NLRP3基因多態(tài)性與中國北方東部漢族人群帕金森病相關(guān)性研究☆

王慧敏 劉賢 李珊珊 金佳寧 白新玲 謝安木○☆

帕金森病（Parkinson disease，PD）是僅次于阿爾茨海默病的第二大中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，PD的致病機(jī)制尚不明確，近年來，炎癥在PD及其并發(fā)癥中的作用引起了人們的廣泛關(guān)注，目前越來越多的研究表明炎癥可通過介導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元變性導(dǎo)致PD發(fā)病[1-3]。核苷酸結(jié)合域樣受體蛋白3（NLRP3）炎性小體在炎癥過程中起重要作用，其結(jié)構(gòu)由NLRP3、銜接蛋白、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)蛋白和促炎性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1組成[4]。通過病原體相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式激活后，NLRP3組裝并導(dǎo)致成熟促炎細(xì)胞因子如IL-1等分泌。研究發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP3炎癥小體激活可導(dǎo)致1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶（1-menthyl-4-phenyl-1,2,3,6 tetrahydropyridine,MPTP）模型PD中的多巴胺能神經(jīng)元變性[5]。多項(xiàng)研究表明NLRP3基因多態(tài)性與許多免疫炎癥疾病有關(guān)，如阿爾茨海默病[6]，2型糖尿病[7]，先兆子癇[8]等。據(jù)研究報告，位于內(nèi)含子7的rs4612666可影響NLRP3的表達(dá)[9]，最新研究發(fā)現(xiàn)rs7525979位點(diǎn)位于核苷酸寡聚結(jié)構(gòu)域 （nucleotide-binding oligomerization,NACHT），其多態(tài)性與美國羅克維爾市人群帕金森病有關(guān)[10]，但是我國尚無PD中此位點(diǎn)的研究報告。綜合分析推測，本研究從NLRP3基因上選取了這2個重要位點(diǎn)，旨在探討中國北方東部漢族人群NLRP3基因多態(tài)性與帕金森病的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 連續(xù)收集2017年12月至2019年3月就診于青島大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診及住院的400例PD患者納入PD組，其中男214例，女186例，早發(fā)型PD 65例（發(fā)病年齡≤50歲），晚發(fā)型PD 335例（發(fā)病年齡＞50歲）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合英國帕金森病協(xié)會腦庫臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]；②年齡＞45歲，性別不限；③中國北方東部漢族人群；④排除家族性帕金森病、繼發(fā)性帕金森病以及其他神經(jīng)系統(tǒng)或精神疾病。另外收集同期該地區(qū)年齡、性別種族相匹配，且家族中無神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病家族史的健康體檢者400例納入對照組,其中男221例，女179例。本研究通過青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn) （倫理編號：QYFYWZLL25603），所有的研究對象均知情并簽署知情同意書。

1.2 研究方法 采集研究對象外周靜脈血2 mL于EDTA抗凝管中。使用TIANamp Blood DNA Kit試劑提取外周血DNA。應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性 （polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism,PCRRFLP）方法分離基因型，PCR引物序列使用Gene tool(Primer Premier 5.0)設(shè)計。rs4612666的 PCR 引物序列:F:TGCTTAAGGCCATTAATTGTG，R:CTCCACCATGGACAAGGAAG。rs7525979的PCR引物序 列 ：F:CACGACTGCGTCTCATCAA，R:ACGCCCAGTCCAACATCA。

PCR 反應(yīng)體系共 25 μL，包括 DNA 模板 3 μL，上下游引物各 1 μL，2×TaqMasterMix 12.5 μL，雙蒸水 7.5 μL，rs4612666 的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 3 min；95℃變性 30 s，57℃退火 30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)，72℃延伸 7 min。 rs7525979的反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 4min，94℃變性 30s，62.2℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)后，72 ℃延伸5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，6 μL的PCR產(chǎn)物使用限制性內(nèi)切酶 BbsI （rs4612666）37 ℃溫水浴 4 h；TspRI（rs7525979）65℃溫水浴 2 h， 進(jìn)行酶切反應(yīng)，7 μL PCR酶切產(chǎn)物加樣于2.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行凝膠電泳后，使用紫外儀成像觀察并拍照。為了驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性，隨機(jī)選取10%的樣本進(jìn)行測序，結(jié)果一致。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)樣本群體代表性（P＞0.05）。計量資料采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；計數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)?；蛐?疾病的相關(guān)性采用logistic回歸分析。以O(shè)R及95%CI表示相對危險度。設(shè)置檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 一般資料顯示病例組與對照組的性別、年齡分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

2.2 Hardy-Weinberg平衡試驗(yàn) PD組與對照組NLRP3基因 rs4612666、rs7525979基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律 （P＞0.05）（表2）。

2.3 SNPs與帕金森病的關(guān)聯(lián)性分析 如表2所示，在PD組與對照組之間，使用logistic回歸分析，校正年齡、性別因素。PD組中rs4612666多態(tài)位點(diǎn)CC基因型頻率顯著低于對照組 （OR=0.621,95%CI：0.417～0.926,P=0.019），兩組等位基因頻率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，攜帶C等位基因降低 PD 發(fā)病風(fēng)險 （OR=0.794，95%CI：0.653～0.967，P=0.021）。在隱性遺傳模式（CC/TT+TC）分析中有顯著差異（P=0.015）。rs7525979多態(tài)位點(diǎn)的基因型及基因頻率分布在PD組與對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，且在不同遺傳模型分析下差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4 SNPs與帕金森病性別年齡分層的關(guān)聯(lián)性分析如表3所示，運(yùn)用logistic回歸分析，校正年齡因素，在rs4612666多態(tài)性位點(diǎn)，女性PD患者C等位基因頻率及CC基因型較對照組顯著減少（OR=0.644,95%CI：0.481～0.863，P=0.003；OR=0.420,95%CI：0.234～0.756,P=0.004）。 運(yùn)用logistic 回歸分析，校正性別因素，早發(fā)型PD患者C等位基因頻率較對照組顯著降低 （OR=0.636,95%CI：0.437～0.926,P=0.018）。在隱性遺傳模型中，女性PD和早發(fā)型PD與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002，P=0.013）。 表 4 示，rs7525979 位點(diǎn)的基因分布及基因頻率在年齡及性別亞組分析中，與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 PD組與對照組的人口學(xué)資料

表2 PD組和對照組NLRP3基因各SNP位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)炎癥可能在PD的發(fā)病機(jī)制中起重要的作用[12-14]。NLRP3作為近年來研究熱點(diǎn)，在PD發(fā)病中起關(guān)鍵作用。NLRP3基因位于1q44染色體上，編碼蛋白產(chǎn)物為NOD樣受體家族成員。先前研究證實(shí)NLRP3基因多態(tài)性的多個位點(diǎn)突變易患常見的炎癥性疾病[15]。研究發(fā)現(xiàn)激活NLRP3炎性小體促進(jìn)炎性細(xì)胞因子IL-β分泌表達(dá)，加重神經(jīng)炎癥，促進(jìn)PD發(fā)展[16-19]。NLRP3介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥可能導(dǎo)致PD中多巴胺神經(jīng)元變性，加重PD的過程[20]，2018年 QIAO等[21]研究發(fā)現(xiàn)MPTP模型中NLRP3的表達(dá)上調(diào)且抑制肝臟中NLRP3炎性小體的激活可以減輕MPTP引起的神經(jīng)損傷，表明NLRP3炎性小體激活可能與PD的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。此外2018年VON HERRMANN等[10]通過組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)PD患者中腦多巴胺神經(jīng)元的NLRP3表達(dá)升高。這些研究表明NLRP3可能是PD的合理的功能候選基因。

表3 NLRP3基因rs4612666位點(diǎn)亞組基因型及等位基因頻率比較

表4 NLRP3基因rs7525979位點(diǎn)亞組基因型及等位基因頻率

本研究是首次在中國北方東部漢族人群中探討NLRP3基因多態(tài)性與帕金森病的關(guān)系。結(jié)果顯示NLRP3基因rs4612666位點(diǎn)多態(tài)性與PD易感性有關(guān)，PD組CC基因型以及C等位基因頻率均顯著低于對照組，提示該位點(diǎn)CC基因型及C等位基因攜帶者患PD的風(fēng)險降低，C等位基因可能是一個獨(dú)立的保護(hù)性因素。對于rs7525979位點(diǎn)多態(tài)性分析中尚未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異。在性別分層分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rs4612666位點(diǎn)基因型及基因頻率分布在女性PD與對照組間有統(tǒng)計學(xué)差異，而對男性PD的發(fā)生無顯著影響。我們推斷PD的發(fā)病機(jī)制可能在性別上有所不同。此外，在年齡分層分析顯示rs4612666位點(diǎn)的基因型分布在早發(fā)PD與對照組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，我們推測遺傳因素可能在PD發(fā)病年齡的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

rs4612666多態(tài)性位于內(nèi)含子7中。2009的HITOMI等[9]以及2017的ZHAO等[22]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與T等位基因相比rs4612666的C等位基因可通過提高轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子的作用或增加mRNA的穩(wěn)定性進(jìn)而提高mRNA的表達(dá)量，并增強(qiáng)NLRP3表達(dá)。而且C等位基因與食物引起過敏反應(yīng)、阿司匹林引起的哮喘和ASA20的風(fēng)險增加有關(guān)。而2015年CHENG等[23]對急性腎盂腎炎和急性葉性腎炎研究顯示病例組的 CC基因型顯著低于對照組，CC基因型可能是急性腎盂腎炎和急性葉性腎炎的保護(hù)性因素。同樣，我們發(fā)現(xiàn) rs4612666等位基因C及基因型CC可能降低中國北方東部漢族人群患PD的風(fēng)險，這表明C等位基因中較高的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子活性可能不適用于我們的研究結(jié)果。不同的疾病及種族人群可能解釋這些相反的結(jié)果，因部分NLRP3 SNPs在HapMap人群中具有不同的等位基因頻率。此外我們也無法排除rs4612666與目前尚未確定的可能調(diào)控該基因表達(dá)或功能的偶然變異之間存在強(qiáng)連鎖不平衡的可能性。但我們尚未進(jìn)行任何實(shí)驗(yàn)來研究rs4612666如何影響NLRP3炎性小體的表達(dá)，可以進(jìn)一步研究NLRP3影響PD發(fā)病的分子機(jī)制。rs7525979位于NACHT結(jié)構(gòu)域，2018年VON HERRMANN等[10]研究發(fā)現(xiàn)rs7525979與降低PD發(fā)病風(fēng)險有關(guān)。而我們的研究尚未發(fā)現(xiàn)rs7525979位點(diǎn)多態(tài)性與PD發(fā)病風(fēng)險相關(guān)，種族差異和相對較小的樣本量可能是造成不同結(jié)果的原因。

近年來發(fā)現(xiàn)基因多態(tài)性與PD臨床癥狀相關(guān)。2019 年 SI等[24]發(fā)現(xiàn) ɑ-突觸核蛋白（SNCA）rs11931074多態(tài)性可能會調(diào)節(jié)中國PD患者的腦功能并與運(yùn)動癥狀嚴(yán)重程度有關(guān)。2019年ZHI等[25]發(fā)現(xiàn)多巴胺受體D3（DRD3）基因Ser9Gly多態(tài)性可能與PD患者以快感不足為特征的抑郁癥嚴(yán)重程度有關(guān)。2012年DE LAU等[26]發(fā)現(xiàn)兒茶酚胺氧位甲基轉(zhuǎn)移酶（COMT）Val158Met基因多態(tài)性與PD運(yùn)動障礙有關(guān)。這些研究表明基因多態(tài)性與PD臨床特征有關(guān)。本研究在發(fā)現(xiàn)NLRP3基因多態(tài)性與PD發(fā)病風(fēng)險的基礎(chǔ)上，未來需進(jìn)一步就臨床特征的相關(guān)性進(jìn)行研究，闡明分子機(jī)制，為PD分子標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和診斷治療提供依據(jù)。

本研究是單中心研究，因此樣本量相對較少及SNPs位點(diǎn)數(shù)量有限，NLRP3基因多態(tài)性與PD相關(guān)性仍需繼續(xù)觀察，因此對關(guān)聯(lián)性結(jié)論推斷需謹(jǐn)慎。結(jié)論需要在大樣本人群、多中心的臨床研究中進(jìn)一步加以驗(yàn)證。