GC-MS-AMDIS結(jié)合保留指數(shù)初探內(nèi)源酶對(duì)西蘭花揮發(fā)性成分的影響

張 旋 白 冰 程順昌 羅 楓 紀(jì)淑娟

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 沈陽(yáng)110866）

西蘭花（Brassica oleracea）又名青花菜、青花椰菜等， 屬十字花科蕓苔屬甘藍(lán)種中以綠花球?yàn)楫a(chǎn)品的一個(gè)變種，為一、二年生草本植物。 食用部分花球由幼嫩的小花梗和無(wú)數(shù)的小花蕾組成，富含維生素C、蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)、胡蘿卜素和膳食纖維等營(yíng)養(yǎng)素，同時(shí)還含有多酚類、黃酮類等抗氧化活性物質(zhì)和硫代葡萄糖苷及其衍生物蘿卜硫素等抗癌活性成分，一直備受消費(fèi)者青睞[1-2]。

揮發(fā)性成分是果蔬特性中與健康和營(yíng)養(yǎng)最密切的品質(zhì)之一，也是構(gòu)成和影響果蔬食用、加工質(zhì)量的主要因素[3-4]。 近年來(lái)頂空固相微萃?。╯olid phase microextraction，SPME）和氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)為揮發(fā)性成分研究提供了更環(huán)保、 更簡(jiǎn)便和準(zhǔn)確的方法[5-13]。 自動(dòng)質(zhì)譜退卷積定性系統(tǒng)（automated mass spectral deconvolution and identification system，AMDIS）是一個(gè)處理分析GCMS 數(shù)據(jù)的優(yōu)秀軟件，是由美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)院開發(fā)，通過(guò)將GC-MS 數(shù)據(jù)文件中所有離子碎片豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行退卷積（Deconvolution）處理，推定共流出中離子碎片的歸屬，提取出每個(gè)成分的“干凈”質(zhì)譜圖和相關(guān)色譜信息，對(duì)低濃度物質(zhì)的峰、背景較復(fù)雜的峰和重疊峰有較強(qiáng)的分辨解析能力。AMDIS 結(jié)合保留指數(shù)（retention index，RI）定性更加準(zhǔn)確，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用在農(nóng)殘、環(huán)境、毒物分析等領(lǐng)域[14-19]，在西蘭花揮發(fā)性成分研究方面尚未見報(bào)道。

果蔬中揮發(fā)性成分多而復(fù)雜，既受品種、栽培條件、采后處理等因素的影響，又與貯藏過(guò)程中生理生化變化密切相關(guān)[20]。 同時(shí)，部分果蔬組織細(xì)胞被破壞時(shí)， 其所含的非揮發(fā)性前體物質(zhì)在酶的催化下形成新的揮發(fā)性成分，例如大蒜、洋蔥等[21]。大量研究表明果蔬中揮發(fā)性物質(zhì)的產(chǎn)生都是以營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為基礎(chǔ)，通過(guò)不同的生物酶而逐漸演化的，然而尚有很多重要的揮發(fā)性香氣的代謝途徑未能解釋清楚[22]。 目前關(guān)于西蘭花揮發(fā)性成分的研究多集中在品種[23-24]、貯藏條件影響[25-28]等方面，關(guān)于其形成與代謝途徑等研究尚未見報(bào)道。 本研究根據(jù)西蘭花樣品處理方式不同與揮發(fā)性成分形成的差異，初步探討內(nèi)源酶對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)形成的影響，為進(jìn)一步探明西蘭花主要揮發(fā)性成分的形成與轉(zhuǎn)化機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗(yàn)用西蘭花分兩批次購(gòu)于市場(chǎng)，花蕾緊實(shí)、花球大小相同，每組試驗(yàn)3 次重復(fù)。 C6～C44 正構(gòu)烷烴混標(biāo)，上海源葉生物科技有限公司。

7890A-5975C GC-MS 聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司；NW-10VF 超純水系統(tǒng)， 上?？道追治鰞x器有限公司； 固相微萃取手柄，65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS 萃取頭，美國(guó)Supelco 公司。

1.2 方法

剪切西蘭花為末端2～6 mm 的小花蕾， 準(zhǔn)確稱量3.00 g 裝入15 mL 頂空瓶，50 ℃恒溫水浴中萃取40 min，GC-MS 進(jìn)樣250 ℃解吸5 min，作為①剪切組。同時(shí)比較②常溫研磨③低溫研磨（加液氮）④滅酶研磨（沸水浴10 min）樣品處理方式下?lián)]發(fā)性成分差異。

1.3 GC-MS 檢測(cè)條件[25-28]

HP-5MS 色譜柱，載氣為99.999%氦氣，流速1 mL/min，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，分流進(jìn)樣，分流比1∶30，程序升溫40 ℃保持3 min，以5 ℃/min 升至120 ℃，再以10 ℃/min 升至220 ℃保持10 min。

接口溫度280 ℃，電子電離（electron ionization EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z 30～450。

1.4 數(shù)據(jù)分析

經(jīng)7890A-5975C 數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)中AMDIS 進(jìn)行自動(dòng)解卷積（最低匹配因子設(shè)為80）處理，通常是從AMDIS 自帶的環(huán)境、香精香料等質(zhì)譜庫(kù)中按照正逆匹配度高低，得到可能性物質(zhì)，但由于這些質(zhì)譜庫(kù)中化合物有限，因此本研究采用AMDIS 處理后，通過(guò)NIST11 質(zhì)譜庫(kù)檢索，選取正逆匹配度均在800（最高值為1 000）以上的可能物質(zhì)，測(cè)定并計(jì)算RI 值， 然后與NIST11 質(zhì)譜庫(kù)或文獻(xiàn)[18，32]中RI 進(jìn)行比較定性（相對(duì)誤差<±3%）。RI 計(jì)算公式如下：

式中：RI——程序升溫保留指數(shù)；n——正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù)；tRn+1和tRn分別為碳數(shù)為n、n＋1的正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間/min；tRx——被測(cè)組分保留時(shí)間/min，且tRn+1＞tRx＞tRn。

此外， 由于每次試驗(yàn)中萃取西蘭花揮發(fā)性物質(zhì)的數(shù)量、 種類不同， 本研究在取樣量相同情況下，以峰面積表示吸附量，進(jìn)行含量比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPME 纖維頭的選擇

果蔬中的香氣成分較復(fù)雜， 同時(shí)細(xì)胞破裂也引入了酶的參與， 從而導(dǎo)致一系列化學(xué)及生化變化[28]，為了減少干擾，纖維頭的選擇試驗(yàn)使用的是西蘭花小花蕾， 即樣品處理方式為剪切。 65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS 和100 μm PDMS纖維頭是香味物質(zhì)分析常用的萃取頭[29-31]，3 種纖維頭吸附西蘭花揮發(fā)性成分的總離子流圖見圖1。 總離子流圖顯示，65 μm PDMS/DVB 較其它2種纖維頭出峰的數(shù)量和種類多。 通過(guò)AMDIS 分析、NIST11 譜庫(kù)檢索及保留指數(shù)計(jì)算， 西蘭花揮發(fā)性成分鑒定結(jié)果如表1 所示，共鑒定出26 種揮發(fā)性成分，其中甲硫醇、二甲基硫、二甲基二硫、異戊醇、順-3-己烯醇、乙酸葉醇酯、檸檬烯及正戊酸-（Z）-3-己烯酯是文獻(xiàn)報(bào)道的共有物質(zhì)[23-25，27，31]。

除去甲基硅氧烷，65 μm PDMS/DVB 萃取到西蘭花揮發(fā)性成分16 種，分別是鏈長(zhǎng)C1～C5低沸點(diǎn)、 小分子質(zhì)量化合物4 種，C6～C12沸點(diǎn)較低、分子質(zhì)量較小化合物10 種，C12以上沸點(diǎn)較高、分子質(zhì)量較大化合物2 種；75 μm CAR/PDMS 萃取到11 種，分別為鏈長(zhǎng)C1～C5低沸點(diǎn)、小分子質(zhì)量化合物7 種，C6～C12沸點(diǎn)較低、 分子質(zhì)量較小化合物4種；100 μm PDMS 僅萃取到鏈長(zhǎng)C1～C5低沸點(diǎn)、小分子質(zhì)量化合物4 種。 結(jié)果顯示75 μm CAR/PDMS 對(duì)西蘭花揮發(fā)性成分中C1～C5低沸點(diǎn)、小分子質(zhì)量化合物吸附更靈敏， 而65 μm PDMS/DVB更適合寬沸程化合物萃取， 且含文獻(xiàn)報(bào)道的共有物質(zhì)最多， 因此該纖維頭更適合于西蘭花揮發(fā)性成分的分析測(cè)定。

圖1 不同纖維頭萃取西蘭花揮發(fā)成分的總離子流圖Fig.1 Totalion current chromatogram of volatile components in broccoli by different SPME fibers

表1 不同纖維頭萃取西蘭花揮發(fā)性成分鑒定結(jié)果Table 1 Volatile compounds of broccoli by different SPME fibers

（續(xù)表1）

2.2 樣品處理

剪切、常溫研磨、液氮研磨及滅酶研磨4 種樣品處理方式萃取的西蘭花揮發(fā)性成分總離子流圖及分析結(jié)果如圖2、表2 所示。 4 種樣品處理方式分別鑒定出了23，25，22，8 種揮發(fā)性成分，其中剪切組中酯類含量占檢出成分的42.11%， 醇類占41.22%，甲基硅氧烷占8.82%，硫化物占3.53%，烯烷類等其它占4.32%；常溫研磨中醇類占51.48%，硫化物占27.71%，酯類占16.19%，甲基硅氧烷占3.21%，醛類占0.93%，呋喃等其它占0.48%；液氮研磨處理中醛類占79.81%，醇類占3.5%，硫化物占3.44%，甲基硅氧烷占7.04%，酮類3.06%，酯類占1.42%，呋喃等其它占1.73%；滅酶研磨處理中醛類占19.91%，呋喃6.96%，甲基硅氧烷占72%，烴烷類占1.13%。

圖2 不同樣品處理方式的西蘭花揮發(fā)成分總離子流圖Fig.2 Totalion current chromatogram of volatile components in broccoli by different sample preparation

表2 不同樣品處理方式下西蘭花揮發(fā)性成分分析結(jié)果Table 2 Volatile compounds of broccoli by different sample preparation methods

（續(xù)表2）

揮發(fā)性硫化物及己烯醛、己烯醇等脂肪醛、脂肪醇都是構(gòu)成十字花科蔬菜特征香氣的重要組分。除了4 種甲基硅氧烷，剪切組和常溫研磨檢出硫化物、順-3-己烯-1-醇、正己醇、乙酸葉醇酯等12 種共有物質(zhì)，其中甲硫醇、乙酸葉醇酯的含量，處理間并無(wú)顯著差異；二甲基硫、二甲基二硫及二甲基三硫的含量，處理間均有極顯著差異（P<0.01），即常溫研磨中的二甲基硫/三硫顯著高于剪切組（二甲基三硫未檢出），而二甲基硫含量相反。由于常溫研磨中西蘭花組織細(xì)胞完全破裂， 內(nèi)源酶能充分發(fā)揮作用， 因此該結(jié)果顯示西蘭花揮發(fā)成分中的二甲基硫/三硫是酶催化產(chǎn)物，通常是谷胱甘肽及半胱氨酸衍生物在γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、氧化酶、 裂解酶的共同作用下產(chǎn)生二硫或三硫[33]；順-3-己烯-1-醇、正己醇含量，常溫研磨顯著高于剪切組（P<0.01），同時(shí)常溫研磨還含有己醛和2-己烯醛，而剪切組未檢測(cè)到醛類。

常溫研磨和低溫研磨組檢出硫化物、1-戊烯-3-醇、正己醇、己醛、2-己烯醛、2-乙基呋喃、萘等9 種共有物質(zhì)（甲基硅氧烷除外）， 但含量差異較大。由于液氮抑制了酶的作用，因此低溫研磨組中二甲基二硫/三硫的含量低于常溫研磨組，差異極顯著（P<0.01），該結(jié)果符合上述二甲基硫/三硫是酶催化產(chǎn)物結(jié)論；低溫研磨組中己醛和2-己烯醛的含量極顯著高于常溫研磨（P<0.01），而順-2-己烯-1-醇、 順-3-己烯-1-醇含量極顯著低于常溫研磨組（P<0.01），酯類含量和種類都低于常溫研磨組， 特別是未檢出特征揮發(fā)性成分之一的乙酸葉醇酯。

沸水浴10 min 使酶失活或鈍化， 在4 種樣品處理方式中是酶活最弱的一組。 失去了酶的催化，西蘭花組織細(xì)胞所含的非揮發(fā)性前體物質(zhì)無(wú)法形成揮發(fā)性物質(zhì)， 同時(shí)沸水浴過(guò)程中一些極性物質(zhì)揮發(fā)或溶于水而損失較大， 因此滅酶研磨組只檢測(cè)到了2-乙基呋喃、己醛、壬醛和4 種甲基硅氧烷。

3 討論

4 種樣品處理方式的重要區(qū)別在于組織細(xì)胞破裂及酶被釋放程度， 剪切僅使嫩莖斷面處細(xì)胞破裂， 酶不能像常溫研磨那樣充分作用于某些揮發(fā)性成分的前體物質(zhì)； 低溫研磨組優(yōu)點(diǎn)在于液氮的揮發(fā)隔絕了氧，并且低溫又抑制了酶解；加熱同樣是使酶失活， 因此4 種樣品處理方式得到的西蘭花揮發(fā)性成分差別很大。醛類含量，低溫研磨極顯著高于其它3 組（P<0.01）；醇類、酯類含量，常溫研磨＞剪切組＞低溫研磨＞滅酶研磨 （均P<0.01）；二甲基硫含量，剪切組＞常溫研磨＞低溫研磨=滅酶研磨；二甲基二硫/三硫含量，常溫研磨＞低溫研磨＞剪切組＞滅酶研磨。

揮發(fā)物質(zhì)屬于果蔬的次級(jí)代謝產(chǎn)物， 通過(guò)不同的生物酶逐漸演化， 尚有很多重要的揮發(fā)性香氣的代謝途徑還沒有完全解釋清楚， 已知的合成途徑分為脂肪酸合成途徑、 氨基酸合成途徑和萜類合成途徑。 前期研究已表明亞麻酸是西蘭花脂肪酸主要成分，采樣當(dāng)天占總脂肪酸的78%，其次是亞油酸，占10%[34]。 果蔬中含有的亞油酸或亞麻酸，在脂氧合酶（LOX）作用下形成氫過(guò)氧化物，進(jìn)而在過(guò)氧化物裂解酶作用下分解生成醛類化合物或羥基羧酸類化合物， 醛類化合物在醇脫氫酶作用下可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成醇類化合物[21-22]，因此說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果中（E）-2-己烯醛、順-3-己烯-1-醇、順-2-己烯-1-醇及己醛、正己醇是以亞麻酸和亞油酸為前體物質(zhì)LOX 合成途徑的主要產(chǎn)物，進(jìn)而合成了乙酸葉醇酯等相應(yīng)酯；根據(jù)低溫研磨結(jié)果，可以推測(cè)液氮對(duì)LOX 酶及過(guò)氧化物裂解酶的活性沒有抑制， 產(chǎn)生了大量醛類， 但醇脫氫酶受到了抑制，從而減少正己醇、順-3-己烯-1-醇等醇類化合物產(chǎn)生，導(dǎo)致酯類底物來(lái)源的短缺，造成酯類含量的減少；剪切組未檢出醛類，可能是量少自然揮發(fā)損失了。此外，作為西蘭花中重要的揮發(fā)性成分之一的硫化物，分別檢出甲硫醇、二甲基硫、二甲基二硫和三硫，和已有報(bào)道相符[21，23-25，27，31]。 含硫氨基酸（sulfur-containing amino acids）和硫甲基蛋氨酸（S-methylmethionine，SMM）是蔬菜中揮發(fā)性硫化合物的重要前體物質(zhì)， 通過(guò)自然分解和酶解等代謝途徑產(chǎn)生揮發(fā)性硫化合物[35]。 本研究結(jié)果說(shuō)明西蘭花中二甲基二硫/三硫主要是通過(guò)酶催化作用產(chǎn)生的， 二甲基硫是前體物質(zhì)自然分解還是細(xì)胞衰老降解而產(chǎn)生，以及二甲基二硫/三硫的形成機(jī)制還有待深入研究。

圖3 空白試驗(yàn)的總離子流圖Fig.3 Totalion current chromatogram of the blank test

值得注意的是試驗(yàn)結(jié)果中的六甲基環(huán)三硅氧烷（Hexamethylcyclotrisiloxane，D3）、八甲基環(huán)四硅氧烷（Octamethylcyclotetrasiloxane，D4）、十甲基環(huán)五硅氧烷（Decamethylcyclopentasiloxane，D5）及十二甲基環(huán)六硅氧烷（Dodecamethylcyclohexasiloxane，D6）4 種揮發(fā)性甲基硅氧烷，均有穩(wěn)定的保留時(shí)間，峰型較好且不受背景干擾，使用譜庫(kù)檢索就能很好定性。 由于SPME 纖維頭的涂層含有聚二甲基硅氧烷，故進(jìn)行了空白試驗(yàn)，其總離子流圖及峰面積見圖3，檢測(cè)到D3、D4、D5，未檢出D6，但通過(guò)與樣品中的峰面積（例如表2）相比較，發(fā)現(xiàn)樣品中的D3、D4、D5 含量極顯著高于空白試驗(yàn)（P<0.01），猜測(cè)樣品中的D3、D4、D5 及D6 主要來(lái)源于西蘭花自身。 空白試驗(yàn)中的甲基硅氧烷是纖維頭固定相流失造成，還是來(lái)源于空氣[36]，還有待于進(jìn)一步研究。 揮發(fā)性甲基硅氧烷是被廣泛添加于工業(yè)用品及個(gè)人護(hù)理品中的有機(jī)硅制品的基本原料，由于化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，進(jìn)入環(huán)境后表現(xiàn)出持久性及生物富集性，已有報(bào)道空氣中監(jiān)測(cè)到D3、D4、D5 及D6[36-37]。 因此，西蘭花揮發(fā)性成分含有揮發(fā)性甲基硅氧烷尚需進(jìn)一步研究。