亞臨界水提取蘆葦多酚的工藝優(yōu)化及抗氧化性能研究

劉莎

巴音郭楞職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆 庫爾勒 841000

蘆葦為多年生草本植物，是一種在水陸交錯(cuò)帶中易生存的禾本科蘆葦屬植物，它繁殖能力強(qiáng)，具有極高的產(chǎn)量[1]。在水生植物的應(yīng)用中，蘆葦也是當(dāng)今國(guó)際公認(rèn)的挺水植物優(yōu)勢(shì)品種[2]。我國(guó)蘆葦資源豐富，主要分布在東北三江平原、黃河三角洲、新疆、河北白洋淀等地區(qū)[3]。其中,新疆博斯騰湖中生長(zhǎng)的蘆葦有籍可查就有兩千多年的歷史，博斯騰湖蘆葦產(chǎn)區(qū)也是我國(guó)四大蘆葦產(chǎn)區(qū)之一[4]，該地區(qū)產(chǎn)出的蘆葦光熱條件好、光照時(shí)間長(zhǎng)、早晚溫差大，蘆葦粗長(zhǎng)[5]。然而一直以來蘆葦傳統(tǒng)的應(yīng)用領(lǐng)域主要集中在造紙、建筑等方面[6]，其實(shí)蘆葦也是很好的藥食同源植物，傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為蘆根具有養(yǎng)陰、清熱、利尿的解毒功能[7]，此外蘆葦體內(nèi)所含的活性類物質(zhì)還有較好的保健功效[8-10]。

植物多酚為單寧的前體化合物以及聚合物，它主要分為水解單寧和縮合單寧等，廣義上還包括小分子酚類化合物，如花青素、兒茶素、沒食子酸等天然酚類[11-12]。多酚是植物中重要的次生代謝產(chǎn)物，多酚類物質(zhì)可以通過提供氫原子或螯合劑來抑制氧化作用，這一作用，使其具有較強(qiáng)的抗氧化能力和清除自由基能力[13]。近年來，多酚類物質(zhì)的抗氧化性及其與小分子的協(xié)同抗氧化性能也備受關(guān)注[14]，其實(shí)多酚物質(zhì)除了具有抗氧化作用以外，還具有抑菌、抗癌等功效，因此植物多酚也被廣泛用于食品、藥品等諸多領(lǐng)域。

近年來，隨著現(xiàn)代中藥的不斷發(fā)展，多酚類物質(zhì)的提取工藝也不斷被優(yōu)化。除了常見的溶劑提取法以外，超聲波提取、微波輔助提取以及脈沖電場(chǎng)等技術(shù)也被廣泛運(yùn)用[15]。亞臨界水提取法是一種綠色、無化學(xué)溶劑殘留的高效提取方法，被應(yīng)用于眾多中藥、植物、食品中具有生物活性物質(zhì)的提取[16]。水在亞臨界狀態(tài)下會(huì)隨著溫度的變化由強(qiáng)極性向非極性過渡，這樣一種連續(xù)的過程勢(shì)必較大程度地提取出活性目標(biāo)物質(zhì)[17]，近些年該技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物多酚的提取。本文旨在利用亞臨界水提取法找尋博斯騰湖中蘆葦多酚類物質(zhì)的最佳提取工藝，并對(duì)其提取物進(jìn)行抗氧化活性的初探。

1 材料

1.1 儀器

5300PC型紫外-分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)；BS210S型電子天平(德國(guó)賽多利斯)；HH-SA超級(jí)恒溫水浴(金壇市醫(yī)療儀器廠)；CSF-1A超聲波發(fā)生器(上海超聲儀器廠)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；DHP-420電熱恒溫培養(yǎng)箱(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)；水熱反應(yīng)釜(上海貝倫儀器廠)。

1.2 試藥

蘆葦2017年10月采自新疆博斯騰湖畔及焉耆包兒海鄉(xiāng)開來提村，由巴音郭楞職業(yè)技術(shù)學(xué)院孫紅艷副教授鑒定為正品。

沒食子酸(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110831-200803)；乙醇、甲醇、丙酮、福林-酚試劑、無水碳酸鈉、鄰二氮菲、H2O2、FeSO4·7H2O、Na2HPO4、NaH2PO4(分析純)；二苯代苦味酰肼自由基(DPPH·，Sigma-Aldrich 公司)。

2 方法

2.1 樣品的預(yù)處理

將預(yù)曬干的蘆葦桿和葉分別在70 ℃下烘5 h后，粉碎并過80目篩，繼而避光干燥的環(huán)境中保存。

2.2 提取實(shí)驗(yàn)

稱取1.0 g蘆葦葉分別以50 mL甲醇、乙醇(95%)、乙醇(50%)、丙酮為提取溶劑，提取溫度40 ℃，超聲頻率為30 kHz下提取30 min，減壓抽濾并定容至100 mL容量瓶中待測(cè)。

稱取0.5 g蘆葦葉放入25 mL水熱反應(yīng)釜中，加入15 mL蒸餾水，待烘箱溫度升至180 ℃時(shí)將反應(yīng)釜放入烘箱預(yù)熱5 min后開始計(jì)時(shí)。反應(yīng)2 h后，取出反應(yīng)釜水冷20 min減壓抽濾，并定容至100 mL容量瓶中待測(cè)。

分別對(duì)亞臨界提取方法中的溫度、料液比、時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化。

2.3 定量實(shí)驗(yàn)

真空干燥至恒重的沒食子酸為對(duì)照品，移取質(zhì)量濃度分別為0.86、17.72、35.44、53.16、70.88、88.6 μg·mL-1的溶液1 mL于10 mL容量瓶中，依次加入1 mL去離子水，0.5 mL福林-酚試劑，混勻靜置5 min，加入26.7%Na2CO3溶液1.5 mL。室溫避光待反應(yīng)2 h后于760 nm下測(cè)定吸光度[18]。

2.4 抗氧化實(shí)驗(yàn)

以甲醇為溶劑配制成濃度為0.04 mg·mL-1的DPPH·溶液，取1 mL樣品于試管中，加入3 mL DPPH·溶液，常溫避光放置40 min后，于517 nm處測(cè)其吸光度(A樣)(空白對(duì)照組用1 mL甲醇代替樣品)測(cè)其吸光度(A空)[19]。DPPH·清除率按公式(1)計(jì)算。

E=[1-A樣/A空]×100%

(1)

取0.75 mmol·L-1鄰二氮菲溶液1 mL于比色管中，依次加入PBS液2 mL、蒸餾水1 mL，混勻后加0.75 mmol·L-1硫酸亞鐵液1 mL，0.01% H2O21 mL，在37 ℃下反應(yīng)60 min，于536 nm處測(cè)其吸光度(AP值)；以1 mL蒸餾水代替AP值實(shí)驗(yàn)過程中的1 mL H2O2(AB值)；以1 mL試樣液代替AP值實(shí)驗(yàn)過程中的1 mL蒸餾水(AS值)[20]?！H清除率按公式(2)計(jì)算。

d=[(AS-AP)/(AB-AP)]×100%

(2)

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007及Origin 8.0軟件處理。

3 結(jié)果討論

3.1 福林酚測(cè)定多酚方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以吸光度為縱坐標(biāo)，沒食子酸質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.010X+0.066 27，線性范圍8.86～88.6 μg·mL-1，r=0.999 2(n=6)。

3.2 提取溶劑對(duì)多酚提取率的影響

不同提取溶劑對(duì)多酚提取率的影響見圖1。

圖1 不同溶劑對(duì)多酚提取率的影響

由圖1可知，亞臨界水對(duì)蘆葦多酚的提取率與實(shí)驗(yàn)所選有機(jī)及復(fù)配溶劑提取率較為接近。但考慮到亞臨界水提取法無毒、無溶劑殘留、提取效率高、能耗低、適合食品及藥品生產(chǎn)等諸多優(yōu)勢(shì)[21]，因此本文著重優(yōu)化了亞臨界水提取蘆葦多酚的工藝條件。

3.3 單因素試驗(yàn)

3.3.1料液比對(duì)提取率的影響 由圖2可知，多酚提取率隨著料液比的減小整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，其中在1∶10～1∶40上升速率最快，而越過1∶40上升趨勢(shì)趨于平緩，但考慮到料液比繼續(xù)減小會(huì)給后期濃縮帶來較大的工作量，因此料液比初選為1∶40。

圖2 料液比對(duì)多酚提取率的影響

3.3.2溫度對(duì)提取率的影響 見圖3。

圖3 溫度對(duì)多酚提取率的影響

由圖3可知，多酚提取率隨著反應(yīng)溫度的升高整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，其中在140～160 ℃上升速率最快，而越過180 ℃提取率基本維持不變，考慮到溫度繼續(xù)加大會(huì)使得工藝能耗加大，因此溫度初選為180 ℃。

3.3.3時(shí)間對(duì)提取率的影響 見圖4。

圖4 時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響

由圖4可知，提取時(shí)間越長(zhǎng)多酚的提取率升高，這是一個(gè)累積的過程。其中在60 min后提取率變化較為平緩，但考慮到到溶出時(shí)間加長(zhǎng)可能會(huì)增加雜質(zhì)的溶出量，這樣會(huì)給后期的純化帶來較大工作量，綜合分析提取時(shí)間初選為60 min。

3.3.4正交試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選定了一定范圍的提取溫度、提取時(shí)間及料液比L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 亞臨界水水提取蘆葦多酚工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

由表1數(shù)據(jù)可知，在選定的因素范圍之內(nèi)，影響蘆葦提取率最大的因素為反應(yīng)溫度，其次為反應(yīng)時(shí)間，再次為料液比。其中反應(yīng)溫度越高、反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)、料液比越大越有利于多酚的溶出。經(jīng)過正交試驗(yàn)極差分析，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化工藝條件為浸提溫度200 ℃、料液比1∶30、浸提時(shí)間為120 min，而試驗(yàn)組合中最佳工藝條件確為浸提溫度200 ℃、料液比1∶40、浸提時(shí)間為120 min。經(jīng)過分析兩者結(jié)果略有差異，為了確定最優(yōu)的工藝條件，還應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行料液比的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。因此，在浸提溫度200 ℃、浸提時(shí)間為120 min的條件下，實(shí)驗(yàn)又測(cè)定了料液比為1∶30和1∶40時(shí)的多酚提取率，結(jié)果顯示當(dāng)料液比為1∶30時(shí)，提取率為(3.87±0.02)%；當(dāng)料液比為1∶40時(shí)，提取率為(4.16±0.06)%。

從結(jié)果分析，料液比1∶40的提取率明顯高于1∶30，由此確立最佳料液比為1∶40。因此最優(yōu)提取工藝條件為浸提溫度200 ℃、料液比1∶40、浸提時(shí)間為120 min。

3.3.5放大試驗(yàn)結(jié)果 放大試驗(yàn)是在提取溫度200 ℃、提取時(shí)間120 min、料液比1∶40的最優(yōu)提取條件下將物料放大100倍完成的測(cè)定。結(jié)果顯示，放大試驗(yàn)的多酚提取率為(3.53±0.02)%。

經(jīng)對(duì)比，放大試驗(yàn)的提取率小于原試驗(yàn)提取率，原因可能在于物料增多后靜置反應(yīng)容器反應(yīng)可能不均勻，導(dǎo)致未能高效地提取多酚。后期可通過振蕩或超聲、微波輔助預(yù)處理等手段加以提高。

3.3.6水、陸生蘆葦葉、莖多酚的測(cè)定結(jié)果比較 在已優(yōu)化的最優(yōu)提取工藝條件下，分別以水生蘆葦葉、莖及陸生蘆葦葉、莖4種原料為試材，測(cè)定其多酚含量依次：水生蘆葦葉4.22%、水生蘆葦莖3.36%、陸生蘆葦葉3.50%、陸生蘆葦莖3.49%。水生蘆葦葉中多酚含量明顯高于其他3種試材。

3.3.7蘆葦葉、莖抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在已優(yōu)化的最優(yōu)提取工藝條件下，分別提取了以水生蘆葦葉、莖及陸生蘆葦葉、莖4種原料的多酚試樣，進(jìn)行了·OH和DPPH·自由基的清除能力測(cè)定，結(jié)果見表2，

表2 ·OH和DPPH·自由基的清除能力 %

結(jié)果可知，在相同提取工藝條件下，水生蘆葦葉中多酚含量明顯高于水生蘆葦莖中多酚含量，同時(shí)也高于陸生蘆葦植株中葉、莖中多酚的含量，而陸生蘆葦植株葉、莖多酚含量無明顯差異。水生蘆葦葉清除自由基的能力明顯高于其他3個(gè)樣品，特別是在清除DPPH·實(shí)驗(yàn)中有著絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)，而清除·OH的能力也與多酚總量的大小有著密切關(guān)系(r為0.939 3)。此外陸生蘆葦葉、莖中多酚含量相差無幾，但清除DPPH·卻存在很大差異，這應(yīng)該是由于植株不同部位多酚種類的差異性帶來的結(jié)果。

4 結(jié)論

通過單因素及正交試驗(yàn)，亞臨界水提取法在蘆葦葉多酚的提取過程中對(duì)工藝影響因素的大小依次為浸提溫度>浸提時(shí)間>料液比。最終篩選的最優(yōu)工藝條件為浸提溫度200 ℃、料液比1∶40(g∶mL)、浸提時(shí)間為120 min，在此優(yōu)化條件下多酚提取率可達(dá)4.22%。

通過2種不同的抗氧化能力測(cè)定體系，選擇了水、陸生植株的葉、莖部位進(jìn)行抗氧化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，不同樣品的多酚提取物均能對(duì)·OH和DPPH·自由基有一定的清除能力，特別是在清除·OH的實(shí)驗(yàn)中，清除能力與總多酚含量有明顯的量效關(guān)系，即多酚含量越高清除能力越強(qiáng)。此外，在相同的提取工藝下，水生蘆葦葉中的多酚含量較其他樣品有絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)，并且在相同濃度下，對(duì)DPPH·的清除能力也是最強(qiáng)的。而比較了陸生蘆葦中葉與莖多酚提取物的清除DPPH·能力后，也發(fā)現(xiàn)蘆葦葉多酚提取物的效果更佳，同等濃度下，葉多酚的清除率可達(dá)莖多酚清除率1.9倍，這可能是兩部分的多酚種類存在較大差異的結(jié)果。綜合以上結(jié)果，蘆葦多酚提取物，可作為較好的天然抗氧化劑來源被加以利用。