超高壓處理條件對腐敗希瓦氏菌的影響

藍蔚青 張 溪 趙宏強 孫曉紅 施玲慧 叢曉涵 謝 晶*

（1 上海海洋大學食品學院 上海201306 2 上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心 上海201306 3 食品科學與工程國家級實驗教學示范中心（上海海洋大學）上海201306）

超高壓 （High hydrostatic pressure， HHP）是一種新型的冷處理技術， 其主要利用壓媒（食用油、甘油、油與水的乳液等）使食品在高壓（100～1 000 MPa）條件下產生酶失活、蛋白質變性、淀粉糊化和微生物滅活等效應， 從而達到滅菌和改性的物理過程[1-2]。樣品經超高壓處理，微生物細胞膜被破壞，殺滅或抑制其中的微生物，使微生物體內蛋白質發(fā)生凝固。 同時，還能抑制酶的活性，使相關酶活性喪失， 保持食品固有品質與風味不受影響[3-5]。 Bernadette K 等[6]研究顯示大腸桿菌在經超高壓處理后，其死亡與細菌細胞膜被破壞，導致胞內蛋白類物質外溢有關。 微生物種類與其生長環(huán)境的不同，也使其對壓力的敏感度有所差異。由于革蘭氏陰性菌細胞壁結構比陽性菌松散， 其肽聚糖的質量分數也較少， 易在壓力作用下造成細胞壁的機械損傷，導致細菌死亡，因此革蘭氏陽性菌的壓力耐受性優(yōu)于陰性菌[7]。關于超高壓處理對不同細菌的作用機理，前人也開展了相關研究，然而主要是針對致病菌大腸桿菌、 副溶血性弧菌與沙門氏菌等[8-10]。 Ma Lei 等[11]研究發(fā)現，大西洋牡蠣經過293 MPa 120 s 的超高壓處理，使其中的副溶血性弧菌數減少3.52 個對數單位。 本文主要研究不同壓力的超高壓處理條件對水產品優(yōu)勢腐敗菌——腐敗希瓦氏菌（G-）的作用機制，通過測定細菌存活數、細菌生長曲線、電導率、碘化丙啶攝入量、核酸與蛋白質吸收量和酶活力等指標，并通過掃描電鏡觀察， 綜合評價不同超高壓壓力條件對腐敗希瓦氏菌菌體作用的影響， 以期為超高壓應用于水產品殺菌提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗原料

腐敗希瓦氏菌 （Shewanella putrefaciens）：課題組前期從腐敗鱸魚中分離、篩選并鑒定保存菌株。

1.2 主要藥品試劑

胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂（Trypticase Soy Agar-Yeast Extract，TSA-YE）、 胰蛋白胨大豆肉湯（Tryptic Soy Broth，TSB），北京陸橋技術有限責任公司；氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（均為分析純），國藥集團化學試劑有限公司；考馬斯亮藍染色液、鉀離子測定試劑盒、鎂離子測定試劑盒、超微量Na＋/K＋-ATPase 測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；碘化丙啶（Propidium Iodide，PI），美國Sigma 公司等。

1.3 主要設備、儀器

HPP.L2-600/2 超高壓設備，天津華泰森淼生物工程技術有限公司；Hitachi S-3400NⅡ型掃描電鏡， 上海日立高新技術有限公司；TGL-16M 臺式高速冷凍離心機， 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司； SW-CJ-1D 單人凈化工作臺， 蘇州凈化設備有限公司；LDZM-40KCS-Ⅲ型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；DNP-9002BS-Ⅲ型電熱恒溫培養(yǎng)箱， 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；HH-6 型數顯恒溫水浴鍋， 國華電器有限公司；Centrifuge 5810R 冷凍離心機，德國Eppendorf公司；AUW320 型分析天平，日本島津公司；722型可見分光光度計， 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；Synergy2 自動酶標儀， 美國BioTek 公司；DDB-11A 電導率儀， 杭州齊威儀器有限公司；S3400N 掃描電子顯微鏡，Hitachi日本株式會社。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌懸液制備 從-80 ℃冰箱中取出保藏的菌種，平板劃線培養(yǎng)2 d 后獲得單菌落，挑取1 個單菌落于10 mL 的胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯培養(yǎng)基（TSB-YE）中，37 ℃、200 r/min 搖床培養(yǎng)18 h，以1%接種量接入100 mL 的TSB-YE 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min 搖床培養(yǎng)18 h，6 000×g，4 ℃離心15 min，棄上清液，沉淀用0.85%生理鹽水制成菌懸液， 調整菌液濃度， 使初始菌數為108～109CFU/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 超高壓處理 菌懸液樣品分別采用200，300，400 MPa，超高壓處理9 min，處理介質為水。超高壓處理后的樣品立即置于4 ℃冰箱保存。 未經超高壓處理樣品（0.1 MPa）作為空白對照組，沸水浴15 min 的樣品作陽性對照組，5 組樣品每組設3 個平行。

1.4.3 菌落計數 不同超高壓處理條件的各組菌懸液樣品選擇合適的稀釋度用TSA 進行平板涂布，平板計數操作按GB4789.2-2016《食品安全國家標準——食品微生物學檢驗菌落總數》[12]進行，37 ℃培養(yǎng)48 h 后計數。

1.4.4 細菌生長曲線 取活化后的腐敗希瓦氏菌菌液按照1%接種量添加于胰蛋白胨大豆營養(yǎng)肉湯中，用紫外分光光度計測定初始菌液600 nm 處OD 值，置于37 ℃搖床160 r/min 培養(yǎng)，每隔1 h 測定菌液吸光值，每組3 個平行。 以時間（h）為橫坐標，OD 值為縱坐標，繪制生長曲線。

1.4.5 細胞膜通透性（電導率）將不同超高壓處理后的菌液進行相同梯度稀釋， 使用電導率儀進行測量其電導率值。 通過培養(yǎng)液中電導率值的變化表征超高壓處理對腐敗希瓦氏菌菌體細胞膜通透性的影響。

1.4.6 碘化丙啶（PI）攝入量 PI 溶于去離子水，配成1 mg/mL 的貯備液，于4 ℃條件下暗處貯存。菌懸液在8 000×g，4 ℃離心10 min， 棄上清液，沉淀用無菌生理鹽水懸浮稀釋為106CFU/mL。 其中超高壓處理前PI 染色組：取各處理組菌懸液每組10 mL 各加入PI 貯備液0.5 mL，分別經200，300，400 MPa 超高壓處理，同時做空白對照組，空白對照組不做任何處理直接加入PI 貯備液， 每組設3個平行。 超高壓處理后PI 染色組：取各處理組菌懸液每組10 mL， 分別經200，300，400 MPa 超高壓處理， 超高壓處理后加入PI 貯備液0.5 mL，空白對照組不做任何處理直接加入PI 貯備液，每組設3 個平行。 所有染色組均于37 ℃暗處孵化15 min，8 000×g，4 ℃離心10 min，棄上清液，沉淀用無菌生理鹽水洗滌2 次， 用熒光分光光度計測定吸光度，激發(fā)光波長485 nm，發(fā)射光波長625 nm，狹縫寬度10 nm，生理鹽水作為空白對照。

1.4.7 核酸與蛋白類物質檢測 超高壓處理組、空白對照組的菌懸液樣品，分別于8 000×g、4 ℃離心5 min，取上清液1 mL 于石英比色皿中，使用紫外分光光度計于260 nm 與280 nm 處測定其吸光度值。

1.4.8 細菌細胞膜酶活測定 將未高壓處理的對照樣和高壓處理樣用無菌生理鹽水制備成106～107CFU/mL 菌懸液， 用超聲波粉碎機進行細胞破碎。用考馬斯亮藍試劑測定組織蛋白含量，以牛血清蛋白為標準品。用試劑盒測定Na+/K+-ATPase 活性。 酶活力單位定義為每小時每毫克組織蛋白的組織中ATPase 分解ATP 產生1 μmol 無機磷量[9]。

1.4.9 細菌微觀結構觀察 （SEM）用2.5%戊二醛溶液使菌體沉淀重懸浮，在4 ℃固定10 h。 將固定后的菌體用磷酸鹽緩沖液洗滌3 次后， 分別用30%，50%，70%，90%無水乙醇進行梯度脫水。 冷凍干燥12 h 后，將其涂至金屬載體上，噴金后進行掃描電鏡觀察。

1.5 數據處理

試驗數據采用重復試驗平均值，以平均值±標準偏差表示。 通過SPASS17.0 軟件用單因素方差分析（ANOVA）進行顯著性差異分析（P＜0.05），采用Origin8.5 軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 細菌存活數

超高壓處理菌懸液后， 選擇合適的不同梯度進行倒平板，在一定條件下培養(yǎng)后計數。圖1 表示經不同壓力條件的超高壓處理后腐敗希瓦氏菌的活菌存活數。

圖1 不同壓力條件的超高壓處理對腐敗希瓦氏菌存活量的影響Fig.1 Effects of different pressure treatment conditions on the survival rate of Shewanella putrefaciens

由圖1 可見， 對照組腐敗希瓦氏菌的菌落總數為（6.39±0.54）lg（CFU/mL）。隨著處理壓力的不斷增大，腐敗希瓦氏菌的菌數也隨之降低。當壓力在200 MPa，腐敗希瓦氏菌的菌數降至（5.53±0.26）lg（CFU/mL），相較于對照組明顯減少；當壓力為300 MPa 時，顯示無細菌生長，表明腐敗希瓦氏菌的耐受壓力為300 MPa。 壓力增至400 MPa時，腐敗希瓦氏菌菌數仍為0。 由此表明，腐敗希瓦氏菌的最高耐壓極限是300 MPa。 Sureerat Phuvasate 等[13]研究表明在1.5 ℃，250 MPa 處理牡蠣勻漿中的副溶血性弧菌5 min 時， 其菌數轉變?yōu)榛緳z測不到水平 （<10 CFU/g）； 當壓力升至350 MPa 時[10]，沙門氏菌已完全不生長。

2.2 細菌生長曲線

細菌在生長過程中會經歷滯后期、對數期、穩(wěn)定期與衰亡期等4 個階段，菌體在不同生長階段，其在一定波長范圍內的光密度值（Optical Density，OD）會有所改變，且通常OD 值與菌懸液濃度成正比。 因此，可根據菌懸液OD 值的變化，繪制OD 值與時間的關系圖，即生長曲線圖，就可直觀推斷細菌在不同階段的生長狀況[14]。

從圖2 可以看出， 不同壓力條件的超高壓處理后腐敗希瓦氏菌菌體的生長狀況有明顯差異。其中，對照組菌體在6 h 時進入對數生長期，且一直持續(xù)到12 h。 而經過不同壓力條件超高壓處理后的菌液， 其對數生長期出現明顯延滯。 在200 MPa 與300 MPa 時，細菌活性受到明顯抑制，對數生長期出現在10～12 h。 當壓力達400 MPa 時，腐敗希瓦氏菌生長處于低水平， 菌體活性抑制效果明顯。由此表明，一定壓力條件的超高壓處理對腐敗希瓦氏菌菌體有明顯的抑制作用。

圖2 不同壓力條件的超高壓處理對腐敗希瓦氏菌生長的影響Fig.2 Effects of different pressure treatment conditions on the growth of Shewanella putrefaciens

2.3 電導率值

細胞膜是保護細菌不受傷害的一道屏障，當超高壓處理致使細胞膜發(fā)生變形甚至破壞時，細菌細胞內容物外流，細菌培養(yǎng)液的導電性增大，因此電導率值的變化可在一定程度上反映細菌細胞膜通透性的變化情況[15]。

表1 不同壓力條件的超高壓處理對腐敗希瓦氏菌細胞膜通透性的影響Table 1 Effects of different pressure treatment conditions on the membrane permeability of Shewanella putrefaciens

從表1 可以看出，隨著壓力條件的增大，各組別的電導率值也在逐漸增大， 說明超高壓處理致使細菌細胞的細胞膜發(fā)生改變， 細胞內容物可能外流至培養(yǎng)液中，使培養(yǎng)液的電導率值有所升高。這與Tao 等[16]研究殼聚糖對銅綠假單胞菌與金黃色葡萄球菌膜通透性的結果一致。 菌體細胞膜受到損傷，其保護屏障被打破，致使胞內電解質外泄至培養(yǎng)液中，電導率值隨之升高[17]。 隨著壓力的增大，菌體細胞膜破壞越來越嚴重，電導率值也越高。

2.4 PI 攝取量

PI 是一種大分子熒光染料， 能與核酸類物質結合， 但其無法穿過完整的細胞膜與核酸類物質相結合， 須在細胞膜被破壞或通透性改變的情況下，才能穿過細胞膜，并與核酸類物質結合，發(fā)出能被檢測的熒光，PI 的攝取量可用于判斷菌體細胞膜的完整性[18-19]。通過在超高壓處理前對細胞加入PI 染料進行染色，能測定超高壓過程中細菌細胞膜通透性的變化； 超高壓處理后PI 染料的加入， 則能檢測腐敗希瓦氏菌細胞膜損傷與修復狀況[20]。

從圖3 可以看出，在超高壓處理前加入PI 熒光染料的組別中，隨著壓力的增大，PI 攝入量相應增加， 表明超高壓處理能在一定程度上破壞細菌細胞膜的完整性。 超高壓處理后加PI 熒光染料組的PI 攝入量值要明顯低于超高壓處理前加PI組。由此表明腐敗希瓦氏菌經過超高壓處理后，部分細菌細胞開始自我修復，能恢復一定活性[8]。 將陽性對照組菌液放入沸水浴15 min 處理后，其PI攝入量相同， 說明沸水浴處理對細菌細胞的影響不可恢復， 其主要原因可能是由于熱處理能嚴重破壞細菌細胞膜的磷脂雙分子層結構， 使膜上的載體蛋白構象變化，細胞膜流動性改變，導致菌體細胞膜通透性增大，造成菌體死亡[21]。

2.5 核酸與蛋白質吸收量

菌體細胞膜是一個相對封閉的系統(tǒng)， 能阻止細胞內外物質自由交換，保持細胞內穩(wěn)定狀態(tài)，維持生命正?；顒?。 當細菌菌體受到外來作用影響時，細菌細胞膜可能會受損并喪失功能，使細胞內容物滲出，從小分子物質到大分子物質，如DNA、RNA 和其它物質依次滲出至胞外[22]。 核酸類物質主要包含有嘌呤、嘧啶堿基，蛋白質中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)， 這些結構都具有共軛雙鍵。 因此，在紫外光區(qū)有強烈的光吸收作用，核酸與蛋白質最大吸收峰分別在260 nm 和280 nm 附近[20]。由于在260 nm 處核酸有強烈的吸收峰，可使用紫外可見分光光度計進行檢測，OD260通常被作為評價細胞膜完整性的指標之一[23]。

從圖4 可以看出， 陽性對照組菌液經沸水浴15 min 處理后，菌體細胞膜被完全破壞，因此其紫外吸收物質泄漏量為100%， 而在260 nm 與280 nm 處， 不同超高壓處理后的菌懸液都有一定變化。 由此說明，隨著壓力的增大，細菌細胞膜在一定程度上遭到破壞， 菌體上清液中核酸與蛋白類物質含量增加，菌體細胞膜的通透性增大，細胞內容物外流，導致細菌活性出現不同程度喪失，甚至死亡。

2.6 菌體細胞膜ATPase 活性

ATPase 是細菌生物膜上的一種蛋白酶物質，在物質運送、 能量轉換及信息傳遞等方面發(fā)揮著重要作用， ATPase 也是細胞膜標志酶和重要的離子載體[24]。

圖3 不同壓力條件的超高壓處理對腐敗希瓦氏菌細胞PI 攝取量的影響Fig.3 Effects of different pressure treatment conditions on the PI uptake of Shewanella putrefaciens

由表2 可以看出， 不同超高壓處理下的菌體的Na+/K+-ATPase 的活性出現明顯差異。 壓力越大，活性值越低。 其中，對照組Na+/K+-ATPase 的活性值為（37.89 ± 0.34）U/mg 蛋白；當壓力增至400 MPa 時，Na+/K+-ATPase 的活性值降至（0.652±0.56）U/mg 蛋白。 表明超高壓處理已導致細菌菌體的細胞膜發(fā)生改變，細胞膜ATPase 失活，影響了細胞內物質運輸、信息傳遞與能量轉換等生理代謝，導致細菌活性喪失甚至死亡[9]。

2.7 細菌超微結構觀察

通過掃描電鏡得出的圖像，能直觀反映不同超高壓處理對細菌菌體形態(tài)變化的影響，具體如圖5 所示。

圖4 不同壓力條件的超高壓處理對腐敗希瓦氏菌細胞紫外吸收物質泄漏量的影響Fig.4 Effects of different pressure treatment conditions on the leaking relative amount of Shewanella putrefaciens in UV-absorbing substances

表2 不同壓力條件的超高壓處理對腐敗希瓦氏菌細胞膜Na+/K+-ATPase 活性的影響Table 2 Effects of different pressure treatment conditions on the membrane Na+/K+-ATPase activity of Shewanella putrefaciens

圖5 不同壓力條件的超高壓處理對腐敗希瓦氏菌微觀結構的影響Fig.5 Effects of different pressure treatment conditions on the microstructure of Shewanella putrefaciens

從圖5 中可以看出， 對照組中細菌結構較為完整，表面光滑，形態(tài)飽滿，未出現菌體細胞破損情況，而隨著超高壓處理壓力的不斷增大，菌體表面出現不同程度的損傷。 200 MPa 處理組的菌體結構整體上較完整，只有個別部位出現損傷，說明在此壓力范圍菌體未發(fā)生明顯破壞， 可通過后期進行恢復。 而經過300 MPa 處理后的細菌菌體開始畸形，細菌表面扭曲痕跡，說明菌體破壞嚴重。Chung-Yi Wang 等[10，25]研究發(fā)現，當壓力達300 MPa 10 min 時，副溶血性弧菌的細胞表面出現破損，細胞完整性被破壞，細胞內容物外泄；在350 MPa 10 min 處理后， 沙門氏菌細胞表面凹凸不平，并有細胞已破碎。 當壓力達到400 MPa 時，細菌已發(fā)生扭曲， 表面粗糙并開始裂解， 細胞質滲漏，直接導致細菌死亡。 這與Sureerat 等[26]研究超高壓處理副溶血弧菌所得結果一致， 在300 MPa 5 min 條件處理下， 副溶血弧菌菌體形狀發(fā)生扭曲，甚至破碎。 由此可知，細菌菌體經超高壓處理后， 菌體結構發(fā)生改變， 能破壞微生物的細胞結構，使細菌細胞的內容物外流，從而直接導致菌體死亡[27]。

從掃描電鏡的圖中可以看出， 菌體細胞膜遭受不同程度的損傷是導致其失活或死亡的關鍵。完整的菌體細胞膜能給細胞提供一個相對穩(wěn)定的內環(huán)境， 還可在細胞和環(huán)境間進行物質與能量交換，在信息傳遞過程中充當著重要角色。而當細胞膜在超高壓的壓力條件下發(fā)生不可恢復的改變時，細胞膜通透性增大，就會導致菌體死亡。

3 結論

本文研究了不同壓力條件的超高壓處理對腐敗希瓦氏菌的菌體作用機制， 通過測定細菌存活率、細菌生長曲線、細胞膜通透性與掃描電鏡觀察等， 初步闡明了超高壓處理對腐敗希瓦氏菌的作用機理。 結果得出，當壓力達300 MPa 時，腐敗希瓦氏菌的存活率已達到不可檢測水平， 平板未檢出菌落，300 MPa 為腐敗希瓦氏菌的最高耐壓極限。 通過電導率值、Na+/K+-ATPase 活性、紫外物質泄漏量與PI 攝取量等指標測定，結果得出隨著壓力的增大，細菌的細胞膜通透性改變，出現不同程度的損傷， 對菌體細胞的新陳代謝與正常生理功能造成影響， 致使其細胞活性喪失甚至死亡。 此外，通過掃描電鏡可直觀看出，細菌細胞在一定壓力下，整個菌體細胞結構發(fā)生變化，細胞膜完整性被破壞，細胞整體扭曲變形，胞內物質流失，蛋白變性， 且腐敗希瓦氏菌在400 MPa 時受到的損傷不可恢復。