卟啉半遙爪聚合物的制備及其在光動(dòng)力療法中的應(yīng)用探討

陳 帥， 龐瑞淇， 劉思奕， 洪晨雨， 馬紹花， 杲 云， 田 佳

（華東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200237）

光動(dòng)力療法是一種具有廣闊應(yīng)用前景的癌癥治療的新型方法，由于其創(chuàng)傷性小、毒副作用低、選擇性高等優(yōu)點(diǎn)受到日益廣泛的關(guān)注和研究[1-4]。該療法主要利用一定波長(zhǎng)的光對(duì)富集于腫瘤部位的光敏劑（Ps）進(jìn)行輻照，產(chǎn)生高度活性且細(xì)胞毒性的活性氧簇（ROS）如單線態(tài)氧（1O2）、羥基自由基(·OH)等, 這樣對(duì)細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)造成不可逆的損傷，從而達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的[4-7]。光動(dòng)力療法需具備Ps、光源和分子氧3 個(gè)基本要素，其中Ps是光動(dòng)力過程中的核心要素[8-9]。卟啉及其衍生物是一類典型的Ps，因其在可見光區(qū)域有較強(qiáng)吸收、光穩(wěn)定性好、1O2產(chǎn)率高等特點(diǎn)在光動(dòng)力治療方面受到越來越多科學(xué)家的青睞[10-13]。但由于卟啉中四吡咯環(huán)的大π 結(jié)構(gòu)，疏水性較強(qiáng)，在水溶液中很容易π-π 聚集產(chǎn)生自淬滅效應(yīng)，嚴(yán)重降低了量子產(chǎn)率，限制了在光動(dòng)力療法中的應(yīng)用[14-18]。

為了解決卟啉類光敏劑親水性差的問題，國(guó)內(nèi)外許多課題組已經(jīng)做了大量研究，例如提出通過接枝親水性高分子或?qū)s 包載于納米載體中的策略。Sun 等[19]通過開環(huán)聚合（ROP）合成了一系列以卟啉為核的星狀聚（ε-己內(nèi)酯）-b-聚（環(huán)氧乙烷）（SPPCL-b-PEO）兩親性嵌段共聚物，可以自組裝成一定結(jié)構(gòu)的納米組裝體，不僅可以改善卟啉的光動(dòng)力效果，還可以用于包載疏水性藥物。Na 等[20]將乙酰化硫酸軟骨素（Ac-CS）和二氫卟吩（Ce6）通過酯鍵連接起來得到乙?；蛩彳浌撬?二氫卟吩軛合物（Ac-CS/Ce6），在水相中可以組裝形成以Ce6 為內(nèi)核，以CS 為親水性殼層的納米組裝體。由于Ce6 分子間距離很短發(fā)生自淬滅效應(yīng)，熒光發(fā)射和1O2均受到抑制，在腫瘤細(xì)胞中CS 骨架被胞外基質(zhì)和胞內(nèi)組分如溶酶體切斷，其熒光可以恢復(fù)，產(chǎn)生大量1O2。Duan等[21]通過可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移（RAFT）聚合合成了一種新穎的梳型卟啉端基功能化聚（N-異丙基丙烯酰胺）-b-聚（低聚甲基丙烯酸乙二醇甲醚）（Por-PNIPAM-b-POEGMA），由于引入了親水性的POEGMA，該共聚物的低臨界溶液溫度（LCST）比PNIPAM 均聚物的高，相變范圍為37～41.8 ℃。在650 nm 光照下該共聚物可以產(chǎn)生較多的1O2，可以有效地用于光動(dòng)力治療。此外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明該共聚物暗毒性很低，在650 nm 紅光照射下對(duì)HeLa 細(xì)胞具有很顯著的光毒性。以上通過接枝親水性高分子合成高分子卟啉軛合物的方法，雖然能夠部分解決卟啉親水性不足的問題，但合成比較繁瑣，并且高分子鏈長(zhǎng)對(duì)1O2產(chǎn)率和光動(dòng)力療法的影響研究也較少。

本文通過“點(diǎn)擊化學(xué)”偶聯(lián)反應(yīng)將不同分子量的親水性高分子聚乙二醇（PEG）與卟啉光敏劑（TPP）鍵合在一起，成功合成了一系列水溶性好的卟啉半遙爪聚合物（TPP-PEG），并研究了PEG 鏈長(zhǎng)對(duì)1O2產(chǎn)率和細(xì)胞光毒性的影響，用以評(píng)價(jià)TPP-PEG 作為潛在的大分子光敏劑在光動(dòng)力療法中的應(yīng)用；同時(shí)本文進(jìn)一步利用紫外-可見光譜檢測(cè)1O2產(chǎn)率和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)此類卟啉半遙爪聚合物的在光動(dòng)力療法中的潛在應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料和試劑

吡咯、苯甲醛、三氯乙酸、三氟乙酸、乙酸、3-溴丙炔、濃鹽酸（HCl）、無水碳酸鉀（K2CO3）、聚乙二醇（PEG，Mn=1 000，2 000，5 000）、抗壞血酸鈉、1,3-二苯基異苯并呋喃（DPBF）均購(gòu)于阿拉丁試劑有限公司；亞硝酸鈉（NaNO2）購(gòu)于上海凌峰試劑有限公司；氯化亞錫二水合物（SnCl2·2H2O）、醋酸鋅二水合物（ZnAc2·2H2O）購(gòu)于上海笛柏生物科技有限公司；對(duì)甲基苯甲酰氯（TsCl）購(gòu)于薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司；疊氮化鈉（NaN3），五水合硫酸銅（CuSO4·5H2O），氯化鈉（NaCl）、氫氧化鈉（NaOH）、無水硫酸鈉（Na2SO4）、碳酸氫鈉（NaHCO3）、三乙胺（TEA）、丙酸、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亞砜（DMSO）、二氯甲烷、四氫呋喃（THF）、石油醚、甲醇均購(gòu)于國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；牛血清蛋白（FBS）、（Dulbecco’s modified eagle medium）、青霉素和鏈霉素均購(gòu)于上海鈺康生物科技有限公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，200～300 目（75～48 μm）硅膠購(gòu)于江友硅膠開發(fā)有限公司；所有試劑均為分析純?cè)噭＿量?、二氯甲烷、DMF 在使用前均加入氫化鈣進(jìn)行干燥處理，減壓蒸餾后方可使用。

1.2 測(cè)試與表征

核磁共振氫譜（1H-NMR）：采用德國(guó)Brucker 的AVANCE Ⅲ500 型核磁共振儀（400 MHz），以氘代氯仿（CDCl3）為溶劑，四甲基硅烷（TMS）為內(nèi)標(biāo)。

紫外-可見光吸收光譜（UV-Vis）：采用日本SHIMADZU 公司生產(chǎn)的型號(hào)為UV-2550 的紫外可見光光度計(jì)，將樣品配成溶液裝在光程為1 cm 的石英比色皿中檢測(cè)，掃描范圍300～700 nm。

動(dòng)態(tài)光散射（DLS）：采用美國(guó)Beckman Coulter公司生產(chǎn)的Delasa Nano C particle Analyzer 型動(dòng)態(tài)光散射儀，將組裝溶液裝在光程為1 cm 的石英比色皿中進(jìn)行檢測(cè)。

分光光度計(jì)酶標(biāo)儀：采用美國(guó)Thermo Fisher 公司生產(chǎn)的Multiskan MK3 型的分光光度計(jì)酶標(biāo)儀，檢測(cè)492 nm 處的吸光度。

1.3 合成方法

半遙爪（Semitelechelic）聚合物是指分子末端帶有一個(gè)功能性基團(tuán)的線型聚合物。首先通過取代反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)等合成了炔基修飾的鋅卟啉（ZnTPP-alkyne）和末端含疊氮基的PEG（PEG-N3），在Cu+離子的催化作用下發(fā)生“點(diǎn)擊化學(xué)”反應(yīng)得到鋅卟啉半遙爪聚合物（ZnTPP-PEG），之后加入鹽酸除去Zn2+得到最終的產(chǎn)物卟啉半遙爪聚合物（TPPPEG），合成過程見圖1。這類親水性的卟啉半遙爪聚合物能夠顯著提高光敏劑的親水性，解決光敏劑易聚集淬滅、1O2產(chǎn)率低、生物相容性差等問題。參考課題組之前的工作[13,22-23]，末端帶有卟啉的水溶性卟啉半遙爪聚合物TPP-PEG1000、TPP-PEG2000、TPPPEG5000的合成路線見圖2。

1.3.1 四苯基卟啉（TPP）的合成 在500 mL 三口燒瓶中加入苯甲醛（7.2 mL，70 mmol）和240 mL 丙酸攪拌均勻，抽真空、通氮?dú)? 次循環(huán)后，加熱至135 ℃回流，將恒壓滴液漏斗中干燥的吡咯（5.0 mL，70 mmol）逐滴滴加到反應(yīng)瓶中，滴加完畢后繼續(xù)攪拌反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫并減壓蒸餾除去大部分丙酸，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至燒杯中并加入100 mL 甲醇，放于冰箱中冷藏過夜，次日抽濾得到紫色的粗產(chǎn)品，通過柱層析法以二氯甲烷為洗脫劑進(jìn)一步純化，產(chǎn)物在真空烘箱中干燥，得到紫色固體化合物TPP（7.7 g，產(chǎn)率18%）。1H-NMR（400 MHz，CDCl3，δ）：8.84（m，8H，β?H），8.23（m，6H，Ar?H），7.80（m，12H，Ar?H），—2.75（s，2H，NH）。

1.3.2 單硝基苯基卟啉（TPP-NO2）的合成 將TPP（1.01 g，1.63 mmol）、冰乙酸（9.3 mL，162.9 mmol）、三氟乙酸（7.2 mL，92.9 mmol）和三氯乙酸（26.60 g，163.0 mmol）加入到100 mL 圓底燒瓶中，在冰水浴下攪拌15 min 使其混合均勻。將亞硝酸鈉（0.56 g，8.0 mmol）分為等量的3 份，每隔1 h 加一份到反應(yīng)瓶中，加入完畢后冰水浴中繼續(xù)反應(yīng)10 h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入到50 mL 去離子水中淬滅反應(yīng)，用50 mL二氯甲烷萃取3 次，合并有機(jī)相，并用碳酸氫鈉水溶液中和體系中過量的酸至溶液呈紫色，之后再用去離子水洗滌，無水硫酸鈉干燥，抽濾后濾液旋干放在真空干燥箱中干燥，得到粗產(chǎn)品化合物TPP-NO2（0.61 g，產(chǎn)率57 %）。1H-NMR（400 MHz，CDCl3，δ）：8.72～8.98（m，8H，β?H），8.65（m，2H，Ar?H），8.38（m，2H，Ar?H），8.20（m，6H，Ar?H），7.75（m，9H，Ar?H），—2.75（s，2H，NH）。

圖1 制備卟啉半遙爪聚合物TPP-PEG 納米膠束及其在腫瘤細(xì)胞中光動(dòng)力過程的示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the preparation of porphyrin semitelechelic polymers TPP-PEG nano-micelle and the process of PDT in tumor cells.

1.3.3 單氨基苯基卟啉（TPP-NH2）的合成 將上一步得到的TPP-NO2（0.61 g，0.92 mmol）加入到100 mL三口燒瓶中，加入30 mL 濃鹽酸后充分?jǐn)嚢杈鶆?，抽真空通氮?dú)庋h(huán)3 次。將氯化亞錫二水合物（4.00 g，17.7 mmol）溶于10 mL 濃鹽酸中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下緩慢滴加到反應(yīng)瓶中，80 ℃ 下反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，抽濾棄去濾液，濾餅用飽和氫氧化鈉水溶液洗滌至紫色，之后再用去離子水洗滌，二氯甲烷復(fù)溶后通過柱層析法以二氯甲烷/石油醚（其體積比為1∶1）為洗脫劑進(jìn)一步純化，產(chǎn)物在真空烘箱中干燥，得到紫色固體化合物TPP-NH2（0.52 g，產(chǎn)率89%）。1H-NMR（400 MHz，CDCl3，δ）：8.83（m，8H，β?H），8.20（m，6H，Ar?H），7.98（d，2H，Ar?H），7.75（m，9H，Ar?H） ， 7.04（ d， 2H， Ar?H） ， 4.00（ s， 2H， NH2） ，—2.75（s，2H，NH）。

1.3.4 單炔基苯基卟啉（TPP-alkyne）的合成 將TPPNH2（0.50 g，0.79 mmol）、無水碳酸鉀（1.09 g，7.9 mmol）、3-溴丙炔（0.94 g，7.9 mmol）加入到50 mL 三口燒瓶中，之后加入20 mL 無水DMF，通氮?dú)?0 min 后密封，油浴加熱至70 ℃ 反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后，用二氯甲烷溶解并用飽和氯化鈉水溶液洗滌3 次，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，抽濾后濾液旋蒸濃縮，通過柱層析法以二氯甲烷/石油醚（體積比為1∶2）為洗脫劑進(jìn)一步純化，產(chǎn)物在真空烘箱中干燥，得到紫色固體化合物TPP-alkyne（0.41 g，產(chǎn) 率78%）。1H-NMR（400 MHz，CDCl3，δ）：8.83（m，8H，β?H），8.20（m，6H，Ar?H），8.13（d，2H，Ar?H），7.75（m，9H，Ar?H），7.32（d，2H，Ar?H），4.41（s，2H，CH2），2.42（s，1H，CH），—2.75（s，2H，NH）。

1.3.5 單炔基苯基鋅卟啉（ZnTPP-alkyne）的合成 將TPP-alkyne（0.40 g，0.60 mmol）和二水合醋酸鋅（1.32 g，6.0 mmol）加入到500 mL 圓底燒瓶中，加入200 mL 二氯甲烷/甲醇（其體積比為3∶1）混合溶劑攪拌，室溫下反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束旋干后用二氯甲烷復(fù)溶，抽濾棄去濾渣，濾液旋蒸濃縮后通過柱層析法以二氯甲烷為洗脫劑進(jìn)一步純化，產(chǎn)物在真空烘箱中干燥，得到紫色固體化合物ZnTPP-alkyne（0.40 g，產(chǎn)率92%）。1H-NMR（400 MHz，CDCl3，δ）：8.94（m，8H，β?H），8.22（m，6H，Ar?H），8.13（d，2H，Ar?H），7.75（m，9H，Ar?H），7.32（d，2H，Ar?H），4.41（s，2H，CH2），2.42（s，1H，CH）。

圖2 親水性卟啉聚乙二醇半遙爪聚合物TPP-PEG 的合成路線Fig. 2 The synthesis procedure of hydrophilic porphyrin semitelechelic polymer TPP-PEG

1.3.6 聚乙二醇單甲醚對(duì)甲苯磺酸酯（PEG-OTs）的合成 以PEG2000-OTs 的制備為例，將聚乙二醇單甲醚PEG-OH（分子量Mn=2 000，4.0 g，2.0 mol）溶于30 mLTHF 中，緩慢加入5 mL 的氫氧化鈉（0.24 g，6 mmol）水溶液，攪拌均勻后冰水浴至0 ℃。將對(duì)甲基苯甲酰氯（0.92 g，4.8 mmol）溶于10 mLTHF 中，逐滴加入到反應(yīng)瓶中。滴加完畢后，轉(zhuǎn)移至室溫下反應(yīng)過夜，次日旋蒸除去THF，用二氯甲烷復(fù)溶，并用適量飽和氯化鈉水溶液洗滌3 次，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥旋蒸濃縮，濃縮液在200 mL 冰乙醚中沉淀3 次，抽濾濾餅放在真空烘箱中干燥，得到白色固體化合物PEG-OTs（3.5 g，產(chǎn)率81%）。1H-NMR（400 MHz，CDCl3，δ）：7.80（d，2H，Ar?H），7.34（m，2H，Ar?H），3.65（m，180H，CH2），3.31（s，3H，O?CH3），2.44（s，3H，Ar?CH3）。

1.3.7 末端含疊氮基聚乙二醇單甲醚化合物（PEGN3）的合成 將化合物PEG2000-OTs（2.17 g，1.0 mmol）、疊氮化鈉（0.65 g，10 mmol）加入25 mL 圓底燒瓶中，加入10 mL 無水DMF 攪拌溶解，50 ℃ 油浴反應(yīng)48 h。反應(yīng)結(jié)束后抽濾棄去濾渣，濾液中加入二氯甲烷溶解，并用適量飽和氯化鈉水溶液洗滌3 次，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥旋蒸濃縮，濃縮液在200 mL 冰乙醚中沉淀3 次，抽濾濾餅放在真空烘箱中干燥，得到白色 固 體 化 合 物PEG-N3（1.77 g，產(chǎn) 率87%）。1HNMR（400 MHz，CDCl3，δ）：3.58（m，180H，CH2），3.31（s，3H，O?CH3）。

1.3.8 “點(diǎn)擊化學(xué)”偶聯(lián)反應(yīng)合成鋅卟啉半遙爪聚合物（ZnTPP-PEG2000） 將化合物ZnTPP-alkyne（100 mg，0.137 mmol） 、 化 合 物PEG2000-N3（ 419 mg， 0.206 mmol）和抗壞血酸鈉（136 mg，0.685 mmol）加入到50 mL 三口燒瓶中，再加入20 mL THF 攪拌溶解，抽真空、通氮?dú)夥磸?fù)3 次后繼續(xù)通氮?dú)?0 min，將五水合硫酸銅（34 mg，0.137 mmol）溶于1～2 mL 去離子水后用注射器迅速加入到反應(yīng)瓶中，繼續(xù)通氮?dú)?0 min后密封，50 ℃下反應(yīng)48 h。反應(yīng)結(jié)束后旋蒸除去溶劑，加入50 mL 二氯甲烷溶解，用飽和氯化鈉水溶液洗滌3 次，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥后旋蒸濃縮，通過柱層析法以二氯甲烷/甲醇（其體積比為20:1）為洗脫劑進(jìn)一步純化，產(chǎn)物在真空烘箱中干燥，得到紫色固體化合物ZnTPP-PEG2000（237 mg，產(chǎn)率62%）。1HNMR（ 400 MHz， CDCl3， δ） ： 8.87（ m， 8H， β?H） ，8.19（m，6H，Ar?H），8.04（d，3H，Ar?H），7.74（m，9H，Ar?H），7.30（d，2H，Ar?H），4.87（s，2H，CH2），3.57（m，180H，CH2），3.36（s，3H，O?CH3）。

1.3.9 卟啉半遙爪聚合物（TPP-PEG2000）的合成 將化合物ZnTPP-PEG2000（100 mg，0.036 mmol）加入到25 mL圓底燒瓶中，用10 mL 二氯甲烷溶解后加入1.0 mL濃鹽酸，室溫下攪拌反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，加入適量三乙胺調(diào)節(jié)pH 使溶液呈堿性，抽濾棄去濾渣后濾液用飽和氯化鈉水溶液洗滌3 次，二氯甲烷萃取，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥后旋蒸濃縮，通過柱層析法以二氯甲烷/甲醇（其體積比為20:1）為洗脫劑進(jìn)一步純化，產(chǎn)物在真空烘箱中干燥，得到紫色固體化合物TPP-PEG2000（ 89 mg， 95%） 。1H-NMR（ 400 MHz，CDCl3，δ）：8.85（m，8H，β?H），8.21（m，6H，Ar?H），8.04（d，3H，Ar?H），7.76（m，9H，Ar?H），7.30（d，2H，Ar?H） ， 4.87（ s， 2H， CH2） ， 3.57（ m， 180H， CH2） ，3.36（s，3H，O?CH3），—2.78（s，2H，NH）。

分子量為1 000 和5 000 的卟啉聚乙二醇半遙爪聚合物（TPP-PEG1000、TPP-PEG5000）的合成方法同上。

1.4 紫外-可見光檢測(cè)

取100 μLTPP 質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 的DMSO溶液，在超聲條件下滴入2.0 mL 去離子水中，用透析袋透析除去有機(jī)溶劑，加適量去離子水稀釋成質(zhì)量濃度為10 μmol/L 的溶液。用同樣的方法得到TPPPEG1000、TPP-PEG2000和TPP-PEG5000的組裝溶液。利用紫外-可見分光光度計(jì)檢測(cè)各溶液的紫外-可見光光譜。

1.5 1O2 檢測(cè)

以1,3-二苯基異苯并呋喃（DPBF）作為1O2捕獲劑，因?yàn)檫策肿釉诠庹障庐a(chǎn)生的1O2能夠破壞DPBF 的化學(xué)結(jié)構(gòu)，使其在紫外可見光區(qū)域的吸光度明顯下降，從而檢測(cè)1O2的產(chǎn)生。分別配制質(zhì)量濃度為10 μmol/L 的TPP、TPP-PEG1000、TPP-PEG2000和TPPPEG5000組裝溶液，取2.0 mL 于石英比色皿中，以不加DPBF 的待測(cè)試樣為基線進(jìn)行校正。加入10 μL質(zhì)量濃度為5 mg/mL DPBF 的DMF 溶液。在波長(zhǎng)為655 nm、功率為0.6 W/cm2的激光燈下光照10 s后檢測(cè)溶液的紫外-可見光吸收光譜。

1.6 組裝體粒徑的測(cè)試

將組裝后的溶液置于光程1 cm 的石英比色皿中，利用動(dòng)態(tài)光散射（DLS）分析儀對(duì)TPP、TPPPEG1000、TPP-PEG2000和TPP-PEG5000的組裝溶液進(jìn)行粒徑的測(cè)定。

1.7 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

選擇HeLa 細(xì)胞來評(píng)估TPP-PEG 的細(xì)胞暗毒性。首先將HeLa 細(xì)胞接種在96 孔板上，密度為每孔5×103個(gè)細(xì)胞，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，在孔板中分別加入相同質(zhì)量濃度卟啉的TPP、TPPPEG1000、TPP-PEG2000、TPP-PEG5000溶液，培養(yǎng)24 h 后加入含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% 3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）（5 mg/mL 磷酸緩沖鹽溶液，PBS 溶液）的DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后吸出含有MTT 的培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，用分光光度計(jì)酶標(biāo)儀（Thermo Multiskan MK3 光譜儀）檢測(cè)492 nm 處的吸光度。細(xì)胞存活率（Rc）計(jì)算如下式：

其中，ODtest為加入樣品后溶液的吸光度，ODcontrol為沒加樣品的溶液吸光度，ODbackground為空的孔板的吸光度。

細(xì)胞光毒性實(shí)驗(yàn)采用上述類似的方法來評(píng)估TPP、TPP-PEG1000、TPP-PEG2000、TPP-PEG5000的體外光毒性：將樣品加入孔板中后培養(yǎng)24 h，用波長(zhǎng)為655 nm 激光燈（功率為0.6 W/cm2）照射10 min，放于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。最后加入MTT 以及DMSO利用分光光度計(jì)酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞的存活情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物的合成與分析

化 合 物TPP-NH2，TPP-alkyne，ZnTPP-alkyne 的核磁共振氫譜如圖3 所示。圖3(a)中化學(xué)位移在8.83、?2.75 處的信號(hào)峰屬于卟啉環(huán)上的特征峰，而化學(xué)位移在8.20～7.00 處的信號(hào)峰屬于苯環(huán)上的質(zhì)子峰，化學(xué)位移在4.00 處的信號(hào)峰則屬于苯環(huán)上氨基（—NH2）的質(zhì)子峰，這些都表明實(shí)驗(yàn)已成功合成出TPP-NH2。通過TPP-NH2與3-溴丙炔取代反應(yīng)得到單炔基苯基卟啉TPP-alkyne，其1H-NMR 譜（圖3(b)）中明顯多出了化學(xué)位移在4.42 處的亞甲基（—CH2—）和2.41 處的炔基（—CH）的質(zhì)子峰，說明實(shí)驗(yàn)已合成出TPP-alkyne。卟啉分子中心具有較強(qiáng)的與金屬離子配位能力，在進(jìn)行點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)之前，要引入金屬離子進(jìn)行配位。在此采用醋酸鋅與卟啉配位絡(luò)合，得到單炔基苯基鋅卟啉ZnTPP-alkyne，其1H-NMR 譜（圖3(c)）中化學(xué)位移在?2.75 處的卟啉核心特征峰消失，表明鋅離子成功絡(luò)合。

PEG-OH 與TsCl 反應(yīng)得到聚乙二醇單甲醚對(duì)甲苯磺酸酯（PEG-OTs），以PEG2000為例，其1H-NMR 譜（圖4(a)）中化學(xué)位移在7.80 處和7.34 處的信號(hào)峰是苯環(huán)上的質(zhì)子峰，3.64、3.37 處的峰分別是聚乙二醇高分子鏈上的亞甲基（—CH2—）和甲基（—CH3）的特征質(zhì)子峰，化學(xué)位移在2.44 處的信號(hào)峰是苯環(huán)上甲基的質(zhì)子峰。PEG-OTs 與NaN3發(fā)生取代反應(yīng)，得到末端含疊氮基的聚乙二醇高分子PEG2000-N3，其1HNMR 譜（圖4(b)）中 化 學(xué) 位 移 在7.80、7.34 處 和2.44 處的信號(hào)峰明顯消失，表明疊氮基已取代對(duì)甲苯磺酸基，實(shí)驗(yàn)已成功合成出PEG2000-N3。

ZnTPP-alkyne 和PEG-N3的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)以硫酸銅/抗壞血酸鈉為催化劑，由于還原產(chǎn)生的一價(jià)亞銅離子（Cu+）很容易被氧化，因此在反應(yīng)前體系中通氮?dú)膺M(jìn)行保護(hù)。通過水洗、柱層析等方法除去催化劑和未反應(yīng)物，得到產(chǎn)物鋅卟啉半遙爪聚合物ZnTPP-PEG。 以TPP-PEG2000為 例， 其1H-NMR 譜（圖5(a)）中既有卟啉分子的信號(hào)峰，也有聚乙二醇的信號(hào)峰，表明成功合成出ZnTPP-PEG2000。加入鹽酸除去ZnTPP-PEG 卟啉中心配位的鋅離子，之后加入三乙胺以除去過量的酸并將卟啉分子去質(zhì)子化，進(jìn)一步純化后得到TPP-PEG2000。相比于ZnTPPPEG2000，TPP-PEG2000的1H-NMR 譜（圖5(b)）中明顯出現(xiàn)化學(xué)位移在?2.78 處的信號(hào)峰，表明已除去Zn2+，成功合成了卟啉半遙爪聚合物TPP-PEG2000。

圖3 化合物TPP-NH2 (a)；TPP-alkyne (b)和ZnTPP-alkyne(c)的核磁共振氫譜Fig. 3 1H-NMR spectra of TPP-NH2 (a); TPP-alkyne (b) and ZnTPP-alkyne (c)

圖6 是卟啉小分子TPP 和不同鏈長(zhǎng)聚乙二醇的卟啉半遙爪聚合物光敏劑TPP-PEG 在水中的紫外-可見光譜，從圖中可以看出，TPP-PEG 在420 nm 處有一個(gè)強(qiáng)烈的吸收峰（S 帶，卟啉的特征吸收峰），在500～700 nm 區(qū)域有比較弱但很寬的吸收峰（Q 帶），同時(shí)在655 nm 處有一個(gè)較弱的吸收峰。TPP 小分子在420 nm 處的吸收峰有明顯的紅移（8～9 nm）并且吸收峰變寬，說明水溶性很差的光敏劑卟啉分子在水中發(fā)生嚴(yán)重的π-π 堆積。

圖4 聚合物PEG2000-OTs(a) 和PEG2000-N3(b) 的核磁共振氫譜 Fig. 4 1H-NMR spectra of PEG2000-OTs (a) and PEG2000-N3 (b)

2.2 1O2 的測(cè)定與比較

大多數(shù)光敏劑都是疏水性的，在水溶液中很容易聚集，導(dǎo)致1O2的產(chǎn)率大大下降。在卟啉分子上引入親水性的高分子鏈如聚乙二醇，能夠極大地改善了光敏劑的水溶性，減少其π-π 堆積從而提高1O2的產(chǎn)率。以DPBF 為1O2的捕獲試劑，光敏劑產(chǎn)生的1O2越多，DPBF 降解得就越快，其紫外可見光區(qū)域的吸光度下降的越多。圖7 分別示出了在TPP、TPPPEG1000、TPP-PEG2000、TPP-PEG5000水溶液中DPBF 的紫外-可見光吸光度隨光照時(shí)間的變化情況。從圖7(a)中可以看出，在卟啉小分子TPP 水溶液中，隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)，DPBF 的吸光度基本上沒有太大變化，這是由于卟啉分子由于π-π 堆積而處于淬滅狀態(tài)，無法產(chǎn)生大量的1O2。當(dāng)為TPP-PEG 時(shí)，DPBF 的吸光度隨著光照時(shí)間的增長(zhǎng)迅速下降（圖7b～7d），說明TPP-PEG 在光照下產(chǎn)生了大量的1O2。由圖7 中可以看出，TPP-PEG 樣品中的DPBF 吸光度的每10 s間隔的下降幅度比TPP 中的吸光度下降幅度大。

圖5 半遙爪聚合物ZnTPP-PEG2000 (a)和TPP-PEG2000 (b)的核磁共振氫譜Fig. 5 1H-NMR spectra of ZnTPP-PEG2000 (a) and TPP-PEG2000 (b)

圖6 TPP、TPP-PEG1000、TPP-PEG2000 和TPP-PEG5000 在水溶液中的紫外-可見光譜Fig. 6 UV-Vis spectra of TPP、TPP-PEG1000、TPP-PEG2000 and TPP-PEG5000 in aqueous solution

為了更清楚地比較各樣品的1O2產(chǎn)生能力，本文選取423 nm 處DPBF 的吸光度隨光照時(shí)間的變化情況作圖并比較。圖8 所示為TPP 和不同PEG 鏈長(zhǎng)的TPP-PEG 樣品溶液中DPBF 在423 nm處的紫外-可見光吸光度隨光照時(shí)間的變化情況?？梢灾庇^地看到，在TPP-PEG1000溶液中DPBF吸光度下降得最快，其次是TPP-PEG2000溶液，TPP-PEG5000溶液中DPBF吸光度下降得較慢，TPP 溶液下降最慢，說明與TPP 小分子光敏劑相比較，TPP-PEG 在光照下能夠更快地產(chǎn)生1O2，并且其產(chǎn)生速度與所連接親水段聚乙二醇的鏈長(zhǎng)成相反關(guān)系。

圖7 TPP(a)、 TPP-PEG1000(b)、 TPP-PEG2000(c)和 TPPPEG5000(d)水溶液每10 s 光照后，DPBF 的紫外-可見光吸收光譜Fig. 7 UV-Vis absorption spectra of DPBF in TPP (a); TPPPEG1000 (b); TPP-PEG2000 (c); TPP-PEG5000 and (d)solution after irradiation every 10 s

圖8 TPP、TPP-PEG1000、TPP-PEG2000 和TPP-PEG5000 水溶液中DPBF 在423 nm 處的紫外-可見光吸收光度隨光照時(shí)間的變化Fig. 8 Plots of DPBF’s UV-Vis absorbance at 423 nm with irradiation time in TPP、TPP-PEG1000、TPP-PEG2000 and TPP-PEG5000 aqueous solution

2.3 納米組裝體的粒徑

為了探究聚乙二醇鏈長(zhǎng)對(duì)1O2產(chǎn)率影響的原因，我們進(jìn)一步測(cè)量了TPP、TPP-PEG1000、TPP-PEG2000和TPP-PEG5000組裝體的粒徑。未經(jīng)聚乙二醇修飾的自由卟啉的疏水性很強(qiáng)，在水溶液中形成肉眼可見的聚集體，溶液呈渾濁狀。而經(jīng)過PEG 高分子的修飾后，卟啉的親水性大大提高，在水相環(huán)境中可自組裝成納米膠束，以疏水性卟啉為內(nèi)核、親水性聚乙二醇為外殼，宏觀上為澄清溶液（圖9）。圖10是各樣品的流體力學(xué)直徑示意圖，從圖中可以看出，卟啉小分子的流體動(dòng)力學(xué)直徑可達(dá)1 000 nm，多分散性也比較 寬（ PDI=0.523） ， 而 組 裝 體TPP-PEG1000、 TPPPEG2000和TPP-PEG5000的流體動(dòng)力學(xué)直徑隨著PEG 鏈長(zhǎng)的增加而增加，分別為5、10、22 nm，這是因?yàn)楦叻肿拥逆滈L(zhǎng)越長(zhǎng)，組裝體中親水的PEG 層越厚，納米粒子的粒徑自然越大。1O2是一種高度活性物質(zhì)，壽命很短（半衰期：0.03～0.18 ms），只能在很有限的范圍內(nèi)（<0.02 μm）才能發(fā)揮作用[2,24]。由于鏈長(zhǎng)較短的TPP-PEG 形成的組裝體粒徑較小，產(chǎn)生的1O2可以迅速擴(kuò)散，與DPBF 反應(yīng)使其以較快的速率降解；而鏈長(zhǎng)較長(zhǎng)的TPP-PEG 組裝形成的納米膠束粒徑較大，產(chǎn)生的1O2擴(kuò)散相對(duì)較慢，使得DPBF 降解也較慢，從而表現(xiàn)出1O2的產(chǎn)率與PEG 鏈長(zhǎng)成負(fù)相關(guān)的現(xiàn)象。

2.4 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

通過MTT 測(cè)定法研究不同質(zhì)量濃度的TPP、TPP-PEG1000、TPP-PEG2000和TPP-PEG5000組 裝 溶 液的HeLa 細(xì)胞活性如圖11 所示。當(dāng)細(xì)胞沒有用655 nm激光照射時(shí)，隨著卟啉質(zhì)量濃度的升高，細(xì)胞的存活率逐漸下降。當(dāng)卟啉質(zhì)量濃度最高為15.000 μg/mL時(shí)，加入TPP 溶液的細(xì)胞存活率約為80%，而加入自組裝體的溶液的細(xì)胞存活率約為90%，說明在沒有接枝PEG 高分子鏈的情況下，TPP 的生物相容性較差，細(xì)胞暗毒性較高，而在卟啉分子上修飾了不同鏈長(zhǎng)的PEG 后，TPP 的生物相容性有比較明顯的改善，并且它們之間的細(xì)胞暗毒性沒有顯著差異。

圖9 TPP、TPP-PEG1000、TPP-PEG2000、TPP-PEG5000 水溶性的對(duì)比圖Fig. 9 Photographs showing the different water-solubility of TPP、TPP-PEG1000、TPP-PEG2000 and TPP-PEG5000

圖10 TPP 、TPP-PEG1000、TPP-PEG2000 和TPP-PEG5000各組裝體的流體力學(xué)曲線Fig. 10 Hydrodynamic curves of TPP, TPP-PEG1000, TPPPEG2000 and TPP-PEG5000 assemblies

當(dāng)用655 nm 激光照射時(shí)，TPP 和TPP-PEG 都能夠產(chǎn)生1O2殺死HeLa 細(xì)胞，其細(xì)胞存活率隨著卟啉質(zhì)量濃度的升高有著明顯的下降。當(dāng)卟啉質(zhì)量濃度最高為15.000 μg/mL 時(shí)，加入TPP 溶液的細(xì)胞存活率為65%，而加入自組裝體的溶液的細(xì)胞存活率分別為20%、30%、35%，說明沒有接枝PEG 鏈的TPP 光動(dòng)力效果較差。而接枝PEG 高分子鏈之后，由于親水的PEG 提高了卟啉聚合物的親水性，減少了卟啉之間的π-π 堆積，1O2產(chǎn)率較高，光動(dòng)力效果得到很大的改善。從圖中可以直觀地看到，在相同的卟啉質(zhì)量濃度下，細(xì)胞存活率與所接枝的PEG 鏈長(zhǎng)成相反關(guān)系，這也與前面以DPBF 為探針檢測(cè)1O2的結(jié)果相符。

圖11 MTT 法檢測(cè)不同質(zhì)量濃度的TPP、TPP-PEG1000、TPP-PEG2000 和TPP-PEG5000 溶液的HeLa 細(xì)胞毒性無光照（a）；655 nm 光照10 min（b）Fig. 11 The cytotoxicity of HeLa cells measured by MTT assay with various concentrations of TPP, TPP-PEG1000、TPPPEG2000 and TPP-PEG5000 solution without laser irradiation (a) , with 655 nm laser irradiation for 10 min(b)

3 結(jié) 論

（1）本文成功設(shè)計(jì)合成了一類親水性的卟啉半遙爪聚合物TPP-PEG。由于PEG 分子極好的親水性，TPP-PEG 在水溶液中能夠穩(wěn)定存在，有效地減少了卟啉分子之間的π-π 堆積，提高了光敏劑的單線態(tài)氧產(chǎn)率，同時(shí)改善了生物相容性。

（2）聚乙二醇的鏈長(zhǎng)對(duì)TPP-PEG 的光動(dòng)力療效有較大的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，卟啉半遙爪聚合物中的親水性聚乙二醇鏈越短，組裝體的粒徑就越小，其1O2產(chǎn)率越高，MTT 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的光毒性也驗(yàn)證了這一結(jié)果。因此，這種卟啉半遙爪聚合物可以用做潛在的大分子光敏劑用于光動(dòng)力療法，并且聚合物的性質(zhì)，鏈長(zhǎng)等對(duì)其光動(dòng)力治療效果有較大的影響。