根皮素磷脂復合物的制備及其體內(nèi)藥動學研究

馬記平 劉丹花 郝海軍 李曉蒙 王 利 范明松*

（1.鄭州澍青醫(yī)學高等專科學校， 河南 鄭州450064； 2.上海雷允上藥業(yè)有限公司技術中心， 上海201401）

根皮素是一種含有二氫查爾酮結(jié)構(gòu)的黃酮類植物多酚，主要存在于蔬菜及梨、蘋果等水果的根莖中，具有抗菌、抗糖尿病、抗氧化、抗腫瘤、雌激素樣作用等多種藥理活性［1-3］，此外還具有美白肌膚、延緩衰老、祛除粉刺等多種美容功效［4］。但該成分溶解度很差［5］，口服給藥后很難被吸收［6］，目前已有固體分散體［7］、包合物［8］等制劑學方面的研究，但尚無磷脂復合物制劑技術的報道。

磷脂復合物是藥物分子和磷脂或磷脂酰膽堿分子之間通過氫鍵、范德華力等作用力而形成的一種復合物［9-12］，其基本理化性質(zhì)不同于原型藥物，可改變藥物晶型狀態(tài)［13］，增加其溶解度，促進其口服吸收。本實驗采用單因素試驗優(yōu)化根皮素磷脂復合物處方，對其進行表征，并考察其生物利用度。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200型高效液相色譜儀，配置DAD 檢測器、自動進樣器（美國Agilent 公司）；MSE125P-CE型電子天平（德國Sartorius 公司）；CJ-78-1A型磁力攪拌器（上海躍進醫(yī)療器械廠）；D8型X 射線粉末衍射儀（瑞士Bruker 公司）；THZ-92A型恒溫振蕩器（上海翠柳實驗儀器有限公司）；QT-2A型旋渦混合器（上海琪特分析儀器有限公司）；KL152型氮氣吹掃儀（滁州精鑫實驗儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 根皮素對照品（批號P7912，純度99.9%，美國Sigma 公司）；巖白菜素對照品（批號477-90-7，純度99.2%，上海源葉生物科技有限公司）；卵磷脂（批號PC-98T，上海輔必成醫(yī)藥科技有限公司）。四氫呋喃為色譜純（批號C10303495，德國Merck 公司）；正辛醇（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.3 動物 SD 大鼠，雌雄兼用，體質(zhì)量（300±20） g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（滬） 2013-0016。

2 方法與結(jié)果

2.1 根皮素含有量測定

2.1.1 色譜條件 Waters C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈-0.1% 氨水（35∶ 75）；體積流量1.0 mL／min；柱溫25℃；檢測波長285 nm；進樣量20 μL。

2.1.2 供試品溶液制備 取根皮素磷脂復合物10 mg，加入10 mL 石油醚溶解，過0.22 μm 微孔濾膜后揮去石油醚，加入50 mL 乙腈重新溶解，即得。

2.1.3 方法學考察 稱取根皮素對照品20.0 mg，溶于100.0 mL 乙腈中，得200.0 μg／mL 貯備液，精密量取5 mL置于10 mL 量瓶中，乙腈-0.1% 氨水混合液（35∶75） 定容至刻度，得到100.0 μg／mL 溶液，進一步稀釋成1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg／mL，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，得方程為Y＝1.355 6X＋4.013 8（r＝0.999 9），在1.0～100.0 μg／mL 范圍內(nèi)線性關系良好。

取100.0、50.0、1.0 μg／mL 對照品溶液，同一天在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得日內(nèi)精密度RSD 分別為0.13%、0.09%、0.19%；每天進樣測定1 次，共6 d，測得日間精密度RSD 分別為0.24%、0.19%、0.75%。取“2.1.2” 項下供試品溶液，于0、4、8、12、24、48 h 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得根皮素含有量RSD 為0.79%，表明溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。取大豆磷脂約7.5 mg，按“2.1.2” 項下方法平行制備供試品溶液9 份，分為3組，分別加入標示量80%、100%、120%水平的對照品溶液，每個水平平行3 份，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得根皮素平均加樣回收率為99.53%，RSD 為1.60%。

2.2 磷脂復合物制備 稱取處方量大豆卵磷脂、50 mg 根皮素（45℃下真空干燥12 h） 置于圓底燒瓶中，加入50 mL四氫呋喃后得混懸液，恒溫攪拌一定時間后減壓旋蒸除去四氫呋喃，收集殘留物，45℃下真空干燥12 h，即得。

2.3 復合率測定 取根皮素（總量m0） 與適量大豆卵磷脂制成磷脂復合物，加入10 mL 石油醚溶解，過0.22 μm微孔濾膜除去游離藥物，揮去石油醚，加10 mL 乙腈重新溶解，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得形成磷脂復合物所需藥量（m1），計算復合率，公式為復合率＝（m1／m0） ×100%。

2.4 制備工藝優(yōu)化

2.4.1 大豆磷脂用量 固定根皮素用量為50 mg，四氫呋喃用量為40 mL，制備溫度為45℃，制備時間為4 h，考察大豆磷脂用量130、140、150、160、170 mg 對復合率的影響，結(jié)果見圖1。由此可知，隨著大豆磷脂用量逐漸增加，復合率也逐漸升高，在160 mg 時最大（93.17%），故確定為160 mg。

圖1 大豆磷脂用量對復合率的影響

2.4.2 制備溫度 固定根皮素用量為50 mg，四氫呋喃用量為40 mL，制備時間為4 h，大豆磷脂用量為160 mg，考察制備溫度25、35、45、55、65℃對復合率的影響，結(jié)果見圖2。由此可知，隨著制備溫度逐漸升高，復合率也逐漸升高，但在65℃時反而下降，可能是由于大豆磷脂在溫度較高時氧化變質(zhì)所致，故確定為55℃。

圖2 制備溫度對復合率的影響

2.4.3 制備時間 固定根皮素用量為50 mg，四氫呋喃用量為40 mL，制備溫度為55℃，大豆磷脂用量為160 mg，考察制備時間2.5、3、3.5、4、4.5、5 h 對復合率的影響，結(jié)果見圖3。由此可知，隨著制備時間延長，復合率也逐漸升高，但在4 h 后有所下降，可能與時間過長導致大豆磷脂氧化變質(zhì)有關，故確定為4 h。

圖3 制備時間對復合率的影響

2.4.4 溶劑體積 固定根皮素用量為50 mg，制備時間為4 h，制備溫度為55℃，大豆磷脂用量為160 mg，考察溶劑（四氫呋喃） 體積20、25、30、35、40、45 mL 對復合率的影響，結(jié)果見圖4。由此可知，隨著溶劑體積逐漸增加，復合率也逐漸升高，在40 mL 時最大，可能是因為此時藥物、磷脂濃度下降，有利于增加2 種分子結(jié)合的機會，故確定為40 mL。

圖4 溶劑體積對復合率的影響

2.5 存在狀態(tài)研究 采用XRPD 對根皮素在磷脂復合物中的存在狀態(tài)進行研究，掃描范圍（2θ） 3°～45°，掃描速度8°／min，電流40 mA，Cu-Kα 靶，結(jié)果見圖5。由此可知，根皮素在3°～30°范圍內(nèi)有多處典型晶型峰，它與大豆卵磷脂簡單制備的物理混合物中可見其晶型峰，磷脂復合物中兩者特征晶型峰均消失，可能是因為它們形成磷脂復合物后各自極性端發(fā)生某種定性結(jié)合所致，同時也證明磷脂復合物并不是簡單的物理混合。另外，由于大豆磷脂XRPD峰強度遠遠低于根皮素，兩者制成物理混合物后后者XRPD 特征峰掩蓋了前者，導致物理混合物中幾乎未體現(xiàn)磷脂特征峰。

圖5 各樣品XRD 圖譜

2.6 溶解性能分析 取根皮素、物理混合物、磷脂復合物，加入蒸餾水（經(jīng)正辛醇飽和） 或正辛醇（經(jīng)蒸餾水飽和），25℃、800 r／min 磁力攪拌48 h，取適量混懸 液8 000 r／min離心15 min，取上清液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，計算表觀溶解度，結(jié)果見表1。由此可知，磷脂復合物在正辛醇、水中的表觀溶解度分別較原料藥提高4.74、2.62 倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），與磷脂復合物技術可同時改善難溶性藥物脂溶性、水溶性的報道相符。

表1 各樣品表觀溶解度測定結(jié)果（， n＝3）

表1 各樣品表觀溶解度測定結(jié)果（， n＝3）

注：與根皮素比較，**P＜0.01。

2.7 體內(nèi)藥動學研究

2.7.1 灌胃供試液制備 取根皮素、物理混合物、磷脂復合物適量，置于0.5% CMC-Na 溶液中，超聲分散，即得（15 mg／mL，以根皮素含有量計）。

2.7.2 給藥及取血 取Wistar 大鼠18 只，自然晝夜光線照明，隨機分為3組，灌胃給藥前禁食12 h，不禁水。各組大鼠均按100 mg／kg 劑量灌胃給予根皮素、物理混合物、磷脂復合物0.5% CMC-Na 混懸液，于0.167、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12 h 各取血約0.3 mL，保存于肝素浸潤的離心管中，2 500 r／min 離心3 min，上清液保存于冰箱冷凍室中。

2.7.3 樣品處理 取血漿、內(nèi)標溶液（400 ng／mL） 各100 μL，混勻后加入1.5 mL 乙酸乙酯，渦旋混勻3 min，10 000 r／min 離心8 min，上清液于50℃氮氣中吹干，100 μL 乙腈復溶，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。

2.7.4 線性關系考察 稱取巖白菜素對照品10.0 mg，溶于50 mL 乙腈中，得200 μg／mL 貯備液，精密量取1.0 mL于100 mL 量瓶中，乙腈定容至2 000 ng／mL，精密量取2.0 mL于10 mL 量瓶中，乙腈定容，得400 ng／mL 內(nèi)標溶液。

取上述貯備液，乙腈逐步稀釋成1 500、750、500、100、50、20 ng／mL，各取500 μL，加入500 μL 內(nèi)標溶液，50℃氮氣緩慢吹干后加入500 μL 空白血漿，按“2.7.3”項下方法處理。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X），根皮素與內(nèi)標峰面積比值為縱坐標（Y） 進行回歸，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，得方程為Y＝1.368 4X＋9.745 1（r＝0.992 3），在20～1 500 ng／mL 范圍內(nèi)線性關系良好，定量限（S／N＝10） 為8.0 ng／mL，檢測限（S／N ＝3） 為3.5 ng／mL。

2.7.5 方法學考察 取空白血漿、血漿對照品溶液（加根皮素對照品、內(nèi)標）、血漿樣品（加內(nèi)標），按“2.6.3”項下方法處理，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性物質(zhì)不干擾根皮素、內(nèi)標測定，表明該方法專屬性良好。取20、750、1 500 ng／mL 血漿對照品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得峰面積RSD 分別為3.11%、3.92%、2.88%，表明該方法重復性良好。每天在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定1 次，連續(xù)6 d，測得峰面積RSD 分別為11.06%、6.75%、4.01%，表明儀器精密度良好。取磷脂復合物灌胃給藥1 h 的血漿樣品，于0、2、4、8、12、24、48 h 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得峰面積RSD 為8.69%，表明溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。取上述3 種質(zhì)量濃度血漿對照品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得平均加樣回收率分別為91.01%、88.74%、97.05%，RSD 均小于6.96%。

2.7.6 實驗結(jié)果 圖6、表2 顯示，原料藥、物理混合物之間藥動學參數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與原料藥、物理混合物比較，磷脂復合物Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P＜0.01），tmax有所延長，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與原料藥比較，磷脂復合物的相對生物利用度提高至2.29 倍。

圖6 各樣品血藥濃度-時間曲線

3 討論

本實驗通過單因素實驗，確定根皮素磷脂復合物最優(yōu)處方為根皮素用量50 mg，大豆磷脂用量160 mg，制備時間4 h，制備溫度55℃，四氫呋喃體積40 mL，其中根皮素與大豆磷脂比例為1∶1.19。課題組前期曾以大豆磷脂用量（150、160、170 mg）、制備時間（3.5、4、4.5 h）、制備溫度（50、55、60℃）、四氫呋喃體積（35、40、45 mL） 為影響因素設計正交試驗作進一步優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)所得最優(yōu)工藝與單因素試驗一致（限于篇幅，不再展示相關數(shù)據(jù)），但方差分析顯示制備時間有極顯著差異（P＜0.01）。

表2 各樣品主要藥動學參數(shù)（， n＝6）

表2 各樣品主要藥動學參數(shù)（， n＝6）

注：與根皮素比較，＃＃P＜0.01；與物理混合物比較，ΔΔP＜0.01。

難溶性藥物分子與磷脂分子形成磷脂復合物后，前者水溶性和脂溶性均得到提高，以脂溶性更明顯，有利于其穿透過胃腸道黏膜。由于磷脂復合物中磷脂與胃腸道黏膜的高親和性，在磷脂轉(zhuǎn)換蛋白的協(xié)助下藥物分子與細胞膜結(jié)合、交換而順利進入機體血液循環(huán)［14-15］，最終提高難溶性藥物口服吸收生物利用度。藥動學研究結(jié)果表明，根皮素磷脂復合物Cmax、AUC0～t、AUC0～∞與原料藥混懸液相比差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），相對生物利用度提高至2.29 倍；物理混合物三者有所升高，可能與磷脂本身具有一定的促吸收作用有關，但藥動學參數(shù)無明顯差異（P＞0.05）。

由于根皮素在化妝品領域也具有較好的應用前景，今后可對其透皮吸收進行研究［16-17］。大量研究結(jié)果顯示，磷脂復合物可作為制劑中間體（如磷脂復合物固體分散體［18］、磷脂復合物固體脂質(zhì)納米粒［19］、磷脂復合物納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體［20］等），而本實驗制備的根皮素磷脂復合物也可為后續(xù)研究奠定基礎［21］。