石韋化學(xué)成分及其生物活性

何 康 范琳琳 伍天苔 申琳燕 王 繪 張 平 鄒 娟

（貴州中醫(yī)藥大學(xué)， 貴州 貴陽550025）

水龍骨科石韋屬植物全世界約有100 多種，中國現(xiàn)知有37 種［1］。該屬植物貴州分布約有13種［2］，其中石韋Pyrrosia lingua（Thunb.） Farwell為《中國藥典》 收載品種，在貴州少數(shù)民族地區(qū)，用于治療蛇毒咬傷等，也是貴州資源最豐富的種之一。目前，以石韋為主要原料的各種石韋復(fù)方制劑在臨床上廣泛應(yīng)用，市場上常見的“復(fù)方石韋片”“結(jié)石通片” “石韋膠囊” 等中成藥的療效得到了廣泛認(rèn)可［3］。最早為日本學(xué)者于1963 年從石韋中分離得到三萜類化學(xué)成分里白烯［4］，我國學(xué)者是從1984 年開始對該屬植物進(jìn)行化學(xué)成分研究［5］?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道表明該屬植物中的化學(xué)成分主要有三萜、黃酮、口山酮類等［6］。

為尋找貴州產(chǎn)石韋中的藥效物質(zhì)，本研究對黔產(chǎn)石韋的化學(xué)成分和生物活性進(jìn)行研究。從該植物中分離得到7個(gè)化合物，其中化合物3～6 為首次從該植物中分離得到。由于何帕烷型三萜主要來源于微生物中，植物源何帕烷型三萜化合物相對較少，對其活性研究也較少［7］。因此，本實(shí)驗(yàn)對其中3個(gè)何帕烷型三萜類化合物進(jìn)行抗腫瘤、抗細(xì)菌、抗真菌活性篩選。結(jié)果顯示，化合物2～3 對Hela 細(xì)胞有弱抑制作用，化合物1～2 對MCF-7 細(xì)胞有弱抑制作用，化合物3 對HepG 2 細(xì)胞有弱抑制作用，被測試化合物均不顯示抗菌活性。

1 材料

1.1 藥材 實(shí)驗(yàn)藥材于2015 年9 月采自貴州遵義，原植物經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院趙俊華教授鑒定為水龍骨科石韋屬石韋Pyrrosia lingua（Thunb.） Farwell，植物標(biāo)本存放于貴州中醫(yī)藥大學(xué)苗醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，標(biāo)本號為20150905101。

1.2 細(xì)胞、菌株及試劑供試腫瘤細(xì)胞株（A549、BEL-7402、HepG 2、Hela、MCF-7）、細(xì)菌（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌） 和真菌（黑根霉、黑曲霉、白色假絲酵母菌） 均由貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供和保存。RPMI 1640 培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS，美國Hyclone 公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT，美國Genview 公司）；二甲基亞砜（DMSO，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）。蛋白胨、酵母提取物（美國Oxoid 公司）；牛肉膏和瓊脂（美國Sigma 公司）。Sephadex LH-20（美國通用電氣醫(yī)療集團(tuán)）；GF254制備薄層板及200～300目柱色譜用硅膠（青島海洋化工有限公司）；所用試劑均為分析純。

1.3 儀器 酶標(biāo)儀（美國Biotek 公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific 公司）；立式壓力蒸氣滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；Allega X-15R臺式離心機(jī)（美國貝克曼庫爾特公司）；Bruker Q-TOF 質(zhì)譜儀（德國布魯克公司）；Varian Inova-400 MHz 核磁共振儀（美國瓦里安公司）；Buchi R215 實(shí)驗(yàn)室規(guī)模旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士步琪實(shí)驗(yàn)室儀器公司）；FZ102 微型植物粉碎機(jī)（上海書培實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；Metter-Toledo 電子天秤（瑞士Metter-Toledo 公司）。

2 提取與分離

自然干燥的石韋全草25.1 kg，粉碎成粗粉（60～80目），用85% 乙醇回流提取3 次（每次1 h），過濾提取液，減壓回收乙 醇后得浸膏2.8 kg。浸膏用蒸餾水溶解后經(jīng)D101 大孔樹脂柱，分別用水、50%乙醇、90%乙醇梯度洗脫，得到石韋50%、90%乙醇部分分別為251、132 g。90%乙醇部分先進(jìn)行硅膠柱層析，二氯甲烷-乙酸乙酯（100∶1～8∶2） 梯度洗脫，得到2個(gè)組分Fr.A1和Fr.A2。Fr.A1組分中析出結(jié)晶部分經(jīng)石油醚-乙酸乙酯（100∶1～8∶2） 梯度洗脫，重結(jié)晶后用Sephadex LH-20 進(jìn)行純化，得到化合物 2（215 mg）、3（240 mg）。Fr.A1組分母液部分進(jìn)行硅膠柱層析，石油醚-乙酸乙酯（100∶1～8∶2）梯度洗脫，得到4個(gè)組分Fr.A1-1～Fr.A1-4。Fr.A1-2 部分重結(jié)晶后用Sephadex LH-20 純化，得到化合物1（1.172 g）。Fr.A1-3 部分經(jīng)石油醚-乙酸乙酯（100∶1～8∶2） 梯度洗脫，用Sephadex LH-20 進(jìn)行純化，得到化合物4（18 mg）、7（14 mg）。50%乙醇部分經(jīng)二氯甲烷-甲醇（95∶5～8∶ 2）梯度洗脫，得到2個(gè)部分Fr.B1 和Fr.B2。Fr.B1 經(jīng)二氯甲烷-乙酸乙酯（100∶5） 洗脫得到化合物5（13 mg）、6（116 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色粉末，10%硫酸-乙醇溶液加熱顯紫紅色。ESI-MSm／z：427［M ＋H］＋，分子式C30H50O。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：3.97（1H，d，J＝11.3 Hz，H-28），3.14（1H，d，J＝11.3 Hz，H-28），1.29（3H，s，H-29），1.11（3H，s，H-30），0.97（6H，s，H-26，27），0.84（3H，s，H-23），0.81（3H，s，H-25），0.79（3H，s，H-24）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：15.8（C-1），16.3（C-2），16.4（C-3），18.7（C-4），18.8（C-5），18.7（C-6），33.6（C-7），42.1（C-8），50.7（C-9），37.6（C-10），21.2（C-11），23.7（C-12），47.9（C-13），42.0（C-14），32.8（C-15），23.5（C-16），49.7（C-17），43.1（C-18），36.0（C-19），26.5（C-20），47.8（C-21），74.8（C-22），33.5（C-23），21.7（C-24），16.1（C-25），16.7（C-26），17.2（C-27），65.6（C-28），26.1（C-29），30.2（C-30）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］基本一致，故鑒定為22，28-epoxyhopane。

化合物2：白色粉末，10%硫酸-乙醇溶液加熱顯紫紅色。ESI-MSm／z：427［M-H］-，分 子式C30H52O。1H-NMR（400 MHz，C5D5N）δ：5.00（2H，s，H-29），4.13（1H，d，J＝10.2 Hz，H-28），3.94（1H，d，J＝10.2 Hz，H-28），1.80（3H，s，H-30），1.27（3H，s，H-27），1.04（3H，s，H-26），0.89（3H，s，H-23），0.84（3H，s，H-25），0.83（3H，s，H-24）；13C-NMR（100 MHz，C5D5N）δ：40.7（C-1），19.2（C-2），42.8（C-3），33.0（C-4），56.5（C-5），19.3（C-6），34.0（C-7），42.8（C-8），51.2（C-9），37.8（C-10），22.1（C-11），26.8（C-12），51.2（C-13），42.5（C-14），34.4（C-15），22.1（C-16），55.0（C-17），50.3（C-18），36.6（C-19），28.2（C-20），46.7（C-21），149.5（C-22），33.8（C-23），22.1（C-24），16.3（C-25），17.8（C-26），17.4（C-27），60.9（C-28），110.3（C-29），25.8（C-30）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］基本一致，故鑒定為hop-22（29） -en-28-ol。

化合物3：白色粉末，10%硫酸-乙醇溶液加熱顯紫紅色。ESI-MSm／z：441［M ＋H］＋，分子式C30H48O2。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：1.45（3H，s，H-30），1.29（3H，s，H-29），0.98（3H，s，H-27），0.96（3H，s，H-26），0.84（3H，s，H-23），0.83（3H，s，H-25），0.78（3H，s，H-24）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：40.4（C-1），18.8（C-2），42.2（C-3），33.4（C-4），56.3（C-5），18.8（C-6），33.9（C-7），42.8（C-8），50.4（C-9），37.6（C-10），21.7（C-11），24.9（C-12），45.8（C-13），41.7（C-14），32.7（C-15），25.2（C-16），49.8（C-17），50.8（C-18），35.5（C-19），25.6（C-20），50.6（C-21），82.2（C-22），33.5（C-23），21.8（C-24），16.0（C-25），16.4（C-26），16.4（C-27），176.5（C-28），29.4（C-29），30.0（C-30）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］基本一致，故鑒定為hopan-28，22-olide。

化合物4：白色粉末，10%硫酸-乙醇溶液加熱顯紫紅色。ESI-MSm／z：439［M ＋H］＋，分子式C31H50O。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：4.66（2H，m，H-26），1.64（3H，s，H-27），1.10（3H，s，H-29），1.04（3H，s，H-28），1.03（3H，d，J＝7.2 Hz，H-31），0.91（3H，s，H-18），0.89（3H，s，H-30），0.87（3H，d，J＝6.6 Hz，H-21），0.78（1H，d，J＝4.2 Hz，H-19a），0.57（1H，d，J＝4.2 Hz，H-19b）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：33.4（C-1），37.5（C-2），216.7（C-3），50.3（C-4），48.4（C-5），21.5（C-6），28.1（C-7），47.9（C-8），21.1（C-9），26.0（C-10），26.8（C-11），32.8（C-12），48.7（C-13），45.4（C-14），35.9（C-15），25.9（C-16），52.3（C-17），18.1（C-18），29.6（C-19），36.0（C-20），18.3（C-21），33.9（C-22），31.5（C-23），41.6（C-24），150.2（C-25），109.4（C-26），18.6（C-27），22.2（C-28），20.8（C-29），19.3（C-30），20.2（C-31）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］基本一致，故鑒定為cyclolaudenone。

化合物5：無色油狀，10%硫酸-乙醇溶液加熱顯黑色。ESI-MSm／z：341［M-H］-，分子式C16H22O8。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.07（1H，d，J＝10.2 Hz，H-5′），6.68（1H，d，J＝2.1 Hz，H-2′），6.60（1H，dd，J＝10.2，2.1 Hz，H-6′），2.73（4H，brs，H-3，H-4），2.10（3H，s，H-1）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：30.0（C-1），211.1（C-2），45.9（C-3），30.2（C-4），138.2（C-1′），117.0（C-2′），145.1（C-3′），148.3（C-4′），119.0（C-5′），120.7（C-6′），104.6（C-1″），74.8（C-2″），77.5（C-3″），71.2（C-4″），78.2（C-5″），62.4（C-6″）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］基本一致，故鑒定為4-（3′，4′-dihydroxyphenyl） -butan-2-one-4′-O-β-D-glucoside。

化合物6：無色油狀，10%硫酸-乙醇溶液加熱顯黑 色。ESI-MSm／z：343［M-H］-，分子式C16H24O8。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.07（1H，d，J＝8.2 Hz，H-9），6.70（1H，s，H-6），6.61（1H，dd，J＝8.3，2.0 Hz，H-10），4.67（1H，d，J＝7.5 Hz，H-1′），3.87（1H，d，J＝10.5 Hz，H-6b′），3.70（1H，m，H-2），3.67（1H，dd，J＝11.5，4.9 Hz，H-6a′），3.28～3.50（4H，m，H-2′，3′，4′，5′），2.56（2H，m，H-4），1.66（2H，m，H-3），1.16（3H，d，J＝6.2 Hz，H-1）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：23.5（C-1），67.8（C-2），32.5（C-3），42.0（C-4），139.5（C-5），119.0（C-6），144.8（C-7），148.1（C-8），117.1（C-9），120.8（C-10），104.6（C-1′），74.8（C-2′），78.1（C-3′），71.2（C-4′），77.5（C-5′），62.3（C-6′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［12］基本一致，故鑒定為2-hydroxy-4-［（3S） -3-hydroxybutyl］phenyl-β-D-glucopyranoside。

化合物7：白色針晶體（乙酸乙酯），10% 硫酸-乙醇溶液加熱顯紫紅色。通過與β-sitosterol 對照品的TLC 對照，用多種溶劑系統(tǒng)展開后其Rf 值及顯色行為均相同［13］，故鑒定為β-sitosterol。

4 生物活性篩選

4.1 抗腫瘤采用 MTT 法，選用A549、BEL-7402、HepG 2、Hela、MCF-7 5 種細(xì)胞株，對分離得到的3個(gè)何帕烷型三萜進(jìn)行體外活性測試。用RPMI 1640 完全培養(yǎng)液（含有10%胎牛血清），于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取對數(shù)期細(xì)胞，離心，用10%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基重懸，按每孔8 000個(gè)細(xì)胞接種于96 孔板中，按濃度梯度為20、10、5、2.5、1.25 μmol／L 加入待測品，以DMSO 溶劑為對照組，阿霉素為陽性對照，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。用顯微鏡采集圖片，離心，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入10 μL MTT 的新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心去除上清液，每孔加入160 μL DMSO，室溫震蕩15 min，在490 nm 光激發(fā)下用酶標(biāo)儀測吸光度值（OD）。每次篩選平行3 次，重復(fù)2 次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以（） 表示。抑制率＝［（OD對照組-OD樣品組） ／OD對照組］×100%。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，化合物1～2 對MCF-7 細(xì)胞有弱抑制作用，化合物2～3 對Hela 細(xì)胞有弱抑制作用，化合物3 對HepG 2 細(xì)胞有弱抑制作用，見表1。

表1 抗腫瘤實(shí)驗(yàn)抑制率（）Tab.1 Inhibition rate in antitumor tests（）

表1 抗腫瘤實(shí)驗(yàn)抑制率（）Tab.1 Inhibition rate in antitumor tests（）

4.2 抗菌 采用瓊脂平板打孔法，選擇大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌，以及黑根霉、黑曲霉和白色念珠菌，以慶大霉素和制霉菌素作為陽性對照，設(shè)陽性對照藥質(zhì)量濃度為0.1 mg／mL，樣品質(zhì)量濃度為10 mg／mL，每孔加入40 μL，每個(gè)藥物重復(fù)2 次，結(jié)果取平均值。將標(biāo)準(zhǔn)菌接種于培養(yǎng)基中，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h。制備營養(yǎng)瓊脂平板，用移液器吸取0.1 mL 菌液加入平皿中，然后用涂布器將菌液均勻涂布在營養(yǎng)瓊脂平板上；再用打孔器在營養(yǎng)瓊脂平板上等距離打6個(gè)孔，打孔直徑為6.18 mm；將供試藥液加于孔中，在37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，觀察是否有抑菌圈，測量抑菌圈直徑。結(jié)果顯示，化合物1～3 均未產(chǎn)生抑菌圈，無抑菌活性。

5 結(jié)論

本研究從黔產(chǎn)石韋中分離得到7個(gè)化合物，其中化合物3～6 為首次從該植物中分離得到，對分離得到的3個(gè)何帕烷型三萜類化合物進(jìn)行5 種腫瘤細(xì)胞株、3 種細(xì)菌和3 種真菌的抑制活性測試。結(jié)果顯示何帕烷型三萜化合物具有微弱的抗腫瘤活性，但無抗菌活性。以期為石韋的合理用藥和開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。