生物發(fā)酵脫腥海帶的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

王紅麗 梁璋成 何志剛* 林曉姿 林向陽 陳 慎

（1 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所 福州350003 2 福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院 福州350180 3 福建省農(nóng)產(chǎn)品（食品）加工重點實驗室 福州350003）

海帶（Laminaria japonica）是一種兼具食用和藥用的經(jīng)濟海藻，富含豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物及粗纖維[1-3]，不但可以為人們活動提供所需要的能量，而且其中的多糖、粗纖維還能促進人們腸胃的蠕動，緩解便秘[4]。未經(jīng)脫醒的海帶，會對市場消費產(chǎn)生影響。 去除海帶的腥味是其深加工的關(guān)鍵技術(shù)問題。

目前，對于研究海帶脫腥方法的報道有很多[5]，但主要的脫腥方法有3 種， 即物理脫腥、 化學(xué)脫腥、生物脫腥[6]。 陳婉珠[7]利用酸法、醇法、甘草、β-環(huán)糊精掩蔽法、熱水燙煮法等對海帶脫腥，認(rèn)為熱水燙煮法脫腥效果最好。肖欣欣等[8]認(rèn)為采用綠茶與甘草按照質(zhì)量比4∶2 混合后對海帶脫腥效果好。段吳勇[9]采用釀酒酵母和嗜熱鏈球菌復(fù)合發(fā)酵脫腥，研究表明海帶的腥味基本消失，具有淡淡的清香味。比較3 種方法脫腥技術(shù)，以物理脫腥效果較差，化學(xué)脫腥存在安全與污染問題，生物脫腥不僅可實現(xiàn)海帶的脫腥、改善風(fēng)味，且可提高營養(yǎng)。生物脫腥技術(shù)中，在魚類、貝類脫除腥味成分方面的文獻報道比較多[10-12]，而海帶脫腥方面的研究報道大多限于脫腥工藝研究， 對海帶脫除腥味成分方面的文獻報道鮮少。 常用于生物脫腥的菌種有酵母菌、乳酸菌、醋酸桿菌等，但不同微生物發(fā)酵脫腥的效果及產(chǎn)生的風(fēng)味存在差異。 本試驗選用本實驗室自行分離并保藏的副干酪乳桿菌副干酪亞種R37 和釀酒酵母J4 對海帶進行脫腥， 采用HS-SPME-GC-MS 測定法， 結(jié)合感觀評價分析海帶經(jīng)副干酪乳桿菌副干酪亞種R37 和釀酒酵母J4 發(fā)酵脫腥前后的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與特征揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，探討海帶微生物脫腥機制，為海帶生物脫腥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽漬海帶： 新鮮海帶用35%的食鹽鹽漬24 h后，于-20 ℃速凍保藏所得。 由福建省紅太陽精品有限公司提供。

菌種： 副干酪乳桿菌副干酪亞種R37（Lactobacillus paracasei subsp. paracasei）和釀酒酵母J4（Saccharomyces cerevisia）均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品（食品）加工重點實驗室提供。

1.2 儀器與設(shè)備

BS110S 電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，島津科技有限公司；色譜柱為DB-5 毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），SPME 手動進樣手柄及固定搭載裝置 50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭，安捷倫科技有限公司；20 mL 頂空進樣瓶，美國Supelco 公司；氨基酸自動分析儀，蘇州華美辰儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基制備 LH18 培養(yǎng)基[13]：蛋白胨1.5%，牛肉膏1.0%，葡萄糖2.0%，酵母膏0.74%，檸檬酸二胺0.2%，硫酸鎂0.036%，硫酸錳0.005%，吐溫-80 0.1%，番茄汁10%，蘋果酸鈉2%，調(diào)整pH 5.5±0.2，121 ℃高壓滅菌20 min。

糖蜜培養(yǎng)基： 將甘蔗糖蜜用凈水?dāng)嚢柘♂屩量扇苄怨绦挝镏?%， 添加1%左右的檸檬酸調(diào)節(jié)pH 至5.0±0.2，115 ℃高壓滅菌30 min。

1.3.2 種子液制備 供試乳酸菌和酵母菌經(jīng)活化后， 分別接種于液體培養(yǎng)基LH18 和糖蜜培養(yǎng)基中， 分別培養(yǎng)24 和18 h 后至菌量達109和108CFU/mL，采用3 000 r/min、4 ℃離心10 min，取菌坭加等體積無菌水振蕩懸浮，待用。

1.3.3 樣品制備 海帶經(jīng)清洗脫鹽、切條稱重，將糖鹽水（3%食鹽、3%蔗糖）體積與海帶質(zhì)量以1∶1的比例加入經(jīng)臭氧滅菌后的泡菜壇中， 按試驗設(shè)計接入1.3.1 節(jié)活化好的菌株（見表1），飽和食鹽水封口后于（32±1）℃下發(fā)酵8 d。

表1 發(fā)酵海帶試驗設(shè)計Table 1 Experimental design of fermented kelp

1.3.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定

1.3.4.1 固相微萃?。⊿PME）取樣 取海帶樣品4 g 置于20 mL 的頂空進樣瓶中進行萃取。 萃取條件：萃取頭老化溫度250 ℃；老化時間15 min；平衡溫度60 ℃； 平衡時間30 min；250 ℃解吸附3 min。

1.3.4.2 GC-MS 分析條件 GC 條件：DB-5MS（30 m×0.25 mm，膜厚0.25 μm）；采用程序升溫方式，起始溫度50 ℃，保持3 min，以10 ℃/min 的速率上升至90 ℃，保持5 min，以10 ℃/min 的速率上升至230 ℃，保持2 min；以20 ℃/min 的速率上升至280 ℃，保持5 min；載氣為He，流速1.0 mL/min；不分流進樣。

MS 條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 35～550；發(fā)射電流100 μA。

1.3.5 感官評價 采用定量描述感官評價法[14-16]，邀請10 位經(jīng)過培訓(xùn)的感官評定分析員組成評價小組，將搜集到的描述詞整理總結(jié)后，用M 值法首次篩選。提供給評價員一系列有差別的樣品，對使用的每一描述詞要求評價員在標(biāo)度“0～5”的范圍內(nèi)標(biāo)出評價位置，來判斷感受到的強度。以藻腥味為例，定量描述分析評分圖如圖1 所示。根據(jù)感官評定小組成員實際的評價情況刪除M 值較低的描述詞[17]。

參考感官剖面分析法計算M 值，公式如下：

式中：F——描述詞實際被述及的次數(shù)占該描述詞所有可能被述及總次數(shù)的百分率/%；I——評價小組實際給出的一個描述詞的強度和占該描述詞最大可能所得強度的百分率/%。

最終整理出的氣味感官描述詞分別是藻腥味、泥土味、乳酸味、水果味、酒精味、花香味。

圖1 定量描述分析評分圖Fig.1 Quantitative description analysis diagram of earthy

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 GC-MS 數(shù)據(jù)分析 對不同海帶樣品揮發(fā)性物質(zhì)的定性分析主要采用GC-MS 聯(lián)用儀NIST 14 譜庫對照，選擇相似度大于80%的物質(zhì)，另外結(jié)合保留指數(shù)（retention index，RI）進行確定。按公式（2）計算RI：

式中：n 和n+1——分別為未知物流出前、后正構(gòu)烷烴碳原子數(shù)；tn+1和tn——正構(gòu)烷烴的保留時間/min；tr——未知物的保留時間/min（tn＜tr＜tn+1）。

采用面積歸一化法進行定量分析， 求得各揮發(fā)性成分的相對含量。

1.4.2 其它數(shù)據(jù)分析 利用OriginLab 9.0 軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 海帶感官風(fēng)味評價

海帶原料經(jīng)發(fā)酵處理都可達到脫除腥味的效果，但不同微生物發(fā)酵處理，其效果產(chǎn)生差異，見圖2。 經(jīng)副干酪乳桿菌副干酪亞種R37 和釀酒酵母J4 單菌發(fā)酵都可明顯脫除藻腥味，前者具有典型的乳酸發(fā)酵香，后者具有酵母發(fā)酵的醇香、水果香、花香。以副干酪乳桿菌副干酪亞種R37 及釀酒酵母J4 組合發(fā)酵處理后， 海帶的腥臭味最弱，乳酸發(fā)酵香、果香及花香協(xié)調(diào)，香味愉悅。

圖2 海帶感官剖面圖Fig.2 The sensory section of the kelp

2.2 海帶揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組分種類間的比較分析

CK 組和3 組發(fā)酵處理海帶的揮發(fā)性風(fēng)味化合物的種類和相對含量的差異如圖3 和圖4 所示。 與CK 組相比，R37 發(fā)酵組的醇類、醛類、酮類和酸類化合物物質(zhì)種類和相對含量均增加， 烴類和酯類化合物物質(zhì)種類未變化，但相對含量減少；J4 組海帶醇類、醛類、酸類和其它類化合物物質(zhì)種類和相對含量均增加，烴類、酮類和酯類化合物物質(zhì)種類增加， 但相對含量下降；R37+J4 組海帶醇類、醛類、酯類和酸類化合物物質(zhì)種類和相對含量均增加，烴類和酮類化合物物質(zhì)種類增加，但相對含量下降。不同發(fā)酵處理間，以R37 發(fā)酵組海帶醛類、 酮類化合物物質(zhì)相對含量最高；J4 組海帶酯類、醛類化合物物質(zhì)種類最多；R37+J4 組的烴類、醛類、酯類、酸類化合物物質(zhì)種類最多，醇類、酯類、酸類化合物物質(zhì)相對含量最高，酮類化合物物質(zhì)種類和相對含量最低。 正由于這些風(fēng)味物質(zhì)種類及相對含量的差異構(gòu)成了不同的發(fā)酵風(fēng)味和脫腥效果。

2.3 海帶揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的消長分析

2.3.1 烴類化合物 海帶經(jīng)發(fā)酵后， 具有藻腥味的碘代辛烷相對含量明顯下降，1，3-辛二烯、正碘庚烷未檢出，E，Z-3-亞乙基環(huán)己烯、3-甲基-6-（1-甲基乙烯基）-環(huán)己烯、3-乙基-2-甲基-1.3 己二烯、正十六烷也明顯下降。 經(jīng)釀酒酵母J4 發(fā)酵可產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)1，2-二甲基-環(huán)辛烯、1-亞甲基螺[4.4]壬烷，而副干酪乳桿菌副干酪亞種R37 發(fā)酵產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)2-甲基-6-亞甲基-2-辛烯、反式-1，1，3，4-四甲基-環(huán)戊烷、3-環(huán)氧乙烷基-7-氧雜雙環(huán)[4.1.0]庚烷。 烯烴和芳香烴閾值較低，可賦予海帶特殊香氣[18]。

圖3 海帶揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類對比Fig.3 Comparison of the species of volatile flavor components in kelp

2.3.2 醇類化合物 海帶中具有泥土味、 油脂氣息的正壬醇經(jīng)發(fā)酵后消失，具有蜂蜜味、花香味的β-苯乙醇在海帶經(jīng)釀酒酵母J4 發(fā)酵后產(chǎn)生，而2，6-二甲基-1，7-辛二烯-3-醇、（2Z）-3-戊基-2，4-戊二烯-1-醇和具有脂肪味、 紫羅蘭香的E-2-壬烯-1-醇在海帶經(jīng)副干酪乳桿菌副干酪亞種R37發(fā)酵后產(chǎn)生，它們分別是釀酒酵母J4 和副干酪乳桿菌副干酪亞種R37 發(fā)酵產(chǎn)生的特征醇類風(fēng)味物質(zhì)。 此外，海帶經(jīng)發(fā)酵后又多檢出了2-乙基-2-己烯-1-醇和具有檸檬味、花香味的正辛醇。

2.3.3 醛類化合物 海帶中具有魚腥味的正庚醛經(jīng)發(fā)酵后含量降低，而新增了5 種醛類化合物。其中，具有脂香、清香味的（E，E）-2，4-庚二烯醛、亞麻油香的Z-2-庚烯醛和水果味的E-2-癸烯醛經(jīng)副干酪乳桿菌副干酪亞種R37 發(fā)酵后含量明顯增加， 是副干酪乳桿菌副干酪亞種R37 的特征醛類風(fēng)味物質(zhì)。具有果香、芳香味的桃醛和雞肉香味的E-2-辛烯醛經(jīng)釀酒酵母J4 發(fā)酵后含量明顯增加，是釀酒酵母J4 的特征醛類風(fēng)味物質(zhì)。 此外，海帶經(jīng)發(fā)酵后又新增正辛醛、反-4，5-環(huán)氧基-（E）-2-癸烯醛、十二醛。

2.3.4 酮類化合物 海帶中3-乙酰-2-辛酮經(jīng)發(fā)酵后未檢出，新增了5 種酮類物質(zhì)，其中E-3-壬烯-2-酮、4-羥基-3-甲基-2-（2-丙烯基）-2-環(huán)戊烯-1-酮在發(fā)酵組中均有檢出； 具有堅果味的3-辛烯-2-酮，牛奶味、甜香味的2-壬酮僅在R37 組檢出，具有柏木、覆盆子香氣的β-紫羅酮經(jīng)副干酪乳桿菌副干酪亞種R37 發(fā)酵后含量明顯增加，是副干酪乳桿菌副干酪亞種R37 的特征酮類風(fēng)味物質(zhì)。 2，6-二（叔丁基）-4-羥基-4-甲基-2，5-環(huán)己二烯-1-酮在J4 和R37+J4 組檢出，是釀酒酵母J4 的特征酮類風(fēng)味物質(zhì)。

圖4 海帶揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組分相對含量對比Fig.4 Comparison of the relative content of volatile flavor components in kelp

2.3.5 酯類化合物 海帶發(fā)酵后丁酸己酯、 十四酸異丙酯未檢出，但新增了5 種酯類化合物。其中1-甲基-2-氧代環(huán)己基-3-烯羧酸甲酯和具有果香、椰子香味的癸酸乙酯在發(fā)酵組中均有檢出；乙酸苯乙酯具有甜蜜香，月桂酸乙酯具有花果香，十四酸乙酯具有鳶尾油香、油脂香，在J4、R37+J4 組海帶中都有檢出；是釀酒酵母J4 的特征酯類風(fēng)味物質(zhì)；這些物質(zhì)對海帶良好風(fēng)味均具有很大貢獻。

2.3.6 酸類化合物 海帶發(fā)酵后新增了3 種酸類化合物。 其中癸酸、 辛酸在J4 和R37+J4 組中檢出，是釀酒酵母J4 的特征酸類風(fēng)味物質(zhì)。 豆蔻酸在R37、R37+J4 組檢出， 是副干酪乳桿菌副干酪亞種R37 的特征酸類風(fēng)味物質(zhì)。 這些酸普遍具有酸臭味，對海帶的發(fā)酵味具有一定的作用。

2.3.7 其它類化合物 本試驗中， 其它類化合物包括2-戊基呋喃和苯并噻唑，2-戊基呋喃具有豆香味、青草味，經(jīng)釀酒酵母J4 發(fā)酵后明顯增加，對發(fā)酵海帶的風(fēng)味形成具有重要影響。

3 討論與結(jié)論

海帶腥味成分復(fù)雜， 一般是由多種物質(zhì)共同作用導(dǎo)致的， 主要由2-丁烯醛、2-己烯醛、1-辛烯-3-醇、己醛、反-2-辛烯醛、反-2-癸烯醛、碘代辛烷等物質(zhì)組成，其組成會因海帶的品種、生產(chǎn)季節(jié)與區(qū)位、加工與保藏方法的不同而有所差異。陳婉珠等[22]通過DB-l 色譜柱檢測脫鹽海帶勻漿液，認(rèn)為2-羥基-2-對甲氧苯基-3-羧基-3-甲基丁烷、十四烷酸、十六烷酸、十八烷酸、乙酸、二惡二硅代烷、碘代辛烷、愈創(chuàng)藍油烴、腈基十六烷等羧酸類、 烷烴類及芳香環(huán)基類共同形成了海帶特殊的藻腥味。 劉智禹[23]通過DB-WAX 色譜柱檢測福建省干海帶的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)， 認(rèn)為2-丁烯醛、2-己烯醛、1-辛烯-3-醇等化合物對海帶藻腥味有一定貢獻。崔晨茜等[24]通過VOCOL 色譜柱初步探究認(rèn)為己醛、反-2-辛烯醛、反-2-癸烯醛及1-辛烯-3-醇對生鮮海帶腥味的形成起一定作用。本試驗通過DB-5 色譜柱檢測經(jīng)熱燙、預(yù)腌脫水、冷凍保藏海帶的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)， 認(rèn)為1，3-辛二烯、E，Z-3-亞乙基環(huán)己烯、正壬醇、正庚醛、碘代辛烷、1-辛烯-3-醇、1-辛烯-3-酮、E-2-辛烯醇對海帶藻腥味的形成起主要作用?？梢姡瑢任镀鹬饕饔玫奈镔|(zhì)因預(yù)處理方式和檢測所用色譜柱不同而結(jié)果不同[25]。

表2 海帶揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)HS-SPME-GC-MS 分析結(jié)果Table 2 Analysis of volatile flavor components in kelp by HS-SPME-GC-MS

（續(xù)表2）

（續(xù)表2）

海帶經(jīng)微生物發(fā)酵后形成的風(fēng)味物質(zhì)， 主要是由菌種及其產(chǎn)生的酶類分解、代謝基質(zhì)中的糖、脂肪、蛋白質(zhì)及烴、醇、酮、醛、酯等一系列生物化學(xué)過程而形成的[26-28]。 微生物發(fā)酵的脫腥作用，主要是通過微生物代謝對腥味物質(zhì)實現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化以及產(chǎn)生愉快風(fēng)味物質(zhì)， 以達到消除或掩蔽腥味效果，乳酸菌及酵母菌都有良好的生物脫腥作用，由于不同微生物代謝的底物及產(chǎn)物不同， 其發(fā)酵后的脫腥效果及風(fēng)味也存在差異[29]。 在本試驗中，海帶經(jīng)副干酪乳桿菌副干酪亞種R37 和釀酒酵母J4 發(fā)酵后1，3-辛二烯、E，Z-3-亞乙基環(huán)己烯、正壬醇、正庚醛、碘代辛烷等腥味物質(zhì)經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化利用，其相對含量明顯下降或未檢出，產(chǎn)生了次生代謝產(chǎn)物，如：β-苯乙醇、桃醛、十四酸乙酯、十二醛、E-2-壬烯-1-醇等， 這些物質(zhì)大多具有果香味，對發(fā)酵海帶風(fēng)味的形成具有很大貢獻。而海帶經(jīng)釀酒酵母J4 和副干酪乳桿菌副干酪亞種R37發(fā)酵后產(chǎn)生的風(fēng)味不同， 副干酪乳桿菌副干酪亞種R37 的代謝產(chǎn)物是Z-2-庚烯醛、E-2-癸烯醛、E-2-壬烯-1-醇、β-紫羅酮、2-壬酮等， 釀酒酵母J4 的代謝產(chǎn)物是β-苯乙醇、桃醛、十四酸乙酯、E-2-辛烯醛等，組合后風(fēng)味更柔和，更協(xié)調(diào)。 釀酒酵母J4 和副干酪乳桿菌副干酪亞種R37 組合的效果不論在感官還是風(fēng)味上都優(yōu)于單菌發(fā)酵， 這是因為組合生物發(fā)酵代謝所利用的底物面寬和產(chǎn)生的產(chǎn)物更豐富。 因此，進行海帶的生物發(fā)酵脫腥，選擇適宜的微生物菌種是關(guān)鍵。