• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于蛹蟲草單核芽生孢子的原生質(zhì)體制備條件的優(yōu)化

    2020-07-08 07:08:58婁海偉余穎豪林俊芳郭麗瓊葉志偉
    中國食品學(xué)報(bào) 2020年6期
    關(guān)鍵詞:原生質(zhì)滲透壓蟲草

    婁海偉 余穎豪 林俊芳 郭麗瓊* 葉志偉 李 艷 魏 韜 云 帆

    (1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院生物工程系 廣州510642 2 河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院 鄭州 450001 3 廣東省微生態(tài)制劑工程技術(shù)研究中心 廣州510642 4 廣州市澳鍵豐澤生物科技股份有限公司 廣州510760)

    蛹蟲草(Cordyceps militaris)是一種重要的食藥兩用真菌, 它具有和冬蟲夏草相似的藥用價(jià)值和活性成分[1],被廣泛作為冬蟲夏草的替代品。 蛹蟲草含有蟲草素[2]、蟲草酸[3]、蟲草多糖[4]等生物活性成分,具有免疫調(diào)節(jié)[5]、抗疲勞[6]、抗腫瘤[7]等活性,已成為研究的熱點(diǎn)。隨著菌體中噴司他丁等抗癌化合物的發(fā)現(xiàn)[8], 蛹蟲草的市場(chǎng)需求量逐漸增大。雖然蛹蟲草的人工栽培技術(shù)已推廣應(yīng)用,但產(chǎn)量仍無法滿足日益增長的市場(chǎng)需求, 其主要原因是價(jià)格較高的菌體中生物活性成分含量低。 基因工程是提高蛹蟲草生物活性成分的有效方法,然而大多數(shù)與生物活性成分合成相關(guān)的基因的功能仍然未知, 主要是因?yàn)橛枷x草具有一層較厚且致密的細(xì)胞壁,這給基因工程操作中載體DNA 的轉(zhuǎn)化帶來很大困難。目前,蛹蟲草遺傳轉(zhuǎn)化的方法主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法[9]、基因槍法[10]、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法[11]。 相對(duì)于基因槍法,PEG 介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法設(shè)備條件要求低,方法簡(jiǎn)單。相對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法,PEG 介導(dǎo)轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體法試驗(yàn)周期短。 另外, 通過原生質(zhì)體融合亦可選育高產(chǎn)生物活性成分的優(yōu)良蛹蟲草菌株[12]。 原生質(zhì)體的制備是實(shí)現(xiàn)蛹蟲草原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和原生質(zhì)體融合的技術(shù)關(guān)鍵。

    對(duì)于食用真菌, 制備原生質(zhì)體的材料主要有菌絲、芽生孢子、分生孢子等。在基因工程操作中,通常需要單細(xì)胞核的受體材料, 且細(xì)胞壁易被酶水解。 蛹蟲草產(chǎn)菌絲、芽生孢子[13]、分生孢子[14]。 芽生孢子細(xì)胞壁薄[15],易被溶壁酶水解釋放原生質(zhì)體,是良好的制備原生質(zhì)體的材料。 目前,還未見有關(guān)蛹蟲草芽生孢子細(xì)胞核觀察的報(bào)道, 亦未見采用蛹蟲草芽生孢子制備原生質(zhì)體的報(bào)道。 本文以蛹蟲草芽生孢子為材料,觀察其細(xì)胞核數(shù),對(duì)其原生質(zhì)體制備條件和再生培養(yǎng)基中的滲透壓穩(wěn)定劑進(jìn)行優(yōu)化, 為蛹蟲草原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化和原生質(zhì)體的融合提供依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 菌株與試劑

    蛹蟲草10 號(hào)菌株(CM-10)保藏于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院天然產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)室。 4’,6-二脒基-2-苯 基吲哚 (4’,6 -diamidino -2 -phenylindole,DAPI),Solarbio 公 司; 熒光增白劑(Fluorescent Brightener 28),Sigma 公司;溶壁酶,廣東省微生物研究所;氯化鉀、氯化鈉、甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂等均為分析純,購自廣州化學(xué)試劑廠。

    1.2 培養(yǎng)基

    馬鈴薯葡萄糖水(Potato dextrose broth,PDB)培養(yǎng)基:馬鈴薯20.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)、葡萄糖2.0%、硫酸鎂0.15%、磷酸二氫鉀0.3%。

    馬鈴薯葡萄糖瓊脂 (Potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基:PDB 培養(yǎng)基、瓊脂2.0%。

    再生培養(yǎng)基(Regeneration medium,RM):PDA培養(yǎng)基、滲透壓穩(wěn)定劑。

    1.3 儀器與設(shè)備

    DMi8L 徠卡熒光顯微鏡, 德國徠卡微系統(tǒng)有限公司;SW-CJ-1FD 超凈工作臺(tái), 江蘇蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;MQD-S2R 振蕩培養(yǎng)箱, 上海旻泉儀器有限公司;MJ-Ⅱ霉菌培養(yǎng)箱,上海一恒科技有限公司;5804R 高速冷凍離心機(jī),Eppendorf公司。

    1.4 方法

    1.4.1 芽生孢子的收集 將菌株CM-10 接種到PDA 培養(yǎng)皿上,25 ℃培養(yǎng)28 d,得到活化母種。 用接種刀從CM-10 母種培養(yǎng)皿上取4 塊1 cm×1 cm 的菌塊接種于100 mL PDB 培養(yǎng)基中,25 ℃振蕩培養(yǎng)4 d(150 r/min),得到發(fā)酵液。 用6 層滅菌紗布過濾發(fā)酵液,離心(8 000 r/min,10 min)濾液(含芽生孢子),棄上清,用滅菌雙蒸水(doubledistilled water,ddH2O)清洗3 次即得蛹蟲草芽生孢子,用于熒光染色和原生質(zhì)體的制備。

    1.4.2 芽生孢子的熒光染色 取適量芽生孢子與500 μL 10%甲醛溶液混合, 靜置24 h 后離心(8 000 r/min,10 min)棄上清,加入50 μL 2.5 μg/mL 熒光增白劑(染色細(xì)胞壁)和50 μL 5 μg/mL的DAPI(染色細(xì)胞核)靜置染色30 min,取10 μL染色后的芽生孢子滴加至載玻片,加蓋蓋玻片,在1 000 倍熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核數(shù) (激發(fā)波長340 nm)。

    1.4.3 原生質(zhì)體的制備 將芽生孢子用0.8 mol/L的KCl 清洗3 次, 并重懸于0.8 mol/L 的KCl 中,通過血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法調(diào)整其濃度至1×109個(gè)/mL。 取100 μL 芽生孢子液,離心(8 000 r/min,10 min)并棄上清,加1 mL 溶壁酶液(溶壁酶粉末溶解于0.8 mol/L 的KCl 中,經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌)混勻,置于恒溫?fù)u床中(90 r/min)酶解一定時(shí)間, 酶解后經(jīng)4 層擦鏡紙過濾得包含原生質(zhì)體的濾液,4 ℃離心 (4 000 r/min,10 min)后棄上清,加1 mL 0.8 mol/L 的KCl 重新懸浮原生質(zhì)體,在400 倍顯微鏡下采用血球計(jì)數(shù)板對(duì)其計(jì)數(shù)。

    1.4.4 原生質(zhì)體制備條件的單因素試驗(yàn) 在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶解溫度、酶解時(shí)間作為原生質(zhì)體制備的影響因素, 以原生質(zhì)體得率為評(píng)價(jià)指標(biāo),進(jìn)行單因素試驗(yàn)。調(diào)節(jié)酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%,1.0%,1.5%,2.0%,2.5%,3.0%,酶解溫度為18,22,26,30,35,40 ℃, 酶解時(shí)間為1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,5.0 h。

    1.4.5 原生質(zhì)體制備條件的優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選擇酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶解溫度、酶解時(shí)間為自變量(xi),以原生質(zhì)體得率為響應(yīng)值(Y),選用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)[16]。各因素變化區(qū)間根據(jù)單因素試驗(yàn)確定。每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)均做3 個(gè)平行樣。因素水平編碼見表1。

    表1 Box-Behnken 試驗(yàn)因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experimental design

    1.4.6 RM 中滲透壓穩(wěn)定劑的單因素試驗(yàn) 原生質(zhì)體的再生受到RM 中的滲透壓穩(wěn)定劑種類和濃度的影響, 本試驗(yàn)選取6 種常用的滲透壓穩(wěn)定劑(氯化鉀、氯化鈉、甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖),以滲透壓穩(wěn)定劑種類和濃度為影響因子, 以原生質(zhì)體再生率為評(píng)價(jià)指標(biāo),進(jìn)行單因素試驗(yàn)。調(diào)節(jié)滲透壓穩(wěn)定劑的濃度為0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mol/L。

    在響應(yīng)面優(yōu)化條件下制備原生質(zhì)體, 用0.8 mol/L KCl 調(diào)整濃度至1×103個(gè)/mL, 取50 μL 涂布于RM 上,同時(shí)取50 μL 涂布于PDA 培養(yǎng)基上做對(duì)照,25 ℃避光培養(yǎng)6 d, 計(jì)算原生質(zhì)體的再生率。

    原生質(zhì)體再生率 (%)=(RM 上的菌落數(shù) -PDA 培養(yǎng)基上的菌落數(shù))/ 涂布原生質(zhì)體數(shù) ×100%

    1.5 統(tǒng)計(jì)分析

    應(yīng)用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析;Origin 9.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖形的制作(P<0.01 表明差異極顯著;P<0.05 表明差異顯著;P>0.05 表明差異不顯著)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 蛹蟲草芽生孢子的細(xì)胞核觀察

    蛹蟲草芽生孢子在1 000 倍的明場(chǎng)顯微鏡下呈棒狀結(jié)構(gòu)(圖1a),這與前人的研究結(jié)果一致[13-14]。在1 000 倍的熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn), 蛹蟲草芽生孢子為單核的細(xì)胞(圖1b)。 以上結(jié)果表明,蛹蟲草可以產(chǎn)芽生孢子,且為單個(gè)細(xì)胞核,適合作為基因工程操作的材料。

    圖1 蛹蟲草芽生孢子的顯微觀察Fig.1 Microscopic observation of Cordyceps militaris blastospores

    2.2 原生質(zhì)體制備的單因素試驗(yàn)結(jié)果

    2.2.1 酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)原生質(zhì)體得率的影響 溶壁酶的主要作用是水解細(xì)胞壁, 使芽生孢子釋放原生質(zhì)體,是影響原生質(zhì)體釋放的主要因素。本試驗(yàn)在酶解溫度30 ℃、酶解時(shí)間3 h 條件下,調(diào)節(jié)酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%,1.0%,1.5%,2.0%,2.5%,3.0%進(jìn)行酶解試驗(yàn),結(jié)果見圖2。

    由圖2 可知,在酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%~2.0%時(shí),隨著酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加, 原生質(zhì)體的得率逐漸增加,這是因?yàn)榇穗A段芽生孢子足夠多,而酶相對(duì)較少,隨著酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加,原生質(zhì)體釋放量增多,當(dāng)酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%時(shí),原生質(zhì)體的得率達(dá)到最大值。 當(dāng)酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于2.0%,隨著酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加,原生質(zhì)體得率呈下降趨勢(shì),這可能是因?yàn)槊敢扬柡突蜻^飽和, 過多的酶作用于已形成的原生質(zhì)體, 使已形成的原生質(zhì)體破裂而造成原生質(zhì)體得率降低[17]。 以上結(jié)果表明,2.0%的溶壁酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)較適合蛹蟲草原生質(zhì)體的制備。

    圖2 溶壁酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)原生質(zhì)體得率的影響Fig.2 The effect of lywallzyme concentration on the yield of protoplasts

    2.2.2 酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體得率的影響 在溶壁酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%、酶解時(shí)間3 h 條件下,調(diào)節(jié)酶解溫度為18,22,26,30,35,40 ℃進(jìn)行酶解試驗(yàn),結(jié)果見圖3。

    由圖3 可知,隨著酶解溫度的升高,原生質(zhì)體的得率顯著升高,當(dāng)溫度升高至26 ℃時(shí),原生質(zhì)體的得率達(dá)到最大值。 當(dāng)酶解溫度高于26 ℃時(shí),隨著溫度的升高,原生質(zhì)體的得率迅速下降。與其它酶促反應(yīng)一樣, 溫度是影響酶活性的主要因素之一,大多數(shù)酶都具有最適酶活性溫度,溶壁酶亦是如此,越偏離最適酶活性溫度,酶活性越低[18]。當(dāng)酶解溫度偏離26 ℃時(shí), 原生質(zhì)體的得率下降,這是因?yàn)槿鼙诿傅幕钚越档停?由此可知溶壁酶的最適酶活性溫度為26 ℃左右。

    2.2.3 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體得率的影響 在溶壁酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%,酶解溫度26 ℃條件下,調(diào)節(jié)酶解時(shí)間為1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,5.0 h 進(jìn)行

    圖3 酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體得率的影響Fig.3 The effect of temperature on the yield of protoplasts

    2.3 原生質(zhì)體制備條件的優(yōu)化

    2.3.1 模型方程建立與顯著性檢驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上, 采用響應(yīng)面法對(duì)原生質(zhì)體的制備條件進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)和響應(yīng)值見表2。通過分析自變量和因變量得到一個(gè)能夠在給定的范圍內(nèi)預(yù)測(cè)原生質(zhì)體得率的回歸模型, 該回歸模型方程為:Y = -1.55518×108+ 2.55208×107x1+ 6.51302×106x2+4.13958×107x3-2.91667×105x1x2+5.83333×105x1x3- 1.45833×105x2x3- 4.70833×106x12-1.06120×105x22-7.54167×106x32。

    Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方差分析見表3。由表3 可知,本研究所得回歸模型極顯著(P<0.0001),失擬不顯著(P=0.8395),決定系數(shù)R2為0.9917,說明建立的模型與實(shí)際情況擬合良好,誤差小, 能較好的表明各因素與原生質(zhì)體得率之間的關(guān)系。 根據(jù)方差分析和回歸方程系數(shù)顯著性檢酶解試驗(yàn),結(jié)果見圖4。

    由圖4 可知,隨著酶解時(shí)間的延長,原生質(zhì)體的得率迅速升高, 當(dāng)酶解時(shí)間延長至2.5 h 時(shí),原生質(zhì)體的得率達(dá)到最大值。 但當(dāng)酶解時(shí)間超過2.5 h 后,原生質(zhì)體的得率逐漸降低。 以上結(jié)果表明適宜的酶解時(shí)間是制備原生質(zhì)體的重要條件,酶解時(shí)間過短,芽生孢子的細(xì)胞壁去除不徹底,導(dǎo)致原生質(zhì)體的得率低[19];酶解時(shí)間過長,導(dǎo)致已生成的原生質(zhì)體皺縮, 損害細(xì)胞質(zhì)膜并使原生質(zhì)體破裂,從而引起原生質(zhì)體的得率降低[17]。 以上結(jié)果表明,酶解2.5 h 較適合蛹蟲草原生質(zhì)體的制備。驗(yàn)的結(jié)果, 將差異不顯著的因子剔除后得到的回歸方程為:Y = - 1.58435×108+ 2.69792 × 107x1+6.51302 × 106x2+ 4.25625 × 107x3- 2.91667 ×105x1x2-1.45833×105x2x3-4.70833×106x12-1.06120×105x22-7.54167×106x32。

    圖4 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體得率的影響Fig.4 The effect of time on the yield of protoplasts

    2.3.2 自變量對(duì)原生質(zhì)體得率的影響 原生質(zhì)體的得率受回歸方程的回歸系數(shù)的影響。 由表3 可知,x1、x2、x3、x1x2、x2x3、x12、x22、x32項(xiàng)對(duì)原生質(zhì)體的得率均有顯著影響,x1x3影響不顯著。 根據(jù)回歸方程中的回歸系數(shù)絕對(duì)值的大小可分析各個(gè)因素的改變對(duì)原生質(zhì)體得率影響的大小。 回歸方程一次項(xiàng)的回歸系數(shù)絕對(duì)值大小依次為x3、x1、x2,表明酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體得率的影響最大, 其次是酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶解溫度。 固定3 個(gè)因素中的1 個(gè)因素在0水平, 得出其余2 個(gè)因素的交互作用對(duì)原生質(zhì)體得率影響的響應(yīng)面圖, 如圖5~圖7。 由圖5~圖7可知,3 個(gè)因素與原生質(zhì)體得率呈拋物線的關(guān)系,即隨著各影響因素值的增加, 原生質(zhì)體得率先升高后降低, 這說明各因素與響應(yīng)值之間并非單純的直線線性關(guān)系。 響應(yīng)曲面的陡峭程度反應(yīng)變量對(duì)原生質(zhì)體得率的影響程度, 曲面越陡表明影響越大,反之則較小。 圖5~圖7 表明,任何兩個(gè)因素的交互作用都存在最高點(diǎn), 即各因素在所選取的范圍內(nèi)均能得到最大響應(yīng)值, 表明各因素所選擇的試驗(yàn)范圍合理有效。

    表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)值Table 2 Experimental design of Box-Behnken and response values

    表3 回歸模型方差分析表Table 3 Analysis of variance of regression model

    2.3.3 最適條件和回歸模型的驗(yàn)證 根據(jù)上述建立的回歸模型, 采用Design-Expert 8.0.6 軟件優(yōu)化原生質(zhì)體的制備條件,得出最適制備條件為:酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.06%,酶解溫度26.1 ℃,酶解時(shí)間2.57 h, 在此條件下, 原生質(zhì)體得率的預(yù)測(cè)值為8.97×106個(gè)/mL,而實(shí)際測(cè)得的原生質(zhì)體得率為(9.17±0.29)×106個(gè)/mL, 實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間的相對(duì)誤差為2.18%,差異不顯著,說明該模型對(duì)原生質(zhì)體制備條件的優(yōu)化可靠性強(qiáng),具有一定的實(shí)用價(jià)值。

    2.4 蛹蟲草原生質(zhì)體的顯微觀察

    在響應(yīng)面優(yōu)化的條件下制備原生質(zhì)體, 并直接在1 000 倍的明場(chǎng)顯微鏡下觀察, 結(jié)果見圖8。通過顯微觀察可知, 蛹蟲草原生質(zhì)體呈半透明狀態(tài)、圓形,與棒狀的芽生孢子形態(tài)差異顯著,易于區(qū)分,在制備原生質(zhì)體時(shí),可隨時(shí)顯微觀察芽生孢子的酶解情況。

    2.5 RM 中滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)蛹蟲草原生質(zhì)體再生的影響

    2.5.1 RM 中滲透壓穩(wěn)定劑種類對(duì)原生質(zhì)體再生率的影響 原生質(zhì)體對(duì)不同種類的滲透壓穩(wěn)定劑耐受能力不一[20],本試驗(yàn)設(shè)定RM 中滲透壓穩(wěn)定劑的濃度為0.8 mol/L, 研究6 種常用的滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)原生質(zhì)體再生率的影響(圖9)。

    由圖9 可知,RM 中的6 種滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)原生質(zhì)體的再生有顯著的影響。 甘露醇作為RM 中的滲透壓穩(wěn)定劑時(shí),再生率最高(大于40%),其次是山梨醇、氯化鉀、葡萄糖、蔗糖,其再生率均在19%以上。 而以氯化鈉作為滲透壓穩(wěn)定劑時(shí),原生質(zhì)體的再生率最低,僅為13.67%±2.52%。因此,選用甘露醇作為RM 中的滲透壓穩(wěn)定劑。

    2.5.2 RM 中甘露醇濃度對(duì)原生質(zhì)體再生率的影響 以甘露醇作為RM 中的滲透壓穩(wěn)定劑, 調(diào)節(jié)甘露醇的濃度分別為0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mol/L,研究RM 中甘露醇濃度對(duì)原生質(zhì)體再生率的影響,結(jié)果見圖10。

    由圖10 可知,隨著RM 中甘露醇濃度的增加,原生質(zhì)體的再生率逐漸升高, 當(dāng)甘露醇濃度達(dá)到1.0 mol/L 時(shí),原生質(zhì)體的再生率達(dá)到最大值(43.67%±2.08%),且與0.8 mol/L 甘露醇(再生率43.33%±2.08%)對(duì)再生率的影響差異不顯著,因此,為節(jié)約成本,本試驗(yàn)選取0.8 mol/L 甘露醇作為RM 中的最適濃度和滲透壓穩(wěn)定劑。

    圖5 溶壁酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體得率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface for effects of lywallzyme concentration and temperature on the yield of protoplasts

    圖6 溶壁酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體得率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface for effects of lywallzyme concentration and time on the yield of protoplasts

    圖7 酶解溫度和酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體得率影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface for effects of temperature and time on the yield of protoplasts

    圖8 蛹蟲草原生質(zhì)體的顯微觀察(1 000×)Fig.8 Microscopic observation of Cordyceps militaris protoplasts

    圖9 滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)原生質(zhì)體再生率的影響Fig.9 Effects of osmotic stabilizers on the regeneration rate of protoplasts

    圖10 甘露醇濃度對(duì)原生質(zhì)體再生率的影響Fig.10 The effect of mannitol concentration on the regeneration rate of protoplasts

    3 結(jié)論

    通過顯微鏡觀察, 蛹蟲草的芽生孢子呈棒狀結(jié)構(gòu)、 單個(gè)細(xì)胞核, 原生質(zhì)體呈半透明的圓形結(jié)構(gòu)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過響應(yīng)面法優(yōu)化了蛹蟲草原生質(zhì)體的制備條件, 建立了多元回歸模型,模型顯著且擬合度良好。酶解條件對(duì)原生質(zhì)體得率的影響大小順序?yàn)椋好附鈺r(shí)間> 溶壁酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)> 酶解溫度。 優(yōu)化的最適酶解條件為:溶壁酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.06%,酶解溫度26.1 ℃,酶解時(shí)間2.57 h。 在此條件下, 原生質(zhì)體的得率達(dá)到了(9.17±0.29)×106個(gè)/mL。 再生培養(yǎng)基中的最適滲透壓穩(wěn)定劑的濃度和種類為0.8 mol/L 甘露醇。

    猜你喜歡
    原生質(zhì)滲透壓蟲草
    蟲草素提取物在抗癌治療中顯示出巨大希望
    中老年保健(2022年2期)2022-08-24 03:20:44
    高考生物問答復(fù)習(xí)之滲透壓
    蟲草素提取物在抗癌治療中顯示出巨大希望
    化基本概念為源頭活水
    ——2017年滲透壓相關(guān)高考真題賞析
    香菇Y(jié)J-01原生質(zhì)體制備與再生條件的優(yōu)化
    食用菌(2017年5期)2017-10-19 03:02:28
    蛹蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選
    酶法制備黑曲霉原生質(zhì)體的條件
    心搏驟停后綜合征患者血漿滲透壓測(cè)定的臨床意義
    電擊法介導(dǎo)的人參大片段DNA轉(zhuǎn)化靈芝原生質(zhì)體的研究
    原生質(zhì)體紫外誘變選育香菇耐高溫菌株
    久久精品人妻少妇| 免费观看人在逋| 国产午夜精品久久久久久| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产乱人视频| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 亚洲九九香蕉| a级毛片在线看网站| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国内精品久久久久久久电影| 美女扒开内裤让男人捅视频| 午夜免费激情av| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 久久久久久大精品| 岛国视频午夜一区免费看| 美女大奶头视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 国产欧美日韩一区二区精品| 国产v大片淫在线免费观看| 欧美国产日韩亚洲一区| 99精品在免费线老司机午夜| 国语自产精品视频在线第100页| 国内精品美女久久久久久| av中文乱码字幕在线| 亚洲美女视频黄频| 黄色视频,在线免费观看| 日韩av在线大香蕉| 免费在线观看亚洲国产| 国产高清三级在线| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 黄色成人免费大全| 大型黄色视频在线免费观看| 男女下面进入的视频免费午夜| 久久精品影院6| 精品国产乱码久久久久久男人| a级毛片在线看网站| 精品免费久久久久久久清纯| 这个男人来自地球电影免费观看| 在线免费观看不下载黄p国产 | 又粗又爽又猛毛片免费看| 婷婷精品国产亚洲av| 亚洲欧美日韩东京热| 黄色成人免费大全| 国产av在哪里看| avwww免费| 亚洲av美国av| 岛国在线免费视频观看| 在线观看免费午夜福利视频| 免费看日本二区| 亚洲天堂国产精品一区在线| 看片在线看免费视频| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲最大成人中文| 国语自产精品视频在线第100页| 韩国av一区二区三区四区| 又紧又爽又黄一区二区| 美女免费视频网站| 九九热线精品视视频播放| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产单亲对白刺激| 久久精品国产综合久久久| 亚洲天堂国产精品一区在线| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 老汉色av国产亚洲站长工具| 中国美女看黄片| 午夜激情福利司机影院| 亚洲在线观看片| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 日本与韩国留学比较| 国产黄a三级三级三级人| 欧美成人性av电影在线观看| 国产成人影院久久av| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲欧美日韩高清专用| 高清在线国产一区| 国产1区2区3区精品| 激情在线观看视频在线高清| 精品人妻1区二区| 色综合亚洲欧美另类图片| 淫秽高清视频在线观看| av女优亚洲男人天堂 | 日本一本二区三区精品| 99久久成人亚洲精品观看| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 三级国产精品欧美在线观看 | 国产 一区 欧美 日韩| 婷婷精品国产亚洲av| 在线永久观看黄色视频| 99国产综合亚洲精品| 国产日本99.免费观看| 在线免费观看不下载黄p国产 | 免费在线观看日本一区| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 久久国产乱子伦精品免费另类| 国内精品美女久久久久久| 久久久久久久久久黄片| 亚洲欧美激情综合另类| 美女被艹到高潮喷水动态| 婷婷精品国产亚洲av| 亚洲乱码一区二区免费版| 男女床上黄色一级片免费看| 国产高清有码在线观看视频| 少妇的丰满在线观看| 国内精品久久久久精免费| 日韩精品中文字幕看吧| 国产成人系列免费观看| 制服丝袜大香蕉在线| 欧美乱妇无乱码| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产成人aa在线观看| 欧美极品一区二区三区四区| 欧美乱码精品一区二区三区| 欧美三级亚洲精品| 成人三级黄色视频| 成在线人永久免费视频| www.www免费av| e午夜精品久久久久久久| 中文字幕最新亚洲高清| 国产成人av激情在线播放| 亚洲国产精品合色在线| 99re在线观看精品视频| 精品免费久久久久久久清纯| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产高潮美女av| 18禁国产床啪视频网站| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲欧美精品综合久久99| 看片在线看免费视频| 不卡一级毛片| 国产成年人精品一区二区| 91久久精品国产一区二区成人 | 国产伦人伦偷精品视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 脱女人内裤的视频| 三级国产精品欧美在线观看 | 免费在线观看亚洲国产| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产精品亚洲美女久久久| 免费观看精品视频网站| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 成人国产一区最新在线观看| 小说图片视频综合网站| 中文字幕久久专区| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲国产色片| 91久久精品国产一区二区成人 | 久久久久亚洲av毛片大全| 国语自产精品视频在线第100页| 欧美日韩综合久久久久久 | 精品一区二区三区视频在线观看免费| 大型黄色视频在线免费观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 欧美午夜高清在线| 麻豆av在线久日| 国内精品久久久久精免费| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 精品国产三级普通话版| 久久久久国内视频| 久久精品国产综合久久久| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲成人久久爱视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 人妻久久中文字幕网| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 成年版毛片免费区| 一区福利在线观看| 久久久久久久精品吃奶| 校园春色视频在线观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 久久人妻av系列| 国产黄片美女视频| 久久久国产欧美日韩av| 午夜免费成人在线视频| 黄频高清免费视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲欧美日韩无卡精品| 岛国在线免费视频观看| 性欧美人与动物交配| 国产伦精品一区二区三区四那| 俺也久久电影网| 嫩草影院入口| 欧美中文综合在线视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 色综合亚洲欧美另类图片| 午夜亚洲福利在线播放| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 欧美大码av| 国语自产精品视频在线第100页| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 国产精品女同一区二区软件 | 欧美黄色淫秽网站| 久久久久免费精品人妻一区二区| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产精品日韩av在线免费观看| 色精品久久人妻99蜜桃| 精品国产乱码久久久久久男人| 高清毛片免费观看视频网站| 久久草成人影院| 精品国产乱子伦一区二区三区| av中文乱码字幕在线| 香蕉丝袜av| www国产在线视频色| 免费看光身美女| 五月伊人婷婷丁香| 成年女人永久免费观看视频| 欧美日韩一级在线毛片| 波多野结衣巨乳人妻| 熟女电影av网| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 成年女人看的毛片在线观看| 国产午夜福利久久久久久| 美女黄网站色视频| 男人和女人高潮做爰伦理| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲精品在线美女| 国产三级黄色录像| 国产亚洲精品久久久com| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 久久久久久久久中文| 亚洲 国产 在线| 色老头精品视频在线观看| 九九在线视频观看精品| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 一夜夜www| 中出人妻视频一区二区| 黄色成人免费大全| 天堂√8在线中文| a在线观看视频网站| 亚洲在线自拍视频| 亚洲精品在线观看二区| 两个人视频免费观看高清| 99热这里只有精品一区 | 18禁黄网站禁片免费观看直播| 一夜夜www| 欧美中文综合在线视频| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 美女cb高潮喷水在线观看 | 亚洲国产精品sss在线观看| 九九热线精品视视频播放| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲午夜理论影院| www日本黄色视频网| 国模一区二区三区四区视频 | 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 制服丝袜大香蕉在线| 午夜福利成人在线免费观看| 一个人看的www免费观看视频| 久久精品国产清高在天天线| 后天国语完整版免费观看| 脱女人内裤的视频| 国产三级中文精品| 99久久无色码亚洲精品果冻| 国产在线精品亚洲第一网站| 午夜视频精品福利| 观看美女的网站| www国产在线视频色| 精品福利观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| cao死你这个sao货| 久久热在线av| 色哟哟哟哟哟哟| 欧美性猛交黑人性爽| 欧美黄色淫秽网站| 欧美日韩精品网址| 久久天堂一区二区三区四区| 国产精华一区二区三区| 成人一区二区视频在线观看| 国产真人三级小视频在线观看| 国产黄色小视频在线观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 成人永久免费在线观看视频| 99久久精品热视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 真人做人爱边吃奶动态| 美女大奶头视频| 国产成人精品无人区| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 中文亚洲av片在线观看爽| 欧美黑人欧美精品刺激| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 欧美高清成人免费视频www| 天天一区二区日本电影三级| 国产不卡一卡二| 亚洲国产欧美一区二区综合| 精品一区二区三区av网在线观看| 日本五十路高清| 搡老妇女老女人老熟妇| 高清在线国产一区| 精品福利观看| 国产精品一区二区三区四区久久| 最新在线观看一区二区三区| 一个人看视频在线观看www免费 | 亚洲美女黄片视频| 午夜福利在线观看吧| 欧美一级a爱片免费观看看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 91在线精品国自产拍蜜月 | 91麻豆精品激情在线观看国产| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 男人和女人高潮做爰伦理| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 亚洲中文字幕日韩| 久久久久久久午夜电影| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲一区高清亚洲精品| 一级毛片精品| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 成年免费大片在线观看| 免费av不卡在线播放| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 夜夜夜夜夜久久久久| 国语自产精品视频在线第100页| 天堂动漫精品| 亚洲欧美激情综合另类| av天堂中文字幕网| 波多野结衣高清作品| 亚洲成a人片在线一区二区| 色老头精品视频在线观看| 国产黄a三级三级三级人| 性欧美人与动物交配| 在线观看66精品国产| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 国产成人精品久久二区二区91| 1024手机看黄色片| 免费看日本二区| 欧美三级亚洲精品| 不卡av一区二区三区| 91字幕亚洲| 免费看十八禁软件| 又紧又爽又黄一区二区| 欧美在线一区亚洲| 亚洲专区字幕在线| 一二三四社区在线视频社区8| 制服人妻中文乱码| 丰满人妻一区二区三区视频av | 国产成人一区二区三区免费视频网站| 午夜福利高清视频| 久久这里只有精品19| 日韩欧美 国产精品| 麻豆国产av国片精品| 全区人妻精品视频| 午夜精品在线福利| 老汉色∧v一级毛片| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产精品亚洲一级av第二区| 禁无遮挡网站| 我的老师免费观看完整版| 男插女下体视频免费在线播放| 国产精品1区2区在线观看.| 国产高清有码在线观看视频| 一本综合久久免费| 国产成年人精品一区二区| 香蕉国产在线看| 亚洲无线观看免费| 亚洲精品一区av在线观看| 国产成人精品无人区| 国产欧美日韩精品一区二区| 最新中文字幕久久久久 | 国产v大片淫在线免费观看| av福利片在线观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 亚洲在线自拍视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 变态另类丝袜制服| 可以在线观看的亚洲视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 中文字幕熟女人妻在线| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 男女午夜视频在线观看| a在线观看视频网站| 看黄色毛片网站| 国产成人系列免费观看| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 九九热线精品视视频播放| 欧美3d第一页| 国产精品亚洲一级av第二区| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲天堂国产精品一区在线| 波多野结衣高清无吗| 亚洲av第一区精品v没综合| 精品久久久久久久久久免费视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 中国美女看黄片| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲精品美女久久av网站| 欧美色欧美亚洲另类二区| 全区人妻精品视频| www.www免费av| 亚洲熟女毛片儿| 一本久久中文字幕| 国产高潮美女av| 黄色片一级片一级黄色片| 国产乱人视频| 又爽又黄无遮挡网站| 美女免费视频网站| 伦理电影免费视频| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 一夜夜www| 欧美不卡视频在线免费观看| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 亚洲人成电影免费在线| www.自偷自拍.com| 美女高潮的动态| 五月伊人婷婷丁香| 日韩欧美国产在线观看| 天堂动漫精品| 亚洲午夜理论影院| 国产成人精品无人区| av福利片在线观看| 麻豆国产av国片精品| 嫩草影视91久久| 欧美黄色淫秽网站| 热99在线观看视频| 九色国产91popny在线| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲成av人片在线播放无| av片东京热男人的天堂| av中文乱码字幕在线| 精品久久蜜臀av无| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 高清在线国产一区| 一二三四社区在线视频社区8| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 精品久久久久久久毛片微露脸| 韩国av一区二区三区四区| 亚洲七黄色美女视频| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲精品久久国产高清桃花| 久久久久久九九精品二区国产| 在线看三级毛片| 精华霜和精华液先用哪个| 欧美国产日韩亚洲一区| 哪里可以看免费的av片| 中文字幕av在线有码专区| 男女之事视频高清在线观看| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 国产精品久久视频播放| 日韩欧美 国产精品| av片东京热男人的天堂| 国产精品av视频在线免费观看| 日本一本二区三区精品| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 婷婷亚洲欧美| 香蕉国产在线看| 国内精品美女久久久久久| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲自拍偷在线| 性欧美人与动物交配| 99久久精品热视频| 一级毛片精品| 狠狠狠狠99中文字幕| 九九在线视频观看精品| 99久久国产精品久久久| 国产不卡一卡二| 真实男女啪啪啪动态图| 中文字幕熟女人妻在线| 国产毛片a区久久久久| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 欧美三级亚洲精品| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲成人中文字幕在线播放| xxx96com| 九九热线精品视视频播放| 757午夜福利合集在线观看| 一本久久中文字幕| 久久久久亚洲av毛片大全| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国产欧美日韩一区二区三| 免费观看精品视频网站| 国产黄色小视频在线观看| 女同久久另类99精品国产91| 成人性生交大片免费视频hd| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 久久人妻av系列| 国产三级黄色录像| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 亚洲精品久久国产高清桃花| 又粗又爽又猛毛片免费看| 特大巨黑吊av在线直播| 波多野结衣高清作品| 国产亚洲精品一区二区www| 最近最新免费中文字幕在线| 18禁观看日本| 亚洲欧美精品综合久久99| 欧美黄色片欧美黄色片| 欧美高清成人免费视频www| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 亚洲中文字幕日韩| av片东京热男人的天堂| 香蕉av资源在线| 免费在线观看日本一区| 日本a在线网址| 动漫黄色视频在线观看| 国产69精品久久久久777片 | 亚洲av成人一区二区三| 亚洲精华国产精华精| 日本黄大片高清| 精品无人区乱码1区二区| 日本 av在线| 国产精品电影一区二区三区| 成人午夜高清在线视频| 欧美日韩黄片免| 99久久精品国产亚洲精品| 色综合亚洲欧美另类图片| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 天天躁日日操中文字幕| 又粗又爽又猛毛片免费看| www.精华液| 老汉色av国产亚洲站长工具| www日本在线高清视频| 男人和女人高潮做爰伦理| 久久国产乱子伦精品免费另类| 最新美女视频免费是黄的| 一个人免费在线观看的高清视频| 国产乱人伦免费视频| 熟女人妻精品中文字幕| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久久久精品大字幕| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲国产高清在线一区二区三| av片东京热男人的天堂| 国产精品免费一区二区三区在线| netflix在线观看网站| 母亲3免费完整高清在线观看| 999久久久国产精品视频| 老司机福利观看| 久久久水蜜桃国产精品网| 99国产精品一区二区三区| 国产精华一区二区三区| 国产成人系列免费观看| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲av熟女| 悠悠久久av| 亚洲欧美精品综合久久99| 老汉色av国产亚洲站长工具| 色老头精品视频在线观看| 欧美日韩一级在线毛片| 国产精品av视频在线免费观看| 一级毛片高清免费大全| 欧美黑人巨大hd| 此物有八面人人有两片| 欧美国产日韩亚洲一区| 听说在线观看完整版免费高清| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 欧美中文日本在线观看视频| 亚洲av免费在线观看| 成人永久免费在线观看视频| 后天国语完整版免费观看| 国产一区在线观看成人免费| 看免费av毛片| 男女视频在线观看网站免费| 国产精品影院久久| 观看免费一级毛片| 日本a在线网址| 午夜两性在线视频| 久久草成人影院| 国产高清视频在线观看网站| 免费看光身美女| 日韩有码中文字幕| 久久这里只有精品中国| 看黄色毛片网站| 黄片大片在线免费观看| 亚洲自拍偷在线| 精品国内亚洲2022精品成人| 久久久久久久精品吃奶| 日韩欧美国产一区二区入口| 久久国产精品人妻蜜桃| 制服丝袜大香蕉在线| 国产高潮美女av| 成人18禁在线播放| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 欧美三级亚洲精品| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 成人特级av手机在线观看| 亚洲熟女毛片儿| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 九九在线视频观看精品| 99久久综合精品五月天人人| 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产亚洲av高清不卡| 精品久久蜜臀av无| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产视频一区二区在线看| 成年女人毛片免费观看观看9| 免费高清视频大片| 黄色成人免费大全| 国产成人欧美在线观看| 国产一区二区激情短视频| 黄色日韩在线| av片东京热男人的天堂| 亚洲熟妇熟女久久| 精品不卡国产一区二区三区| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产精品九九99| 中文亚洲av片在线观看爽| 人妻久久中文字幕网| 舔av片在线| 12—13女人毛片做爰片一| 久久伊人香网站| 午夜亚洲福利在线播放|