殼聚糖-普魯蘭多糖復(fù)合抗菌保鮮膜對(duì)冷鮮牛肉的保鮮效果

張 盼 王俊平

（天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 天津市食品加工過(guò)程控制與安全工程技術(shù)中心 天津300457）

可食膜是以可食性生物大分子為原料， 通過(guò)分子間的交聯(lián)作用形成質(zhì)地均勻， 具有一定機(jī)械強(qiáng)度的薄膜[1]?？墒衬げ粌H具有傳統(tǒng)包裝所具有的阻隔性能， 而且可以作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化物質(zhì)和功能性物質(zhì)的載體。將抑菌劑添加到可食性成膜材料中，抑菌劑會(huì)緩慢釋放， 在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)作用于食品表面，具備抑制微生物生長(zhǎng)的作用[2]。

普魯蘭多糖是一種由霉菌發(fā)酵而成的微生物多糖，無(wú)色無(wú)味，具有良好的成膜性和熱封性。 殼聚糖是由自然界廣泛存在的幾丁質(zhì)通過(guò)脫乙酰作用得到，具有良好的成膜特性，一定的抗菌活性和抗氧化性，不溶于水，可溶于醋酸稀溶液[3]。 ε-PL是目前天然防腐劑中具有優(yōu)良防腐性能的生物類食品防腐劑，安全性高[4]。 ε-PL 性質(zhì)很穩(wěn)定，在較低的pH 條件下依然保持良好的抑菌性。

本文利用普魯蘭多糖和殼聚糖作為成膜基質(zhì)，充分發(fā)揮兩者在成膜特性方面的互補(bǔ)作用，同時(shí)添加ε-PL 作為抑菌劑，制備具有抗菌效果的可食性包裝膜并對(duì)該膜應(yīng)用于冷鮮牛肉的保鮮效果進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料與菌株 主要試劑：殼聚糖（脫乙酰度90%），上海源葉生物科技有限公司；普魯蘭多糖，上海阿拉丁生化科技有限公司；ε-PL，上海源葉生物科技有限公司。

實(shí)驗(yàn)菌株：大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 10305 和ATCC 35150； 單增李斯特菌ATCC 19115（Listeria monocytogenes）；金黃色葡萄球菌ATCC 25923 （Staphyloccocus aureus）； 沙門氏菌CICC 10867（Salmonella enteritidis）；枯草芽孢桿菌CICC 10293（Bacillus subtilis）。 上述菌種均購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 儀器與設(shè)備 SW-CJ-2FD 超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；SP-2102 紫外-可見分光光度計(jì)， 上海光譜儀器有限公司；B-100AP 紫外燈（UVP），美國(guó)；BL610 分析天平，美國(guó)Sartorius 公司；TGL-16C 臺(tái)式離心機(jī)， 上海安亭科學(xué)儀器廠；SY-1-2 電熱恒溫水浴鍋，天津歐諾儀器儀表有限公司；DHP-2042BS 電熱恒溫培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo公司；RH-KT/C 磁力攪拌器， 德國(guó)IKA 公司；CH37M Milli-Q 超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore 公司；HVA-85 高壓滅菌鍋，日本hirayama 公司；HYGIIa 搖瓶柜， 太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；SU-1510 型掃描式電子顯微鏡，日本Hitachi 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 ε-PL 最低抑菌濃度的確定 試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)并稍作修改[5]，采用96 孔板二倍梯度稀釋法，將ε-PL 梯度稀釋質(zhì)量濃度范圍0.125～64 mg/mL，分別將測(cè)試菌金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌在37 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)至測(cè)試菌濃106CFU/mL， 取100 μL 加入到96 孔板中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中加蓋培養(yǎng)24 h。 在OD=600 nm 條件下檢測(cè)吸光度值， 確定ε-PL 的最佳添加量，ε-PL 的最佳添加量為抑菌率達(dá)90%時(shí)的量。

抑菌率=（OD 菌液-OD）/OD 菌液

1.2.2 可食性抗菌保鮮膜的制備 將殼聚糖溶于體積分?jǐn)?shù)為1%的醋酸溶液， 加熱至60 ℃，500～800 r/min 攪拌30 min， 加入普魯蘭多糖和上述試驗(yàn)結(jié)果中的最小抑菌濃度的ε-PL，1%的甘油，繼續(xù)攪拌1～2 h。 按照上述方法分別配制殼聚糖-普魯蘭多糖比例為15-0，15-10，15-15，15-20，0-15，10-15 和20-15 g/L 的混合液 （所制備可食性包裝膜分別標(biāo)記為CP0，CP1，CP2，CP3，PC0，PC1和PC2）。然后靜置12 h，達(dá)到自然脫氣的效果，然后將30 mL 成膜基液澆鑄于規(guī)格為15 cm×15 cm×1 cm 的亞克力材料模具， 室溫干燥48 h， 小心揭起。

1.2.3 可食性抗菌保鮮膜機(jī)械強(qiáng)度測(cè)定 試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[6]， 將抗菌膜樣品裁剪為2 cm×6 cm的矩形條狀，在干燥器（相對(duì)濕度30%，溫度25℃）平衡一天備用。 測(cè)試條件： 拉伸速度40 mm/min，初始長(zhǎng)度30 mm，測(cè)試環(huán)境溫度24 ℃，相對(duì)濕度56%。 抗拉強(qiáng)度（TS）和斷裂伸長(zhǎng)率（E）計(jì)算公式如下：

式中，F(xiàn)——斷裂時(shí)的最大負(fù)荷，屈服負(fù)荷/N；S——可食性抗菌保鮮膜的橫截面積/mm2；TS——拉伸強(qiáng)度/MPa。

L——可食性抗菌保鮮膜樣品斷裂時(shí)的長(zhǎng)度/mm；L0——可食性抗菌保鮮膜樣品的初始長(zhǎng)度/mm。

1.2.4 可食性抗菌保鮮膜形貌特征 以A4 白紙為背景，分別對(duì)殼聚糖單一成分的抗菌膜、普魯蘭多糖單一成分的抗菌膜、殼聚糖-普魯蘭多糖抗菌復(fù)合膜拍照記錄。

1.2.5 可食性抗菌保鮮膜微觀結(jié)構(gòu)測(cè)定 試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[7]將單一多糖成分的樣品膜CP0、PC0和復(fù)合膜CP2 樣品膜裁剪為5 mm×5 mm 大小，液氮速凍，斷裂，選擇完整的斷面，用導(dǎo)電膠將其固定于銅臺(tái)，真空鍍金，選擇加速電壓5kV，觀察并記錄樣品微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.6 可食性抗菌保鮮膜抑菌性能的評(píng)價(jià) 用打孔器將復(fù)合抗菌膜（CP2，記作A）、殼聚糖膜（未添加ε-PL，記作B）、普魯蘭多糖膜（未添加ε-PL，記作C）裁剪為直徑6 mm 的圓片放在干燥器中備用。將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌分別在LB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD=0.5（約1×108CFU/mL），取100 μL 加入到LB 固體培養(yǎng)基， 涂布均勻， 將制備好的3 種膜貼于平板表面，將培養(yǎng)基平板放置于37 ℃培養(yǎng)箱中，恒溫培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈的大小，并拍照記錄。

1.2.7 可食性抗菌保鮮膜對(duì)牛肉的保鮮作用

1.2.7.1 對(duì)牛肉外觀品質(zhì)的保持效果 冷鮮牛肉樣品購(gòu)于樂(lè)購(gòu)超市，4 ℃條件下運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室， 切成3 cm×3 cm，厚度約1 cm 小塊，均分為兩組，空白對(duì)照組和抗菌膜處理組，置于4 ℃條件下，分別在第1，3，5，7，9，11，13 天觀察并拍照記錄。

牛肉色澤測(cè)定參照文獻(xiàn)[8]的方法，利用色差計(jì)對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，采用a*/b*表示牛肉樣品的紅色指數(shù)，a*/b*值越大，表示色澤越鮮艷，品質(zhì)越好。

1.2.7.2 貯藏期間pH 值的測(cè)定 參考GB/T 9695.5-2008 《肉與肉制品pH 值測(cè)定》的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7.3 貯藏期間TVBN 的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[9]的方法采用康威擴(kuò)散法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7.4 牛肉表面菌落總數(shù)的測(cè)定 試驗(yàn)選擇菌落總數(shù)為1×10-4CFU/g 的牛肉作為試驗(yàn)樣品。 菌落總數(shù)測(cè)定參照GB/T 47889.2-2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7.5 牛肉表面優(yōu)勢(shì)致病菌的測(cè)定 樣品處理：醫(yī)用潔爾滅浸泡3 min，無(wú)菌去離子水沖洗，在無(wú)菌操作室用無(wú)菌刀片切成3cm×3cm， 厚度約1cm 小塊，均分為兩組，空白對(duì)照組和處理組。 每個(gè)接種樣品進(jìn)行雙份接種，接種完畢后，其中一份進(jìn)行實(shí)際接種數(shù)測(cè)定，另一份用作后續(xù)貯藏實(shí)驗(yàn)。

接種物準(zhǔn)備：以腸出血性大腸O157：H7、沙門氏菌和單增李斯特菌為目標(biāo)菌[10]，將3 株菌分別活化， 在10 mL LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至濃度約105～106CFU/mL，接種量500 μL。 靜置30 min，使菌液充分分散到肉的表面。

2 結(jié)果與討論

2.1 最低抑菌濃度

試驗(yàn)結(jié)果表明ε-PL 對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、 沙門氏菌和枯草芽孢桿菌的最小抑菌質(zhì)量濃度分別為1，4，2，0.5 mg/mL。其中革蘭氏陽(yáng)性菌較革蘭氏陰性菌更敏感， 可能是因?yàn)楦锾m氏陰性菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)有一定的阻水效果[11]。 因此本文確定ε-PL 在抗菌膜中添加量為4 mg/mL。

2.2 可食性復(fù)合抗菌保鮮膜的機(jī)械性能評(píng)價(jià)

由圖1 可得殼聚糖膜CP0 抗拉強(qiáng)度TS（MPa）值為32.90，斷裂伸長(zhǎng)率為54.46，普魯蘭多糖膜（PC0）的TS（MPa）值為30.37，斷裂伸長(zhǎng)率為2.34。 可以得出殼聚糖膜的延展性能比較好，普魯蘭多糖膜比較脆。CP0、CP1、CP2 和CP3 的測(cè)試結(jié)果顯示，殼聚糖含量不變時(shí)，隨著普魯蘭多糖含量的增加，復(fù)合膜的抗拉強(qiáng)度逐漸增加，但配方CP2與CP3 的TS（MPa）值增加量沒(méi)有顯著差異。 復(fù)合膜斷裂伸長(zhǎng)率較殼聚糖膜明顯減小， 而且隨著普魯蘭多糖含量的增加，斷裂伸長(zhǎng)率有減小的趨勢(shì)。綜合考慮，選取CP2 作為成膜基質(zhì)最佳配比。

2.3 可食性復(fù)合抗菌保鮮膜的形貌特征

試驗(yàn)結(jié)果如圖2 所示， 可以看出單一成分的殼聚糖膜（CP0）顏色偏黃，且褶皺不平。 而單一成分普魯蘭多糖膜（PC0）透明度較高，但柔韌性不夠好，較脆，且阻水性很差。復(fù)合膜（CP2）結(jié)合二者優(yōu)點(diǎn)，既保持了良好的外觀色澤，又有較佳的機(jī)械性能，達(dá)到了優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)的效果。

圖2 可食性抗菌保鮮膜的形貌特征Fig.2 Morphological features of antibacterial-film

圖3 抗菌膜的掃描電鏡圖Fig.3 The SEM images of antibacterial-film

2.4 可食性復(fù)合抗菌保鮮膜的微觀結(jié)構(gòu)

圖3 表明，單一成分的殼聚糖膜（CP0）的截面有輕微的凹凸不平和褶皺， 原因是殼聚糖大分子之間的氫鍵作用使得分子之間發(fā)生了團(tuán)聚現(xiàn)象，整體有聚攏趨勢(shì)。普魯蘭多糖膜（PC0）的表面和橫切面都比較均一，無(wú)任何褶皺。從制備成膜液后也可以觀察到殼聚糖膜液黏度很大，質(zhì)地不均勻，而普魯蘭多糖膜液呈現(xiàn)無(wú)色均一透明狀， 黏度比較小。 所以普魯蘭多糖膜質(zhì)地均一。 復(fù)合抗菌膜（CP2）斷面結(jié)構(gòu)狀態(tài)介于CP0 和PC0 之間，說(shuō)明兩種多糖的混合既能改善殼聚糖膜的聚攏效果，又能增強(qiáng)普魯蘭多糖膜的成膜效果。

2.5 可食性復(fù)合抗菌保鮮膜的抑菌效果

試驗(yàn)結(jié)果如圖4， 單獨(dú)的普魯蘭多糖膜沒(méi)有抑菌圈，說(shuō)明普魯蘭多糖沒(méi)有抑菌性。殼聚糖本身有一定的抑菌性，所以殼聚糖膜有抑菌圈。普魯蘭多糖-殼聚糖多糖抗菌復(fù)合膜的抑菌圈最大，證明ε-PL 的抑菌性能在多糖交聯(lián)矩陣中依然保持其良好的抑菌性能。 根據(jù)對(duì)4 種細(xì)菌的抑菌圈的大小范圍，可以看出金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌圈范圍比大腸桿菌和沙門氏菌大，ε-PL對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制作用比革蘭氏陰性菌強(qiáng)。此結(jié)論與ε-PL 在液體培養(yǎng)基中的研究結(jié)果一致。

圖4 多糖膜的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.4 The inhibition effect of films

2.6 可食性復(fù)合抗菌保鮮膜對(duì)牛肉外觀品質(zhì)的保持效果

在貯藏期間， 微生物和新陳代謝共同作用都會(huì)引起樣品物理和化學(xué)的變化， 有腐敗的氣味產(chǎn)生， 肉的表面會(huì)有黏液附著， 顏色由紅色變?yōu)樽厣Ｉ珴墒窍M(fèi)者判斷新鮮程度的一個(gè)重要指標(biāo)，紅色指數(shù)與肌紅蛋白含量有關(guān)， 貯藏過(guò)程中肌紅蛋白被氧化為高鐵肌紅蛋白，肉色加深[12]。 試驗(yàn)結(jié)果如圖5，對(duì)照組在第7 天時(shí)顏色顯著加深，第11天徹底變?yōu)楹诤稚?，汁液流失，腐敗變質(zhì)。 而處理組到第13 天仍然保持良好的感官狀態(tài)。

由圖6 可得， 在貯藏期間兩組紅色指數(shù)均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在第9 天后，紅色指數(shù)急劇下降，與上述外觀品質(zhì)變化結(jié)果一致。 處理組的紅色指數(shù)始終高于對(duì)照組， 說(shuō)明可食性復(fù)合抗菌保鮮膜有抗氧化作用，能夠使牛肉保持良好的色澤。

圖5 殼聚糖-普魯蘭多糖復(fù)合抗菌保鮮膜處理后牛肉外觀Fig.5 Beef appearance after chitosan-pullulan antibacterial-films treatment

圖6 殼聚糖-普魯蘭多糖復(fù)合抗菌保鮮膜對(duì)牛肉色澤的影響Fig.6 Effect of chitosan-pullulan antibacterial-films on beef redness index

圖7 殼聚糖-普魯蘭多糖復(fù)合抗菌保鮮膜對(duì)貯藏期間牛肉pH 值的影響Fig.7 Effect of chitosan-pullulan antibacterial-films on pH of beef during storage

2.7 貯藏期間牛肉pH 的變化

隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)， 對(duì)照組的pH 逐漸增大，第5 天時(shí)增長(zhǎng)較快，可能原因是牛肉內(nèi)源蛋白酶與腐敗菌共同作用，加速蛋白質(zhì)分解，釋放胺類和三甲胺等堿性物質(zhì)[13]。處理組的pH 在第3 天至第5 天有下降趨勢(shì)， 其原因與乳酸菌引起腐敗產(chǎn)生的乳酸和ATP 產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物有關(guān)[14]。 貯藏期間處理組使牛肉的pH 維持在5.77～6.13， 說(shuō)明該可食性復(fù)合抗菌保鮮膜有效地抑制了腐敗微生物的生長(zhǎng)和內(nèi)源蛋白酶的活性[15]。

2.8 可食性復(fù)合抗菌保鮮膜對(duì)貯藏期間牛肉TVBN 的抑制效果

圖8 殼聚糖-普魯蘭多糖抗菌保鮮膜對(duì)貯藏期間牛肉TVBN 的影響Fig.8 Effect of chitosan-pullulan antibacterial-films on TVBN of beef during storage

揮發(fā)性鹽基氮是衡量腐敗程度的重要指標(biāo)。原因包括，內(nèi)源性酶和微生物作用。GB/T 9959.2-2008 按照肉的新鮮程度劃分為3 個(gè)等級(jí)：牛肉的TVBN<15 mg/100 g 符合國(guó)家一級(jí)鮮度標(biāo)準(zhǔn)；15 mg/100g≤TVBN≤20 mg/100 g 為二級(jí)鮮度標(biāo)準(zhǔn)；TVBN＞20 mg/100 g 時(shí)為腐敗肉。 試驗(yàn)結(jié)果（圖8）表明，牛肉TVBN 初始值為8.78 mg/100 g，品質(zhì)良好。 1～5 d 對(duì)照組和處理組的TVBN 值緩慢增長(zhǎng)，第5 天時(shí)處理組為15.35 mg/100 g， 為二級(jí)鮮度。第7 天遠(yuǎn)超腐敗標(biāo)準(zhǔn)， 而對(duì)照組在第9 天時(shí)達(dá)上限。說(shuō)明ε-PL 和殼聚糖有效地抑制了牛肉腐敗進(jìn)程，延緩了肉的腐敗變質(zhì)。

2.9 可食性復(fù)合抗菌保鮮膜對(duì)貯藏期間牛肉表面菌落總數(shù)和致病菌的抑制作用

細(xì)菌的大量繁殖不僅導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)，還會(huì)產(chǎn)生毒素等有害物質(zhì)，威脅人類健康，所以檢測(cè)菌落總數(shù)也是評(píng)價(jià)冷鮮肉質(zhì)量與安全的指標(biāo)。 圖9a 顯示，菌落總數(shù)初始值4 lg（CFU/g），隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組菌落總數(shù)一直在持續(xù)上升，處理組則呈現(xiàn)前期下降后期上升趨勢(shì)。 第9 天超過(guò)了4 lg（CFU/g）。

大腸桿菌是常見食源性菌群， 其中大腸桿菌O157：H7 可以誘發(fā)血型腸炎、腹瀉等病癥。沙門氏菌也是常見人畜共患病原菌， 也已誘發(fā)多起國(guó)內(nèi)細(xì)菌性食物中毒[16]。單增李斯特菌在4 ℃條件下仍可大量繁殖，是典型的嗜冷菌，同時(shí)也是牛肉、羊肉等紅肉中優(yōu)勢(shì)致病菌[17]。 可食性復(fù)合抗菌保鮮膜對(duì)3 種致病菌的抑制作用效果分別如圖9b、圖9c 和圖9d。 貯藏期間，單增李斯特菌增長(zhǎng)速度高于大腸桿菌O157：H7 和沙門氏菌。 可能是因?yàn)閱卧隼钏固鼐梢栽谳^低的溫度生存。 可食性抗菌保鮮膜對(duì)3 種潛在致病菌均有顯著的抑制作用。貯藏末期，處理組大腸O157：H7，單增李斯特菌和沙門氏菌較對(duì)照組減少量分別為5.12，4.47和5.54 lg（CFU/cm2）。 說(shuō)明可食性復(fù)合抗菌保鮮膜在前期對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生了一定的抑制效應(yīng)，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制效果逐漸減弱，其它幾種優(yōu)勢(shì)致病菌的試驗(yàn)結(jié)果也表現(xiàn)出了相同趨勢(shì)，說(shuō)明該可食性復(fù)合抗菌保鮮膜起到了明顯的抑菌效果，提高牛肉的食用安全水平。

圖9 殼聚糖-普魯蘭多糖復(fù)合抗菌保鮮膜對(duì)貯藏期間牛肉的抑菌作用Fig.9 The inhibition effect of chitosan-pullulan antibacterial-films on beef during storage

3 結(jié)論

添加ε-PL 的殼聚糖-普魯蘭多糖可食性復(fù)合抗菌保鮮膜有良好的機(jī)械性能和抑菌性能。 將抗菌膜應(yīng)用于牛肉貯藏保鮮， 能夠有效的延緩其腐敗速度，抑制微生物的生長(zhǎng)，保持其良好的外觀品質(zhì)，延長(zhǎng)貨架期。該可食性復(fù)合抗菌保鮮膜原材料均安全可降解，具有廣泛的應(yīng)用前景。