AMPK介導線粒體融合與裂變在抑制P2X7受體抗神經(jīng)元缺氧/復氧損傷中的作用

王雪如，門運政，胡 淼，洪玉潔，劉心怡，董淑英

缺血性腦卒中是一種嚴重影響人類健康的疾病，目前主要的治療措施是及時恢復血液再灌注，而恢復血液再灌注的過程中會出現(xiàn)缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷[1-2]這一病理生理改變。近年來，針對腦I/R損傷的病理生理機制及如何減輕這一損傷的研究成為熱點。線粒體是為細胞提供能量的細胞器，在生理狀態(tài)下線粒體處于融合與裂變的動態(tài)平衡之中，但當發(fā)生I/R損傷時線粒體趨向于裂變增多[3]，因此抑制線粒體裂變或促進線粒體融合可能是減輕I/R損傷的措施之一。

AMP-activated protein kinase(AMPK)是一種能量傳感器，它在細胞能量代謝調(diào)節(jié)中起著至關重要的作用[4]。研究[5]表明AMPK在調(diào)節(jié)線粒體的形態(tài)和功能中發(fā)揮重要的作用。P2X7受體是一種嘌呤受體，文獻[6-7]報道抑制P2X7受體可以減輕大鼠腦I/R損傷，但具體的作用機制仍需要進一步探討。研究[8]表明，在酒精性肝病中，阻斷P2X7受體能增強AMPK活性。然而抑制P2X7受體產(chǎn)生的抗腦I/R損傷作用是否與AMPK調(diào)控線粒的融合與裂變有關，仍需要進一步研究。亮藍G(Bright Blue G,BBG)是P2X7受體的選擇性抑制劑，可通過抑制PX27受體減輕腦I/R損傷。神經(jīng)元是對缺氧最為敏感的神經(jīng)細胞，因此本實驗采用神經(jīng)元缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)損傷模型模擬在體的小鼠腦I/R損傷,探討AMPK對線粒體的融合與裂變的調(diào)控在抑制P2X7受體抗腦H/R損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 懷孕18～21 d的孕鼠；Bright Blue G(BBG:P2X7受體抑制劑)、Dorsorphin(AMPK抑制劑)、45%葡萄糖、多聚賴氨酸均購于Sigma公司；神經(jīng)元培養(yǎng)液、B27、pen-strep、左旋谷氨酰胺、DMEM/F12培養(yǎng)粉、無糖DMEM培養(yǎng)粉均購于Gibco公司；胎牛血清購于四季青公司；p-AMPK單克隆抗體、p-Drp1單克隆抗體、Mfn2單克隆抗體均購于CST公司；GAPDH單克隆抗體購于Proteintech公司；山羊抗小鼠IgG二抗、山羊抗兔IgG二抗均購于biosharp公司。

1.2 神經(jīng)元細胞原代培養(yǎng) 處死孕鼠取出胎鼠，在無菌環(huán)境下斷頭取腦，剪碎。加入0.125%胰酶消化10 min，每隔5 min震蕩一次。消化完成后加入等量含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，在1 500 r/min的條件下離心5 min，棄去上清液后加入適量培養(yǎng)液再次離心。離心完成后加入適量含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液吹打均勻，靜置收集細胞，所有操作都在冰上進行。將收集到的細胞調(diào)整好密度種于孔板之中，于37 ℃、5%CO2、95%O2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)9～12 d后進相關實驗。

1.3 分組、給藥及H/R損傷模型制備 神經(jīng)元細胞隨機分為正常對照(Control)組、H/R組、H/R+BBG組、H/R+BBG+Dorsomorphin組。BBG于缺氧時加入，終濃度為50 nmol/L[6]；Dorsomorphin于復氧時加入，終濃度為10 μmol/L[9]。神經(jīng)元細胞培養(yǎng)9～12 d后棄去正常的神經(jīng)元培養(yǎng)液，更換為無糖無血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，置于37 ℃、1%O2、5%CO2、94%N2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h。2 h后將DMEM/F12培養(yǎng)液更換為正常的神經(jīng)元培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2、95%O2培養(yǎng)箱內(nèi)復氧24 h。除Control組不做處理外，剩余組別均進行H/R操作以及不同的給藥處理。模型制備完成后再進行后續(xù)的實驗操作。

1.4 細胞存活率檢測 采用Calcein-AM/PI雙染法檢測細胞存活率。神經(jīng)元細胞復氧24 h后，用PBS清洗3次，每次5 min。避光加入配制好的Calcein-AM/PI染液，于37 ℃、5%CO2、95%O2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育15 min。孵育完成后用PBS清洗3次，每次5 min。之后在熒光顯微鏡下觀察強弱熒光變化。紅色熒光代表死細胞，綠色熒光代表活細胞。

1.5 線粒體形態(tài)檢測 采用Mito TrackerTMGreen FM試劑盒檢測線粒體形態(tài)。神經(jīng)元細胞復氧24 h后，用PBS清洗3次，每次5 min。加入Mito TrackerTMGreen FM染液，于37 ℃、5% CO2、95% O2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育45 min。孵育完成后用PBS清洗，之后在共聚焦顯微鏡下觀察線粒體的形態(tài)變化。

1.6 活性氧(ROS)檢測 采用ROS試劑盒檢測ROS的含量。神經(jīng)元細胞復氧24 h后，用PBS清洗3次，每次5 min。避光加入配制好的ROS染液，于37 ℃、5% CO2、95% O2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min。孵育完成后用PBS清洗3次，每次5 min。之后在熒光顯微鏡下觀察熒光強弱變化。為綠色熒光，熒光強度越強代表ROS含量越高。

1.7 Western blotting檢測 p-AMPK、p-Drp1、Mfn2蛋白的表達細胞復氧24 h后，用PBS清洗3次，每次5 min。加入0.25%的胰酶消化細胞，收集至離心管中，于2 500 r/min條件下離心10 min。離心完成后棄去上清液，加入適量裂解液于冰上裂解30 min。之后在4 ℃離心機中以12 000 r/min的條件離心30 min。收集上清液，一部分用于測定蛋白濃度，一部分用于蛋白定量。按照蛋白分子量的大小配制不同濃度的SDS-聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離蛋白質(zhì)。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上,將膜用TPBS (0.05%Tween-TBS) 配制的5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后,分別孵育p-AMPK、p-Drp1、Mfn2等一抗，于4 ℃冰箱中孵育過夜。一抗孵育完成后用TPBS將膜清洗3次，每次5 min，再與過氧化物標記的二抗孵育2 h后，將膜用TPBS清洗3次,每次5 min。加入ECL顯色液,在凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影，采集蛋白條帶。最后用Image J軟件對所得蛋白條帶進行灰度值分析。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用方差分析及q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 抑制P2X7受體對H/R損傷神經(jīng)元細胞死亡率的影響 采用Calcein-AM/PI雙染法檢測細胞死亡率，紅色代表死細胞、綠色代表活細胞,結(jié)果見圖1。與Control組相比，H/R組細胞死亡率明顯增加(P<0.01)；但在使用BBG抑制P2X7受體之后，細胞死亡率則明顯降低(P<0.01)；而與H/R+BBG組相比，在抑制P2X7受體的基礎上進一步使用Dorsomorphin抑制AMPK后，H/R損傷神經(jīng)元細胞的死亡率又明顯增加(P<0.01)(見表1)。

分組死亡率/%FPMS組內(nèi)Control組 6.82±1.27 H/RH/R+BBG組 49.35±3.27?? 27.5±2.11??##260.30<0.014.929 H/R+BBG+Dorsomorphin組 36.65±1.72??##△△

q檢驗：與Control組比較**P<0.01;與H/R組比較##P<0.01；與H/R+BBG組比較△△P<0.01

2.2 抑制P2X7受體對線粒體融合與裂變的影響 采用Mito TrackerTMGreen FM試劑盒檢測線粒體形態(tài)，結(jié)果見圖2。與Control組相比，H/R組細胞線粒體的長度變短；但在使用BBG抑制P2X7受體之后，H/R損傷神經(jīng)元細胞線粒體的長度增加；然而與H/R+BBG組相比，在抑制P2X7受體的基礎上進一步使用Dorsomorphin抑制AMPK后，H/R損傷神經(jīng)元細胞線粒體的長度又變短。

2.3 抑制P2X7受體對H/R損傷神經(jīng)元細胞ROS產(chǎn)生的影響 線粒體是ROS產(chǎn)生的場所，線粒體裂變增多則ROS含量增加。采用ROS試劑盒檢測ROS的含量，熒光強度越強，代表ROS含量越高，結(jié)果見圖3。與Control組相比，H/R組ROS含量明顯增加；但在使用BBG抑制P2X7受體之后，ROS含量則明顯降低；然而與H/R+BBG組相比，在抑制P2X7受體的基礎上進一步使用Dorsomorphin抑制AMPK后神經(jīng)元細胞的ROS含量又明顯增加。

2.4 抑制P2X7受體對H/R損傷神經(jīng)元細胞中p-AMPK表達的影響 采用Western blotting法檢測p-AMPK的表達，結(jié)果見圖4。與Control組相比，H/R組神經(jīng)元細胞p-AMPK的表達明顯降低(P<0.01)；但在使用BBG抑制P2X7受體之后，H/R損傷神經(jīng)元細胞p-AMPK的表達則顯著增加(P<0.01)；然而與H/R+BBG組相比，在抑制P2X7受體的基礎上進一步使用Dorsomorphin抑制AMPK后H/R損傷神經(jīng)元細胞p-AMPK的表達又明顯降低(P<0.01)(見表2)。

2.5 抑制P2X7受體對H/R損傷神經(jīng)元細胞中Mfn2與p-Drp1表達的影響 采用Western blotting法檢測Mfn2、p-Drp1的表達，結(jié)果見圖5。與Control組相比，H/R組神經(jīng)元細胞Mfn2的表達明顯降低(P<0.01)，而p-Drp1的表達則顯著增加(P<0.01)；但在使用BBG抑制P2X7受體之后，H/R損傷神經(jīng)元細胞Mfn2的表達明顯增加(P<0.01)，而p-Drp1的表達則顯著減少(P<0.01)；然而與H/R+BBG組相比，在抑制P2X7受體的基礎上進一步使用Dorsomorphin抑制AMPK后，H/R損傷神經(jīng)元細胞Mfn2的表達又明顯降低(P<0.01)，而p-Drp1的表達則顯著增加(P<0.01)(見表3～4)。

分組灰度值FPMS組內(nèi)Control組1H/R組 0.211±0.483??H/R+BBG組 0.905±0.098##6.32<0.050.082H/R+BBG+Dorsomorphin組 0.393±0.055△△

q檢驗：與Control組比較**P<0.01;與H/R組比較##P<0.01；與H/R+BBG組比較△△P<0.01

3 討論

P2X7受體是P2X家族中的一種ATP門控離子通道，在神經(jīng)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元中廣泛表達[10-11]。研究[12]表明，P2X7受體在損傷后被迅速激活并傳遞活躍的神經(jīng)遞質(zhì)、促炎性趨化分子和細胞因子至靶器官和細胞，最終導致后續(xù)的生物反應。抑制P2X7受體可以減輕腦I/R損傷，在本實驗中，抑制P2X7受體后H/R損傷神經(jīng)元細胞的死亡率降低也證實了這一點，但具體的作用機制仍需進一步研究。

分組灰度值FPMS組內(nèi)Control組1H/R組 0.335±0.069??H/R+BBG組 0.800±0.144##2.61>0.050.100H/R+BBG+Dorsomorphin組 0.382±0.525△△

q檢驗：與Control組比較**P<0.01;與H/R組比較##P<0.01；與H/R+BBG組比較△△P<0.01

分組灰度值FPMS組內(nèi)Control組1H/R 4.445±0.548??H/R+BBG組2.225±0.330##30.60<0.010.162H/R+BBG+Dorsomorphin組 3.225±0.275△△

q檢驗：與Control組比較**P<0.01;與H/R組比較##P<0.01；與H/R+BBG組比較△△P<0.01

線粒體是為細胞生存提供能量的動態(tài)細胞器，在正常狀態(tài)下不斷地經(jīng)歷融合與裂變兩個相反的過程，但當發(fā)生I/R損傷時，其動態(tài)平衡遭到破壞并趨向于裂變，而線粒體的動態(tài)平衡又是決定線粒體功能的重要因素，因此維持線粒體的動態(tài)平衡是治療I/R損傷的一種措施[13]。線粒體是ROS產(chǎn)生的場所，當發(fā)生I/R損傷時線粒體裂變增多，ROS的產(chǎn)生增加，而ROS可以改變線粒體膜電位，線粒體膜電位降低會損害線粒體能量代謝，并通過誘導促凋亡因子從線粒體漏入細胞質(zhì)而進一步促進線粒體凋亡激活，從而進一步加重損傷[14-15]。在本實驗中發(fā)現(xiàn)，抑制P2X7受體后H/R損傷神經(jīng)元細胞中線粒體的裂變明顯減少，Mfn2的表達顯著增加而p-Drp1的表達則顯著降低，同時ROS的含量也明顯減少，這些結(jié)果表明抑制P2X7受體可能通過減少線粒體裂變、促進線粒體融合、減少ROS的產(chǎn)生來減輕神經(jīng)元H/R損傷。

AMPK是細胞能量平衡的主傳感器，是細胞碳水化合物和脂肪代謝、ATP保存和合成的基礎調(diào)控因子[16]。近年來的研究[17-18]表明，激活AMPK信號通路可以通過抑制細胞凋亡和氧化應激來減輕神經(jīng)元H/R損傷和腦I/R損傷，但其作用是否與激活AMPK有關尚鮮有文獻報道。本實驗發(fā)現(xiàn)，抑制P2X7受體后神經(jīng)元細胞中p-AMPK的表達明顯增加，同時H/R損傷神經(jīng)元細胞的死亡率降低，但在抑制P2X7受體的基礎上進一步抑制AMPK后，神經(jīng)元細胞中p-AMPK的表達明顯減少，H/R損傷神經(jīng)元細胞的死亡率也顯著增加。這些結(jié)果說明，抑制P2X7受體可通過增加p-AMPK的表達來減輕神經(jīng)元H/R損傷。

本實驗結(jié)果表明抑制P2X7受體可以通過減少線粒體的裂變、促進融合來減輕小鼠腦I/R損傷，但是抑制P2X7受體如何調(diào)節(jié)線粒體的融合與裂變尚不清楚。大量研究[15,19-20]表明AMPK與線粒體的動力學和功能密切相關，因此本課題探討在神經(jīng)元H/R損傷中AMPK與線粒體的融合與裂變的關系。結(jié)果表明，抑制P2X7受體后，p-AMPK的表達顯著增加，H/R損傷神經(jīng)元細胞中線粒體裂變減少而融合增多。同時，H/R損傷神經(jīng)元細胞中Mfn2的表達顯著增加而p-Drp1的表達則顯著降低。但在抑制P2X7受體的基礎上進一步抑制AMPK后，神經(jīng)元細胞中線粒體裂變增多而融合減少，且H/R損傷神經(jīng)元細胞中Mfn2的表達顯著降低而p-Drp1的表達則顯著增加。這些結(jié)果表明抑制P2X7受體可以通過調(diào)節(jié)AMPK減少線粒體裂變，促進線粒體融合從而減輕神經(jīng)元細胞H/R損傷。

綜上所述，本研究通過對抑制P2X7受體減輕神經(jīng)元H/R損傷的機制進行探究發(fā)現(xiàn)，抑制P2X7受體可能通過調(diào)節(jié)AMPK抑制線粒體的裂變、促進線粒體的融合，從而發(fā)揮抗神經(jīng)元H/R損傷的作用。