甘肅黨參急性青枯型根腐病病原鑒定與室內(nèi)毒力測定研究

孫新榮，張西梅，仲彩萍*，胡小平，高薇薇，李鵬霞，漆文選

(1.渭源縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，甘肅 渭源 748200；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；3.西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；4.渭源縣種子管理中心，甘肅 渭源 748200)

黨參(Codonopsispilosula(Franch)Nannf.)為桔?？贫嗄晟p繞或直立草本植物。甘肅定西是著名的千年藥鄉(xiāng)，是全國藥材的重要主產(chǎn)區(qū)之一。定西市渭源縣2002年被中國農(nóng)學(xué)會特產(chǎn)之鄉(xiāng)組委會正式命名為“中國黨參之鄉(xiāng)”，所產(chǎn)黨參以“條直、體胖、色白、質(zhì)好”而著稱。目前，發(fā)展黨參藥材產(chǎn)業(yè)成為定西地區(qū)重要的扶貧途徑。但隨著種植面積的不斷擴(kuò)大，病害問題已逐漸成為影響黨參產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素之一。據(jù)2013-2017年調(diào)查發(fā)現(xiàn)，黨參大田出現(xiàn)大面積的莖葉急性青枯、爛根現(xiàn)象，當(dāng)?shù)厮庌r(nóng)俗稱“紅芯病”或“黃芯病”，發(fā)病率達(dá)15%～70%；輕則影響商品價值，重則整片青枯死亡，嚴(yán)重減產(chǎn)，減產(chǎn)幅度10%～60%，是目前最嚴(yán)重的病害之一。王艷等[1]調(diào)查研究表明甘肅黨參根腐病的病原菌為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)。然而，至今關(guān)于黨參“紅芯病”或“黃芯病”新型根腐病的發(fā)病癥狀、流行時期及主要病原菌尚不明確，相關(guān)防治技術(shù)帶有盲目性。因此，筆者通過系統(tǒng)調(diào)查黨參“紅芯病”或“黃芯病”新型根腐病田間發(fā)病情況及癥狀表現(xiàn)，對病原菌進(jìn)行分離鑒定并篩選效果較好的防治藥劑，以期為脫貧攻堅黨參產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展保駕護(hù)航。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2013-2017年，每年4-9月于甘肅黨參主產(chǎn)區(qū)定西市渭源、隴西、臨洮等縣黨參“紅芯病”或“黃芯病”發(fā)生嚴(yán)重的大田，采集病害標(biāo)本，觀察并記錄病害相關(guān)的癥狀。

1.2 病原菌分離培養(yǎng)

采用常規(guī)組織分離法分離病原菌[2]，選取新發(fā)病參根病健交界處組織(3 mm×3 mm)，先用70%乙醇消毒5 s，0.1%HgCl2表面消毒30 s，無菌水沖洗3～4次，然后在無菌條件下接種于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(potato dextrose ager，PDA)平板上，于25℃恒溫箱內(nèi)暗培養(yǎng)。對獲得的菌落進(jìn)行單孢分離純化，將純化好的菌株接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，4℃保存。

1.3 病原菌致病性測定

采用灌根接種法[2]對分離物進(jìn)行致病性測定。將分離物接種于PDA平板上，25℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)4 d后，用無菌水沖洗孢子，配制成濃度為1×106個·mL-1的孢子懸浮液，備用。選取健康一年生黨參苗，種植于含無菌土的花盆中，出苗20 d后，在距蘆頭4 cm的參根部位用滅菌針刺傷表皮，立即灌根50 mL孢子懸浮液作為刺傷接種處理，同時設(shè)無傷接種處理，以接種相同體積的無菌水作為對照。每個處理接種3盆，每盆種植10株黨參。灌根后的黨參置于25 ℃人工氣候箱培養(yǎng)，定期觀察并記錄發(fā)病情況。同時，對典型發(fā)病植株進(jìn)行再分離，將分離物與初始接種體進(jìn)行形態(tài)學(xué)比較。

1.4 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

將病原菌接種到PDA培養(yǎng)基平板中央，在25 ℃的恒溫箱中暗培養(yǎng)，觀察菌落生長速度、色澤等形態(tài)特征，并挑取菌絲體制成玻片，在顯微鏡下觀察孢子的顯微特征，并測量分生孢子大小。

1.5 病原菌分子鑒定

病原菌的分子生物學(xué)鑒定委托中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所、西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院完成。

1.5.1 DNA提取以及病原菌ITS序列擴(kuò)增及測序 參照申永銘等[3]的方法。PCR產(chǎn)物送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行測序。

1.5.2 數(shù)據(jù)分析 將測序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對分析。從GenBank下載鐮刀菌屬代表種序列，將序列信息導(dǎo)入MEGA(6.0)采用Clustal W方法進(jìn)行序列比對，通過最大擬然法(Maximum Likelihood Tree)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，同時利用Bootstrap(10 000次重復(fù))檢驗各分支的置信度。

1.6 室內(nèi)毒力測定

采用生長速率法進(jìn)行室內(nèi)毒力測定。供試藥劑共7種，采用梯度稀釋法配成不同稀釋倍數(shù)(18%噻靈·咯·精甲、6.25%精甲·咯菌腈、25 g·L-1咯菌腈、70%甲基硫菌靈、50%多菌靈的稀釋倍數(shù)為100 000、150 000、200 000、250 000、300 000倍；80%乙蒜素為4 000、8 000、12 000、16 000、20 000倍；60.0052%噁霉靈·乙酸為400、800、1 200、1 600、2 000倍)的含藥PDA培養(yǎng)基，以不加藥劑為對照；將藥劑稀釋倍數(shù)換算為相應(yīng)的室內(nèi)毒力測定濃度見表1。

抑菌率(%)=(對照菌落直徑-藥劑處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100。

采用DPS軟件計算各藥劑的毒力回歸方程及相關(guān)系數(shù)(r)，并求出抑制中濃度(EC50)。

2 結(jié)果分析

2.1 田間發(fā)病情況及癥狀表現(xiàn)

通過田間大量的系統(tǒng)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)“紅芯病”或“黃芯病”癥狀表現(xiàn)為：發(fā)病初期，植株地上莖和葉片下垂、出現(xiàn)急性萎蔫，但葉色仍為綠色、不脫落(圖1-B)；參根外觀正常，剖開主根，部分或整個維管束變?yōu)辄S色至紅色，形成縱向的變色條帶(圖1-C)。隨著病情進(jìn)一步發(fā)展，地上莖和葉片青枯，須根萎縮，主根出現(xiàn)軟腐，不久全株死亡，造成明顯缺苗斷壟(圖1-A)。該病發(fā)病較早，4月中下旬出現(xiàn)病株，5-6月份苗期為發(fā)病高峰期，發(fā)病率15%～70%。從地上顯癥到全株死亡所需時間較短，一般約6 d。根據(jù)田間發(fā)病癥狀，將該病害命名為黨參急性青枯型根腐病。

2.2 病原分離結(jié)果

采集的70份病樣中，68份(97.1%)病樣分離到真菌。共獲得68株真菌，根據(jù)培養(yǎng)性狀初步歸為DXDS001、DXDS002、DXDS003、DXDS004四類，DXDS002分離頻率最高(82.9%，58株)，其他3類均低于10株。

2.3 致病性測定

從每類分離物中選取1個代表菌株，用于致病性測定。結(jié)果顯示，只有接種DXDS002的植株表現(xiàn)出典型的急性青枯型根腐病癥狀。刺傷和無傷接種DXDS002后第2 d均顯急性青枯型根腐病癥狀，刺傷接種后第2 d全部發(fā)病，無傷接種后第4 d全部發(fā)病。再分離物與DXDS002形態(tài)學(xué)特征一致，符合柯赫氏法則，說明DXDS002為黨參急性青枯型根腐病病原菌。

2.4 病原菌形態(tài)特征

在PDA培養(yǎng)基平板上暗培養(yǎng)5 d后，DXDS002菌落圓形白色，菌落底部中心部位培養(yǎng)物牽牛紫色，菌絲絮狀致密(圖2)；產(chǎn)生大量的小型分生孢子和少量的大型分生孢子，其中小型分生孢子為卵圓形或腎形，無隔膜或具1個隔膜，大小為(3.9～15.0) m×(1.5～4.5) m；大型分生孢子鐮刀狀，兩端尖，一般具有3～5個隔膜，大小為(18.5～35.6) m×(3.0～5.5) m。根據(jù)病原菌的形態(tài)特征，依據(jù)Booth的鐮刀菌屬分類系統(tǒng)[4]，病原菌DXDS002初步鑒定為尖孢鐮刀菌F.oxysporum。

2.5 病原菌分子鑒定

病原菌DXDS002的ITS序列與GenBank的序列進(jìn)行BLAST比對后，利用MEGA6.0轉(zhuǎn)換為meg格式并采用Clustal W方法進(jìn)行序列比對，建立最大似然樹(Maximum Likelihood Tree，ML樹)，發(fā)現(xiàn)菌株DXDS002的ITS序列與F.oxysporumCBS 140424(KT794176.1)、F.oxysporumCBS 129.24(DQ45370.14)的相似性均為100%(圖3)，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征進(jìn)一步將DXDS002鑒定為尖孢鐮刀菌F.oxysporum。

表1 藥劑對尖孢鐮刀菌的抑制效果

2.6 藥劑防治結(jié)果

從表1看出，25 g·L-1咯菌腈、6.25%精甲·咯菌腈、18%噻靈·咯·精甲的EC50分別為0.1355、0.2720、0.5929 mg·L-1；70%甲基硫菌靈、50%多菌靈的EC50分別為2.2783、2.2301 mg·L-1；80%乙蒜素的EC50為37.3332 mg·L-1；60.0052%噁霉靈·乙酸的EC50最高，為4 746.0990 mg·L-1。

3 結(jié)論與討論

王艷等[1]研究表明，引起甘肅地區(qū)黨參根腐病的病原菌為F.oxysporum。研究表明，引起黨參“紅芯病”或“黃芯病”的病原菌也為F.oxysporum，這和以往研究結(jié)論一致，但同一病原菌引起的主要發(fā)病癥狀不同。

本研究發(fā)現(xiàn)黨參“紅芯病”或“黃芯病”發(fā)病初期，植株地上莖和葉片下垂、出現(xiàn)急性萎蔫，但葉色仍為綠色、不脫落，參根外觀正常，剖開主根，部分或整個維管束變?yōu)辄S色至紅色，形成縱向的變色條帶。隨著病情進(jìn)一步發(fā)展，地上莖和葉片青枯，須根萎縮，主根出現(xiàn)軟腐，不久全株死亡，造成明顯缺苗斷壟；且“紅芯病”或“黃芯病”發(fā)病較早，一般4月中下旬出現(xiàn)病株，5-6月苗期為發(fā)病高峰期，與以往報道根腐病的發(fā)病與流行時間有所不同[1]，可能是由于根腐病的發(fā)生受土壤、氣候條件影響較大[2]。近年來，“紅芯病”或“黃芯病”發(fā)病率在15%～70%，已經(jīng)成為甘肅黨參產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生的最嚴(yán)重病害。因此，本研究根據(jù)主要發(fā)病癥狀將“紅芯病”或“黃芯病”定名為急性青枯型根腐病。

化學(xué)農(nóng)藥以其簡便的使用方法和良好的短期效應(yīng)優(yōu)勢一直是我國中藥材病害防治中最常用的方法。目前，對于黨參根腐病的防治，報道較多的農(nóng)藥有多菌靈、乙酸銅，一般整地時拌土，或栽培時用甲基硫菌靈、多菌靈浸種[1,4]。本研究選用7種農(nóng)藥，包括生產(chǎn)上常用農(nóng)藥甲基硫菌靈和多菌靈，復(fù)配農(nóng)藥噁霉靈·乙酸，種子處理劑咯菌腈、精甲·咯菌腈和噻靈·咯·精甲，植物源仿生殺菌劑乙蒜素，室內(nèi)毒力測定表明，3種種子處理劑效果最好，好于生產(chǎn)上以往使用的甲基硫菌靈、多菌靈，可作為多菌靈、甲基硫菌靈的替代農(nóng)藥。