UPLC-Q-TOF-MS 法分析芪風(fēng)固表顆?；瘜W(xué)成分

鄭單單 魏文峰 霍金海 王偉明

（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院， 黑龍江 哈爾濱150036）

芪風(fēng)固表顆粒由黃芪、防風(fēng)、炒白術(shù)、刺五加、麥冬、五味子6 味中藥組成，具有益肺、健脾、補腎的功效，又能益衛(wèi)固表、補氣生津，是治療表虛不固易感病癥有效藥物。文獻報道表明，芪風(fēng)固表顆粒能止咳化痰，延長咳嗽潛伏期，又能緩解氣管炎癥，抑制肺組織病變，改善和治療支氣管炎和肺炎，減少肺部炎癥發(fā)作，能調(diào)節(jié)免疫功能使機體免疫系統(tǒng)恢復(fù)到平衡狀態(tài)［1-4］。芪風(fēng)固表顆?，F(xiàn)有的質(zhì)量檢測標準［WS-5389（13-0389） -2］，包括對方中異嗪皮啶、五味子醇甲2 種成分及白術(shù)、防風(fēng)、麥冬3 種藥材的薄層鑒別，以及對其單一成分黃芪甲苷的HPLC 含有量測定。但是芪風(fēng)固表顆粒的成分復(fù)雜，單一成分的含有量測定相對片面；同時芪風(fēng)固表顆?；瘜W(xué)物質(zhì)組尚不明確，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)無從溯源，無法確定質(zhì)量標準提升的指標性成分，制約了其質(zhì)量標準提升研究。

中藥及中藥復(fù)方中化學(xué)物質(zhì)種類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，LC-MS聯(lián)用技術(shù)集HPLC 的高分離效能和質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度為一體，可以快速分析推斷中藥及中藥復(fù)方中的化學(xué)成分［5-9］。本實驗采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-Q-TOF-MS） 技術(shù)分析推斷芪風(fēng)固表顆粒中的化學(xué)成分，以期為藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供溯源依據(jù)，從而為芪風(fēng)固表顆粒的質(zhì)量標準提升研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 Waters ACQUITYTMUPLC 色譜儀（美國Waters公司）；AB SCIEX Triple-TOFTM 5600 ＋質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX 公 司）；ST16R型低溫高速離心機（美 國Thermofisher Scientific 公司）；BSA224S-CW型、BP211D型電子天平（德國Sartorius 公司）；KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑 甲醇、乙腈（均為色譜純，德國Merck 公司）；甲酸（色譜純，美國Fisher 公司）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

1.3 藥材與對照品 黃芪（批號20180909）、防風(fēng)（批號DC1111）、麩炒白術(shù)（批號 180602）、麥 冬（批號180501）、五味子（批號 20180325）、刺五加（批號20171121） 飲片均購于北京同仁堂（亳州） 飲片有限責(zé)任公司。刺五加按2015 年版《中國藥典》 方法制成刺五加浸膏。5-O-甲基維斯阿米醇苷（批號J-002-170731）、五味子醇甲（批號W-002-181222）、佛手柑內(nèi)酯（批號F-008-181106）、綠原酸（批號L-007-160504） 對照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，純度＞98%）。

2 方法

2.1 色譜條件 Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、Van Guard Pre-Column 預(yù)柱（2.1 mm×5 mm，1.7 μm）；流動相0.1% 甲酸水（A） -0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫，洗脫程序（0～15 min，95%～50% A；15～18 min，50%～0 A；18～18.1 min，0～95% A；18.1～20 min，95% A）；柱溫35℃；體積流量0.3 mL／min；樣品倉溫度4℃；分析時間20 min；進樣量5 μL；色譜儀流出液不分流直接進行正負離子掃描檢測。

2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧正、負離子模式；正／負離子源電壓分別為5 500 V／-4 500 V；離子源溫度550℃；霧化氣體N2，霧化氣、輔助氣壓力均為379.2 kPa；氣簾氣壓力為241.3 kPa；裂解電壓為±80 V，碰撞能量為±35 eV，碰撞能量擴展均為15 eV。TOF MS 掃描范圍為100～1 500 Da，IDA 設(shè)置響應(yīng)值超過100 cps 的8個最高峰進行二級質(zhì)譜掃描，Product Ion 掃描范圍為50～1 500 Da，開啟動態(tài)背景扣除（DBS）。數(shù)據(jù)采集所用軟件為Analyst TF 1.6 software，數(shù)據(jù)處理軟件為Peakview 2.0。

2.3 供試品溶液制備 按照《國家藥品監(jiān)督管理局標準（執(zhí)行） 》 WS-5389（B-0389） -2（《標準》 ） 規(guī)定，芪風(fēng)固表顆粒取黃芪3 000 g、白術(shù)（炒） 1 000 g、五味子500 g、防風(fēng)1 000 g、麥冬1 000 g，煎煮2 次，每次1 h，合并煎液，離心，濾過，靜置24 h 后取上清液，加入刺五加浸膏75 g，濃縮至相對密度1.20～1.22（60℃） 的清膏，趁熱加入糊精適量，混勻，60℃干燥，粉碎成細粉，加乙醇適量制粒，干燥。按《標準》 的1／20 用藥量以上述方法，制備芪風(fēng)固表顆粒供試品溶液。取供試品芪風(fēng)固表顆粒粉末約3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入50%甲醇30 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理50 min，放冷至室溫，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，5 000 r／min 離心10 min，取上清液，過0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.4 單味藥及陰性樣品溶液制備 按“2.3” 項下《標準》 的1／20 用藥量及制備方法，制備黃芪、防風(fēng)、白術(shù)、麥冬、刺五加、五味子單味樣品，以及缺這6 味藥的陰性樣品。分別取以上6 味藥單味藥樣品粉末約3 g，按“2.3”項下方法制備相應(yīng)溶液；分別取以上陰性樣品粉末約3 g，按“2.3” 項下方法制備相應(yīng)陰性樣品溶液。

2.5 數(shù)據(jù)分析 查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻資料［10-18］，整理芪風(fēng)固表顆粒組方中6 味藥所含的化學(xué)成分信息，建立化學(xué)成分數(shù)據(jù)庫，將所有化合物分子式導(dǎo)入Peakview 2.0，對樣本數(shù)據(jù)進行篩查。UPLC-Q-TOF-MS 獲得色譜峰的同位素豐度及一級、二級質(zhì)譜，利用Peakview 2.0 軟件中的Formula Finder 計算出的高分辨精確分子質(zhì)量，快速推測各色譜峰對應(yīng)化合物的分子式，并與部分對照品的保留時間及二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)對比，確認推斷成分。對于一些無法獲得對照品的化合物，先依據(jù)MS／MS 碎片信息計算出每一個二級碎片的元素組成，再推測其裂解方式，解析化合物結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)果

3.1 UPLC-Q-TOF-MS 成分推斷 在“2.1” “2.2” 項條件下分析樣品，正負離子掃描模式下各成分的分離度及離子化程度均較好，總離子流圖見圖1。

圖1 芪風(fēng)固表顆?？傠x子流圖

3.2 成分分析 共分析和推斷出110個化合物，比對單味藥及陰性對照樣品，其中22個來自黃芪，21個來自五味子，14個來自刺五加，13個來自防風(fēng)，10個來自麥冬，6個來自白術(shù)；另有1個為黃芪和白術(shù)共有，4 種成分為黃芪和刺五加共有，2 種成分為黃芪和五味子共有，3 種成分為刺五加和五味子共有，2 種成分為麥冬和刺五加共有，1 種成分為防風(fēng)和白術(shù)共有，1 種成分為防風(fēng)和刺五加共有，1種成分為白術(shù)和刺五加共有，1 種成分為白術(shù)、防風(fēng)、刺五加共有，4 種成分為黃芪、刺五加、五味子共有，1 種成分為黃芪、麥冬、防風(fēng)共有，1 種成分為麥冬、刺五加、五味子共有，1 種成分為五味子、白術(shù)、麥冬、刺五加共有，1種成分為刺五加、黃芪、五味子、防風(fēng)共有。具體見表1。

3.3 質(zhì)譜分析

3.3.1 黃酮類 黃芪的化學(xué)成分主要為黃酮類，另外防風(fēng)中色原酮類成分及麥冬中的高異黃酮類也屬于黃酮類。其主要成分之一為毛蕊異黃酮葡萄糖苷，該化合物為黃酮類的葡萄糖苷，在正離子模式下，準分子離子峰m／z447.129 0［M＋H］＋失去一個脫水葡萄糖中性離子，得到基峰碎片離子m／z285.07 50［M＋H-C6H10O5］＋，基峰碎片離子脫掉一個CH3，產(chǎn)生碎片離子m／z270.051 3［M ＋HC6H10O5-CH3］＋，隨后脫去一個OH，產(chǎn)生碎片離子m／z253.048 5［M＋H-C6H10O5-CH3-OH］＋，該碎片離子C 環(huán)失去一個CO，產(chǎn)生碎片離子m／z225.053 4［M＋H-C6H10O5-CH3-OH-CO］＋，參考文獻［19］中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的碎片離子（m／z），對照該化合物二級質(zhì)譜圖，見圖2，該化合物可推測為毛蕊異黃酮葡萄糖苷，根據(jù)黃酮類成分的裂解規(guī)律進行推測，見圖3。

圖2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷正離子模式下二級質(zhì)譜圖

圖3 毛蕊異黃酮葡萄糖苷裂解途徑

5-O-甲基維斯阿米醇苷是防風(fēng)中的色原酮類成分之一，以5-O-甲基維斯阿米醇苷為例推測防風(fēng)中色原酮類成分的裂解途經(jīng)，正離子模式下，其準分子離子峰m／z453.172 7［M＋H］＋，脫去脫水葡萄糖中性離子，得到基峰碎片離子m／z291.120 5［M＋H-C6H10O5］＋，基峰碎片離子脫去一個中性離子H2O，產(chǎn)生碎片m／z273.109 8［M＋H-C6H10O5-H2O］＋，繼而丟失一個丙烯中性離子C3H6，產(chǎn)生碎片離子m／z231.062 5［M＋H-C6H10O5-H2OC3H6］＋，隨后C 環(huán)斷裂失去一個CO，產(chǎn)生碎片離子m／z203.067 8［M＋H-C6H10O5-H2O-C3H6-CO］＋，對比5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品的二級質(zhì)譜圖，見圖4，參考文獻［20］，該化合物可推斷為5-O-甲基維斯阿米醇苷，裂解途徑見圖5。

3.3.2 木脂素類 五味子的主要成分是木脂素類，以五味子醇甲為例，正離子模式下，其準分子離子峰m／z433.201 2［M ＋H］＋，失去一個中性離子H2O，得到碎片離子m／z415.210 7［M＋H-H2O］＋，該碎片有2 種裂解方式，一種可能失去一個CH3，產(chǎn)生碎片離子m／z400.187 1［M＋H-H2OCH3］＋，該碎片離子八元環(huán)斷裂失去C4H6形成六元環(huán)，產(chǎn)生碎片離子m／z346.141 6［M＋H-H2O-CH3-C4H6］＋，另一種可能發(fā)生如下裂解，C5位失去OCH3，得到特征碎片離子m／z384.192 7［M＋H-H2O-OCH3］＋，該碎片離子又有2種裂解方式，一種是C5′位再失去一個OCH3，C5位和C5′位成鍵得到碎片離子m／z353.173 1［M＋H-H2O-2OCH3］＋，另一種是C5′位失去CH3，C5′位連接的O 和C5位成鍵，產(chǎn)生碎片離子m／z369.169 9［M＋H-H2O-OCH3-CH3］＋，該碎片離子又失去C4’位OCH3，產(chǎn)生碎片離子m／z338.150 8［M＋H-H2O-2OCH3-CH3］＋，結(jié)合文獻［21］所述裂解途徑，對比五味子醇甲對照品的二級質(zhì)譜圖，見圖6，該化合物可推斷為五味子醇甲，參考木脂素類化合物的裂解規(guī)律進行推測，見圖7。

圖4 5-O-甲基維斯阿米醇苷正離子模式下二級質(zhì)譜圖

圖5 5-O-甲基維斯阿米醇苷裂解途徑

圖6 五味子醇甲正離子模式下二級質(zhì)譜圖

3.3.3 香豆素類 香豆素類主要來自防風(fēng)，以佛手柑內(nèi)酯為例，正離子模式下，其準分子離子峰m／z217.049 8［M＋H］＋，脫去一個CH3，得到碎片離子m／z202.025 7［M＋H-CH3］＋，隨后該碎片離子內(nèi)酯環(huán)失去一個CO 重新成環(huán)，產(chǎn)生基峰碎片離子m／z174.030 7［M＋H-CH3-CO］＋，該碎片離子又失去一個CO，產(chǎn)生碎片離子m／z146.035［M＋H-CH3-2CO］＋，參考文獻［22］，對比佛手柑內(nèi)酯對照品的二級質(zhì)譜圖，見圖8，確認該化合物為佛手柑內(nèi)酯，參考香豆素類化合物的裂解規(guī)律進行推測，見圖9。

3.3.4 有機酸類 有機酸類主要存在于刺五加和五味子中，綠原酸來自刺五加和五味子，該化合物在負離子模式下有2 種裂解途經(jīng)，一種為準分子離子峰m／z353.087 2［M-H］-失去一個脫水咖啡酸中性離子，得到基峰碎片離子m／z191.055 2［M-H-C9H6O3］-，該離子又失去一個中性離子H2O，產(chǎn)生碎片離子m／z173.044 8［M-H-C9H6O3-H2O］-，該途徑證明結(jié)構(gòu)中存在奎寧酸；另一種裂解方式為準分子離子峰裂解失去脫水奎寧酸中性離子，產(chǎn)生碎片離子m／z179.034 3［M-H-C7H10O5］-，脫去COO，產(chǎn)生碎片離子m／z135.045 1［M-H-C7H10O5-COO］-，該途徑證明結(jié)構(gòu)中存在咖啡酸，由此可以推斷綠原酸結(jié)構(gòu)。參考文獻［23］，對比綠原酸對照品的二級質(zhì)譜圖，見圖10，推斷為綠原酸，其裂解途經(jīng)見圖11。

圖7 五味子醇甲裂解途徑

圖8 佛手柑內(nèi)酯正離子模式下二級質(zhì)譜圖

圖9 佛手柑內(nèi)酯裂解途徑

除以上4 類化合物外，方中還有萜類、甾體類、生物堿類等化合物。萜類成分主要來自白術(shù)和五味子，白術(shù)中主要含有倍半萜類，目前對其裂解規(guī)律報道較少；甾體類成分來自麥冬，其裂解方式獨特，可能發(fā)生麥氏重排，如薯蕷皂苷元；方中還鑒別出部分生物堿類成分，如腺苷。

4 討論

圖10 綠原酸負離子模式下二級質(zhì)譜圖

圖11 綠原酸裂解途徑

文獻報道，黃芪中黃酮類成分，能抗病毒［24］，還能改善機體免疫功能失調(diào)［25］、改善肺纖維化肺功能［26］。防風(fēng)中的升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷等色原酮類成分具有解熱［27］、抗炎［28］等作用。白術(shù)中的白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ等內(nèi)酯類成分具有抗炎作用［29］。刺五加中含有的刺五加苷類及黃酮類成分，具有調(diào)節(jié)免疫功能的作用［30］。五味子中的木脂素類成分，具有免疫調(diào)節(jié)、體內(nèi)抗炎等作用［31］。麥冬中的魯斯可皂苷元等甾體類成分具有抗炎作用，黃酮類成分具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、鎮(zhèn)咳、改善肝肺損傷等作用［32］。這些化合物有可能是芪風(fēng)固表顆粒的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

本實驗利用UPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)，快速全面的對芪風(fēng)固表顆粒中的體外物質(zhì)成分進行了初步定性分析，通過與部分對照品數(shù)據(jù)及二級質(zhì)譜圖的比較，最終分析和推斷了芪風(fēng)固表顆粒中的110個化合物，其中有37個黃酮類，18個木脂素類，10個香豆素類，19個有機酸類，此外還有萜類、甾體類、生物堿類等其他類型。本實驗分析推測了以上110個化合物的質(zhì)譜裂解途徑，并對所有化學(xué)成分進行了藥材來源歸屬，以期為芪風(fēng)固表顆粒的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)溯源及質(zhì)量標準提升研究提供依據(jù)。