zhejiang Quzhou 324002， China;3.Dept. of Pharmacy， Quzhou Hospital of TCM， Zhejiang Quzhou 324022， China;4.Dept. of Pharmacy， Quzhou Municipal Peoples Hospital， Zhejiang Quzhou 324000， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish a method for the simultaneous determination of the contents of 12 flavonoids in Quzhiqiao. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Agilent Extend C18 column with mobile phase consisted of 0.1% formic acid-acetonitrile （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was set at 35 ℃. The detection wavelength was set at 330 nm， and sample size was 10 μL. The contents of 12 components （such as eriocitrin， narirutin， naringin， naringenin， hesperidin， neohesperidin， hesperide hydrate， luteolin， hesperide， nobiletin， hesperetin and hesperidolactone） in 10 batches of Quzhiqiao from different collection places were determined. RESULTS： The linear range of eriocitrin， narirutin， naringin， naringenin， hesperidin， neohesperidin， hesperide hydrate， luteolin， hesperide， nobiletin， hesperetin and hesperidolactone were 1.65-16.51， 4.50-45.02， 35.41-354.12， 4.11-41.12， 2.29-22.86， 34.96-349.56， 1.42-14.15， 1.50-15.04， 1.83-18.28， 1.51-15.08， 1.61-16.12， 1.28-12.84 μg/mL， respectively （all r>0.999 7）. The detection limits were 0.165 1， 0.450 2， 3.541 2， 0.411 2， 0.228 6， 3.495 6， 0.141 5， 0.150 4， 0.182 8， 0.150 8， 0.161 2， 0.128 4 μg/mL， respectively. The limits of quantitation were 0.547 8， 1.487 4， 11.663 3， 1.360 3， 0.758 3， 11.594 9， 0.466 3， 0.497 1， 0.601 2， 0.499 9， 0.532 3， 0.424 6 μg/mL， respectively. RSDs of precision （n=6）， reproducibility （n=6） and stability （24 h，n=7） tests were all lower than 3%. The average recoveries were 99.50%， 99.61%， 98.18%， 98.85%， 98.48%， 98.50%， 98.25%， 99.91%， 103.13%， 98.82%， 98.44%， 100.29% （RSD=1.49%-2.38%， n=6）. The contents of the above 12 components in 10 batches of samples from different collection places were 1.995 5-2.648 8， 4.317 7- 5.005 1， 33.215 5-34.054 6， 3.140 4-3.471 5， 3.221 2-3.748 8， 42.746 6-44.026 6， 0.202 7-0.239 4， 0.191 2-0.208 8， 0.080 3- 0.097 9， 0.291 9-0.307 1， 0.119 9-0.149 1， 0.082 7-0.089 8 mg/g. CONCLUSIONS： The method is accurate， reliable， simple and efficient， which can be used to simultaneous determination of the contents of 12 flavonoids in Quzhiqiao， and to provide reference for the establishment of quality control standards of Quzhiqiao.

KEYWORDS? ?Quzhiqiao; Flavonoids; Naringin; Neohesperidin; Content determination; HPLC

衢枳殼俗稱“胡柚片”，為蕓香科植物常山胡柚（Citrus changshan-huyou Y.B.Chang）的未成熟果實(shí)，主產(chǎn)于浙江衢州，一般于每年的6-7月采收。常山胡柚的未成熟果實(shí)作為藥用在浙江有很長的歷史，已于2015年作為地方習(xí)用藥材收入了《浙江省中藥炮制規(guī)范》（2015年版）中，命名為“衢枳殼”[1-2]，為“新浙八味”和“衢六味”的品種之一。衢枳殼在浙江資源豐富、產(chǎn)量高，藥材中主要含有揮發(fā)油和黃酮類等成分。衢枳殼具有鎮(zhèn)咳化痰、清熱解毒、調(diào)節(jié)胃腸道功能、降血糖、降血脂和降血壓等功效，具有較高的開發(fā)利用價值[3-5]。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，衢枳殼中的黃酮類成分是其發(fā)揮理氣寬中等作用的重要成分，也是評價衢枳殼質(zhì)量的指標(biāo)性成分[4，6-8]。前期本課題組采用高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜法（HPLC-Q-TOF-MS）并結(jié)合相關(guān)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫初步分析了衢枳殼中的化學(xué)成分，顯示其含有多種黃酮類成分。而目前對衢枳殼中多個成分同時檢測的文獻(xiàn)報(bào)道較少，雖有采用HPLC法同時測定衢枳殼中7個指標(biāo)成分含量的文獻(xiàn)報(bào)道[9-11]，但尚不能涵蓋衢枳殼中其他指標(biāo)成分。而中藥一般通過多成分、多靶點(diǎn)發(fā)揮協(xié)同增效的作用，如能同時測定出其中更多的黃酮類成分的含量，對衢枳殼的質(zhì)量控制、譜效關(guān)系分析和闡明其中的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)都具有重要意義。

為了能更好地控制衢枳殼的質(zhì)量，本研究選擇衢枳殼中具有主要活性的12個黃酮類成分（圣草次苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮內(nèi)酯、木犀草素、橙皮內(nèi)酯、川陳皮素、桔皮素和橙皮油內(nèi)酯）作為定量檢測指標(biāo)，建立HPLC法同時測定其含量，并應(yīng)用于來自10個不同采集地的衢枳殼樣品檢測中，以期為完善衢枳殼的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括G1316B型柱溫箱、G1312B型泵系統(tǒng)[美國Agilent科技（中國）有限公司];PA2251型電子分析天平[賽多利斯（上海）貿(mào)易有限公司];KQ5200E型超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）;HYJD-T型實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)（杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司）;KA-1000C型臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

衢枳殼藥材分別于2019年6月采自浙江衢州市10個不同的常山胡柚標(biāo)準(zhǔn)化種植基地，在每個基地的東、南、西、北、中5個方位分別采集樣本（于2019年6月下旬采集后對半切開，50 ℃烘干，封口包裝，備用），由衢州市食品藥品檢驗(yàn)研究院宋劍鋒主任中藥師鑒定均為常山胡柚的未成熟果實(shí);圣草次苷對照品（批號：CDGB- 89194，純度：98.56%）、橙皮油內(nèi)酯對照品（批號：CDAA-281288，純度：98.72%）均來源于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;蕓香柚皮苷對照品（批號：131208，純度：98.56%）、柚皮素對照品（批號：130908，純度：98.48%）、桔皮素對照品（批號：130708，純度：98.86%）、川陳皮素對照品（批號：130108，純度：98.75%）均來源于四川省維克奇生物科技有限公司;柚皮苷對照品（批號：110722-201312，純度：98.96%）、橙皮苷對照品（批號：110721-201316，純度：98.88%）、新橙皮苷對照品（批號：111857-201102，純度：98.84%）、木犀草素對照品（批號：111520-201006，純度：98.98%）均來源于中國食品藥品檢定研究院;水合橙皮內(nèi)酯對照品（批號：BBP00486，純度：98.50%）、橙皮內(nèi)酯對照品（批號：BBP00392，純度：99.10%）均來源于云南西力生物技術(shù)有限公司;甲醇、乙腈為色譜純，磷酸、甲酸、乙酸為分析純，均來源于中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司;水為超純水（自制）。衢枳殼樣品來源信息見表1。

表1 衢枳殼樣品來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Extend C18（250 mm×4.6 mm，5? ? ? ? μm）;流動相：A相為 0.1%甲酸水溶液，B 相為乙腈溶液，梯度洗脫;流速：1.0 mL/min;柱溫：35 ℃;檢測波長：330 nm;進(jìn)樣量：10 μL。梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別稱取圣草次苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮內(nèi)酯、木犀草素、橙皮內(nèi)酯、川陳皮素、桔皮素、橙皮油內(nèi)酯12個對照品適量，精密稱定，置于不同量瓶中，加70%甲醇使之溶解并制成質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL的單一對照品貯備液;精密移取12種對照品貯備液適量，混合，制成含圣草次苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮內(nèi)酯、木犀草素、橙皮內(nèi)酯、川陳皮素、桔皮素、橙皮油內(nèi)酯質(zhì)量濃度分別為16.51、45.02、354.12、41.12、22.86、349.56、14.15、15.04、18.28、15.08、16.12、12.84 μg/mL的混合對照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液 取衢枳殼樣品，粉碎，過3號篩;取粉末約0.2 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量;超聲（功率：200 W，頻率：40 kHz）提取30 min，放冷至室溫，密塞;再次稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 取混合對照品溶液和供試品溶液（S6）適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，詳見圖1。結(jié)果，各待測成分峰與相鄰峰間的分離度良好，分離度均大于1.5，理論板數(shù)以柚皮苷峰計(jì)大于? ?4 000，對稱因子為0.95～1.05。

2.3.2 線性關(guān)系考察 分別取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液1.0、2.0、3.0、5.0、8.0、10.0 mL，置于10 mL量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，制成系列質(zhì)量濃度混合對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標(biāo)（y）、各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行線性回歸。結(jié)果，12個成分在各自檢測質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好，結(jié)果詳見表3。

表3 12個成分的線性關(guān)系考察結(jié)果

2.3.3 檢測限與定量限試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，加70%甲醇逐級稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為3 ∶ 1時得檢測限，信噪比為10 ∶ 1時得定量限，結(jié)果見表4。

表4 12個成分的檢測限與定量限測定結(jié)果

2.3.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各成分的保留時間和峰面積。結(jié)果，各色譜峰峰面積的 RSD 為1.68%～2.78%（n=6），表明儀器的精密度良好，詳見表5。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批供試品（S6），平行取樣6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄各成分的保留時間和峰面積，并按外標(biāo)法計(jì)算各成分含量。結(jié)果，各成分含量的RSD為1.77%～2.98%（n=6），表明該方法的重復(fù)性良好，詳見表5。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（S6），分別在室溫下放置0、2、4、8、12、18、24 h 時按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄各成分的保留時間和峰面積。結(jié)果，各色譜峰峰面積的RSD 為 1.77%～2.86%（n=7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，詳見表5。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的衢枳殼樣品（S2）粉末6份，精密稱定適量，分別按各成分已知含量的100%加入混合對照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算各待測成分含量并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，12種成分的平均加樣回收率在98.18%～103.13%之間，RSD在1.49%～2.38%之間，表明本方法的準(zhǔn)確度良好，詳見表6。

2.3.8 樣品的含量測定 取不同采集地的10批衢枳殼樣品粉末各約0.2 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算各成分含量，每批樣品平行3份測定，取平均值，結(jié)果詳見表7。

從表7可知，圣草次苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮內(nèi)酯、木犀草素、橙皮內(nèi)酯、川陳皮素、桔皮素、橙皮油內(nèi)酯等12個黃酮類成分的含量分別為1.995 5～2.648 8、4.317 7～5.005 1、33.215 5～34.054 6、3.140 4～3.471 5、3.221 2～3.748 8、42.746 6～44.026 6、0.202 7～0.239 4、0.191 2～0.208 8、0.080 3～0.097 9、0.291 9～0.307 1、0.119 9～0.149 1、0.082 7～0.089 8 mg/g。其中，常山縣所產(chǎn)的衢枳殼樣品（S1～S4）各成分的含量均高于江山、柯城、衢江和龍游所產(chǎn)樣品（S5～S10）。常山作為衢枳殼的原產(chǎn)地和道地產(chǎn)區(qū)，表現(xiàn)出一定的地域優(yōu)勢，值得進(jìn)一步研究和開發(fā)。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

筆者在前期試驗(yàn)中采用HPLC-二級管陣列檢測器對12個成分對照品分別進(jìn)行光譜綜合分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在330 nm波長處各成分均有較強(qiáng)紫外吸收，且均無末端吸收，因此選擇以330 nm作為檢測波長。

3.2 提取參數(shù)的選擇

在供試品溶液的提取中，筆者對提取溶劑（50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇）、提取方式（超聲、回流）、提取時間（10、20、30 min）、取樣量（0.1、0.2、0.3 g）進(jìn)行了篩選。綜合考慮所得色譜峰的峰面積、分離度、峰形和供試品制備方法的簡單、高效、易操作等因素，最終確定取樣量為0.2 g，提取溶劑為70%甲醇50 mL，提取方式為超聲，提取時間為30 min。

3.3 色譜條件的考察

在色譜條件的優(yōu)化中，筆者考察了實(shí)驗(yàn)室常見的幾種色譜柱，即Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、 Agilent Eclipse C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Extend C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和 Diamond C18（250 mm×46 mm，5 μm）。從保留時間、對稱因子和分離度等方面對供試品溶液的色譜分離效果進(jìn)行綜合評價，結(jié)果各組分均能達(dá)到有效分離，其中Agilent Extend C18分離得到的色譜峰峰形良好，分析時間較短，且能在較低的柱壓下實(shí)現(xiàn)快速、高效地分離。另外，在25、30、35 ℃的柱溫條件下進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，不同柱溫下各化合物均能達(dá)到有效分離，35 ℃下分離最佳且保留時間較短。

綜上，本文建立的方法準(zhǔn)確可靠、簡便、高效，可全面、準(zhǔn)確地同時測定衢枳殼中12個指標(biāo)性成分的含量，從而為衢枳殼質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的完善提供了參考依據(jù)，并為其他枳殼類相關(guān)藥材及其炮制品的多指標(biāo)成分含量的同時測定提供了參考。

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（收稿日期：2019-09-25 修回日期：2019-11-04）

（編輯：劉 萍）