葛根芩連湯對(duì)臨床產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌的抑制作用▲

環(huán) 誠(chéng) 王小平 寇 靜 馮 昭

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)系，陜西省咸陽(yáng)市 712046，電子郵箱：1318807324@qq.com)

大腸埃希菌是人的正常菌群中的常見條件致病菌。大腸埃希菌是醫(yī)院感染的重要致病菌之一,是革蘭陰性桿菌中有代表性的產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)菌種之一，臨床上大腸埃希菌的耐藥性較嚴(yán)重[1-3]。大腸埃希菌對(duì)許多抗生素都具有耐藥性，目前，臨床上使用亞胺培南等碳青霉烯類抗菌藥物治療大腸埃希菌感染，但是此類抗菌藥物價(jià)格高昂，抗菌范圍廣，易導(dǎo)致菌群失調(diào)，因此僅適用于感染嚴(yán)重的患者[4]。

由于極少有細(xì)菌對(duì)中藥產(chǎn)生耐藥性[5]，臨床上中藥復(fù)方對(duì)耐藥細(xì)菌感染的治療效果相對(duì)西藥更具優(yōu)勢(shì)。葛根芩連湯源自《傷寒論》，是東漢末年張仲景的經(jīng)典名方。該方由葛根、黃芩、黃連、炙甘草4味中藥組成，具有輕清解肌、清熱止痢的功效，其在臨床上不僅可用于治療菌痢、輪狀病毒性腸炎、抗生素相關(guān)性腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、腸易激綜合征，還可用于治療糖尿病、高血壓等慢性疾病[6]。本實(shí)驗(yàn)通過分析葛根芩連湯對(duì)產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌和不產(chǎn)ESBLs標(biāo)準(zhǔn)菌株的體外抑菌作用，探討葛根芩連湯是否可通過調(diào)整腸道或腸道外的菌群來發(fā)揮治療腸道感染的作用。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器 MH營(yíng)養(yǎng)瓊脂(批號(hào)：02-275)購(gòu)自北京澳博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；營(yíng)養(yǎng)肉湯(批號(hào)：02-013)購(gòu)自北京澳博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；722E型可見分光光度計(jì)購(gòu)自上海光譜儀器有限公司；9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自上海一恒科技有限公司；FA1104N型電子天平購(gòu)自上海精密科學(xué)儀器有限公司；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱購(gòu)自上海一恒科技有限公司；TS-100C型恒溫?fù)u床購(gòu)自上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；BBS-SDC型潔凈工作臺(tái)購(gòu)自濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；YJT-1OO-I型托盤天平購(gòu)自常熟市天量?jī)x器有限責(zé)任公司；BCD-188K/ACJN型冰箱購(gòu)自青島海爾股份有限公司；RT-2100C酶標(biāo)分析儀購(gòu)自深圳市雷杜電子有限公司；MLS-3780型全自動(dòng)高壓滅菌器購(gòu)自日本SANYO公司。

1.2 菌種來源 共4株菌株用于實(shí)驗(yàn)。其中，兩株為臨床上的產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌(臨床菌株1、臨床菌株2)，由陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科提供，按照第4版《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[7]進(jìn)行分離培養(yǎng)，使用法國(guó)梅里埃公司 VITEK?2 Compact 全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行菌種鑒定。另兩株大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922、ATCC35918購(gòu)自溫州市康泰生物科技有限公司，前者為β-內(nèi)酰胺酶陰性的標(biāo)準(zhǔn)菌株，后者為產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株(含質(zhì)粒編碼的TEM-1基因)。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 藥物預(yù)處理：將葛根、黃連、黃芩、甘草按復(fù)方比例5 ∶3 ∶3 ∶1混煎，使?jié)饪s飲片復(fù)方的初始原濃度為2.21 g/mL(即每毫升含原藥材2.21 g)，高壓蒸汽滅菌備用。

1.3.2 制備細(xì)菌懸液：先將4株菌株接種于平板營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)，放置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，記號(hào)筆標(biāo)記。挑選培養(yǎng)16～20 h后單個(gè)生長(zhǎng)狀態(tài)良好的大腸埃希菌菌落，接種于肉湯培養(yǎng)基中，放置于37℃恒溫?fù)u床上震搖4 h。在分光光度計(jì)上600 nm波長(zhǎng)位置測(cè)細(xì)菌的A值，A值保持在0.01左右。

1.3.3 微量二倍稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度[8]：(1)稀釋藥液、加菌懸液。每株菌株均分為實(shí)驗(yàn)組(5個(gè)濃度)、純藥組、純菌對(duì)照組、純培養(yǎng)基對(duì)照組，在96孔板上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組用二倍法稀釋藥液，將藥液濃度配置為原濃度以及原濃度的1/2、1/4、1/8、1/16，每孔加100 μL藥液后，再加入100 μL菌液，每孔菌液最終濃度為105CFU/mL。純藥組每孔加藥液100 μL和營(yíng)養(yǎng)肉湯100 μL，純菌組每孔加菌液100 μL和營(yíng)養(yǎng)肉湯100 μL，純培養(yǎng)基對(duì)照組每孔加營(yíng)養(yǎng)肉湯200 μL，純藥組的濃度梯度和實(shí)驗(yàn)組一樣。同時(shí)做3個(gè)平行組。(2) 測(cè)A值。將各組的96孔板放入酶標(biāo)儀中，在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)每個(gè)孔的A值，記錄測(cè)定時(shí)間及A值，然后放入37℃的搖床上培養(yǎng)，每隔3 h測(cè)定1次A值，共測(cè)量4次，取3個(gè)平行組的平均值。A值隨著時(shí)間沒有變化的藥物最小濃度可以認(rèn)定為最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)。(4)生長(zhǎng)速度的計(jì)算：以時(shí)間作為橫坐標(biāo)，以A值作為縱坐標(biāo)，繪制折線圖，從每個(gè)折點(diǎn)圖中計(jì)算出每個(gè)曲線的斜率，即細(xì)菌生長(zhǎng)速度。將各濃度實(shí)驗(yàn)組與純菌對(duì)照組的生長(zhǎng)曲線斜率進(jìn)行對(duì)比，斜率大于純菌組時(shí)，說明該濃度的藥物可以促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)，斜率小于純菌組時(shí)說明該濃度的藥物可以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。

1.3.4 涂平板法測(cè)最低殺菌濃度：搖床上連續(xù)震搖測(cè)完A值后(共9 h)，各組在96孔板(即1～8孔)上，用移液槍分別吸取50 μL/孔移到固體培養(yǎng)基上，用玻璃刮鏟涂抹均勻。將制作好的平板放入37℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18 h后觀察結(jié)果。平板上低于5個(gè)菌落，可認(rèn)定此濃度為最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration,MBC)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

2 結(jié) 果

2.1 葛根芩連湯對(duì)4株菌株的MIC及MBC 葛根芩連湯對(duì)臨床菌株1和2的MIC都是原濃度的1/2，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC35918的MIC最小，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922的MIC最大，即葛根芩連湯對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC35918的抑菌效果大于對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922；葛根芩連湯對(duì)臨床菌株1和2的MBC分別是1/2原濃度和原濃度，而葛根芩連湯對(duì)兩株標(biāo)準(zhǔn)菌株均無MBC，即原濃度的平板培養(yǎng)后菌落數(shù)大于5個(gè)。見表1。

表1 葛根芩連湯對(duì)4株大腸埃希菌的MIC和MBC(g/mL)

注：“無”指沒有MBC；g/mL指每毫升含原藥材克數(shù)。

2.2 葛根芩連湯對(duì)臨床菌株及標(biāo)準(zhǔn)菌株生長(zhǎng)速度的影響 原濃度至1/4原濃度的葛根芩連湯均可抑制產(chǎn)ESBLs的臨床菌株1和2的生長(zhǎng)速度。原濃度至1/16原濃度的葛根芩連湯對(duì)產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC35918的生長(zhǎng)都具有抑制作用；1/2原濃度至1/16原濃度的葛根芩連湯對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922的生長(zhǎng)反而具有促進(jìn)作用，其生長(zhǎng)速度快于純菌，即葛根芩連湯對(duì)兩種標(biāo)準(zhǔn)菌株的作用截然相反。見表2。

表2 不同濃度葛根芩連湯干預(yù)下4種大腸埃希菌的生長(zhǎng)速度

注：純菌對(duì)照組中，臨床菌株1、臨床菌株2、標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC35918及ATCC25922的生長(zhǎng)速度分別為0.0923、0.1282、0.1075、0.0945。

3 討 論

20世紀(jì)80年代，國(guó)內(nèi)多項(xiàng)體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，中藥對(duì)腸道細(xì)菌的體外抑菌效果不如西藥[9-10]。但其中大多數(shù)研究都是測(cè)定中藥的MIC，這對(duì)本身抑菌作用并不太強(qiáng)的中藥來說，意義并不大。然而，在臨床上我們發(fā)現(xiàn)中藥及中藥復(fù)方都有比較強(qiáng)的抗感染作用，有學(xué)者認(rèn)為，中藥是通過調(diào)節(jié)人體的免疫系統(tǒng)來對(duì)抗病原微生物的感染[11]。近幾年，有關(guān)中藥針對(duì)細(xì)菌的直接作用研究較少，但隨著對(duì)微生態(tài)的了解和實(shí)驗(yàn)方法技術(shù)的提高，中藥是否可以通過對(duì)菌群的調(diào)節(jié)作用來對(duì)抗各種感染引起了研究人員的重視，尤其是針對(duì)抗生素濫用導(dǎo)致的菌群失調(diào)情況下耐藥性細(xì)菌引起的機(jī)會(huì)感染。

葛根芩連湯單味藥葛根、黃連、黃芩、甘草中的有效成分都有抑菌和抗炎作用[12-13]。復(fù)方葛根芩連湯在臨床上被廣泛應(yīng)用于治療腹瀉和腸炎，甚至糖尿病的足部感染。本研究應(yīng)用微量二倍稀釋法和平板涂布法分別檢測(cè)MIC和MBC，主要觀察葛根芩連湯在體外對(duì)大腸埃希菌耐藥菌株和非耐藥菌株的抑菌作用是否有差異；同時(shí)，考慮到中藥粗提物本身有顏色，所以在測(cè)A值時(shí)采用動(dòng)態(tài)測(cè)定。結(jié)果顯示，葛根芩連湯對(duì)產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌(ATCC35918)的生長(zhǎng)速度有明顯的抑制作用，而對(duì)非耐藥大腸埃希菌(ATCC25922)不僅沒有抑制作用，還提高了細(xì)菌的生長(zhǎng)速度。這表明，葛根芩連湯有調(diào)節(jié)腸道菌群的作用，尤其是針對(duì)長(zhǎng)期應(yīng)用抗生素后的耐藥細(xì)菌的感染。為了進(jìn)一步印證這個(gè)結(jié)論，我們觀察了葛根芩連湯對(duì)來自臨床的兩株產(chǎn)ESBLs菌株體外生長(zhǎng)速度的影響，發(fā)現(xiàn)藥物濃度大的葛根芩連湯對(duì)兩株產(chǎn)ESBLs菌株都有明顯的抑制作用，說明葛根芩連湯可以通過調(diào)整腸道菌群的作用來治療耐藥菌感染。但當(dāng)濃度變小時(shí)，葛根芩連湯對(duì)來自臨床的兩株產(chǎn)ESBLs菌株作用不明顯，并且作用效果不盡相同：原濃度的1/8和1/16葛根芩連湯對(duì)臨床菌株1的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，而對(duì)臨床菌株2有抑制作用。由于來自臨床產(chǎn)ESBLs菌株遺傳背景并不清楚，而臨床產(chǎn)ESBLs菌株的基因型有很多種，不同基因型的產(chǎn)ESBLs菌株對(duì)中藥的敏感性也不盡相同。

葛根芩連湯對(duì)臨床產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌有較好的抑菌及殺菌作用，而對(duì)非耐藥大腸埃希菌的抑制作用弱。因此葛根芩連湯或可通過調(diào)整應(yīng)用抗生素后出現(xiàn)的產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和非耐藥大腸埃希菌的菌群紊亂來治療腸道感染。在今后的研究中可以對(duì)不同基因型的產(chǎn)ESBLs菌株進(jìn)行分型，以及對(duì)葛根芩連湯的有效成分進(jìn)行分離研究，以探索葛根芩連湯對(duì)ESBLs菌株的作用機(jī)制。