銀杏葉中總黃酮的超聲輔助提取工藝研究

豆佳媛，孟潔，逯莉，彭修娟，劉峰

（陜西國際商貿(mào)學(xué)院中藥綠色制造技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西西安712046）

銀杏（Ginkgobiloba L.）屬于銀杏科、銀杏屬的一種落葉喬木，是我國特有的珍稀樹種。銀杏葉的葉型古雅，無病蟲害，是一種無公害的樹種[1]，富含黃酮類、萜類等多種化學(xué)成分[2]，具有抑菌殺菌、抗氧化性、抗衰老等藥理作用[3,4]。銀杏葉中總黃酮的提取方法主要有溶劑提取法、超臨界流體萃取法、超聲波浸提法、微波浸提法、酶提取法等[5-9]。超聲波提取法是指利用一定頻率的超聲波，將其作用于溶液時(shí)，所發(fā)生的共振現(xiàn)象和空化作用，讓被萃取的物質(zhì)細(xì)胞壁破裂，從而將里面的待提取成分溶出。由于超聲過程中提取液溫度較為溫和，從而不會因?yàn)闇囟冗^高導(dǎo)致有效成分結(jié)構(gòu)或性質(zhì)被破壞，且超聲提取技術(shù)還具有能耗低、提取效率高等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛應(yīng)用[10]。近年來，利用超聲技術(shù)提取銀杏葉中的總黃酮具有較大的優(yōu)勢，可以很大程度地節(jié)省時(shí)間，強(qiáng)化浸提。有研究數(shù)據(jù)表明，超聲波提取法應(yīng)用于銀杏葉總黃酮的提取具有高效和節(jié)能的作用[11]。本研究采用超聲輔助，對銀杏葉總黃酮進(jìn)行提取研究，用分光光度計(jì)測定總黃酮含量，設(shè)計(jì)單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化最佳提取工藝。

1 實(shí)驗(yàn)儀器和實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

DHG-9140A智能型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上?，?實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；DEPU-200UE型多用途恒溫超聲波提取機(jī)（無錫德譜儀器制造有限公司）；ES20K-1電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；HH-420電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；GY-753型粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限責(zé)任公司）；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；TDZ4高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；SHZ-D（III）循環(huán)水式多用真空泵（河南省于華儀器有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥材和試劑

銀杏葉（秦嶺，干燥粉碎成粉末）；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所）；無水乙醇（分析純，天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠）；亞硝酸鈉（分析純，山東佰仟化工有限公司）；硝酸鋁（分析純，北京鵬彩精細(xì)化工有限公司）；氫氧化鈉（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取蘆丁標(biāo)品100 mg，用95%乙醇定容到50 mL容量瓶中，得到濃度為2.0 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。用移液管分別移取上述溶液0 mL、0.25 mL、0.5 mL、0.75 mL、1.00 mL、1.25 mL和1.5 mL至10 mL具塞比色管，分別加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻后靜置6分鐘，再加10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻后靜置5分鐘，最后加4%氫氧化鈉溶液4 mL，用95%乙醇定容至刻度線，靜置15分鐘，在λ=510 nm處測定溶液吸光度A值。采用最小二乘法作線性回歸，擬合得到回歸方程：A=2.0407ρ-0.033（R2=0.9997）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在濃度為0.05～0.3 mg·mL-1的范圍內(nèi)，線性關(guān)系較好。

2.2 銀杏葉總黃酮的提取及測定

將干燥的銀杏葉粉碎過篩，精確稱取50 g，置于超聲波裝置中，加入一定量的95%乙醇溶液，浸取一定時(shí)間，濾取浸提液后適當(dāng)濃縮，并用濃度為95%乙醇溶液溶解，將其稀釋定容至50 mL容量瓶，充分搖勻后，作為待測溶液。用移液管精確吸取待測溶液1 mL置于10 mL具塞比色管中，按照2.1所述方法，測定其吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式，代入吸光度值計(jì)算出樣品溶液中所含黃酮的質(zhì)量濃度。按照以下公式求出銀杏葉中總黃酮的提取率：

式中：

ρ——提取液中所含總黃酮的質(zhì)量濃度（mg/mL）；

V——提取液的體積（mL）；

m1——銀杏葉的質(zhì)量（mg）。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)對總黃酮提取率的影響

為全面考察不同料液比、提取時(shí)間、超聲功率對銀杏葉中總黃酮提取效果的影響，分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定最佳提取條件。

2.3.1 料液比對提取率的影響

分別稱取50 g銀杏葉干燥粉末5份，設(shè)定超聲功率300 W，提取時(shí)間2 h，通過改變料液比為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7，研究其對提取率的影響。

2.3.2 提取時(shí)間對提取率的影響

分別稱取50 g銀杏葉干燥粉末5份，設(shè)定超聲功率300 W，在最佳料液比條件下，通過改變提取時(shí)間為1 h、2 h、3 h、4 h、5 h，研究其對提取率的影響。

2.3.3 超聲功率對提取率的影響

分別稱取50 g銀杏葉干燥粉末5份，在最佳料液比和提取時(shí)間條件下，通過改變超聲功率為100 W、200 W、300 W、400 W、500 W，研究其對提取率的影響。

2.4 正交實(shí)驗(yàn)

為使總黃酮的提取方案更加科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，分別以料液比、提取時(shí)間、超聲功率為考察因素，以總黃酮提取率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9(33)正交試驗(yàn)，優(yōu)化最佳提取工藝。

2.5 分析方法

分析方法的基本思路為：實(shí)驗(yàn)過程中會產(chǎn)生變異，從而引起數(shù)據(jù)的不準(zhǔn)確性。把這種變異分為因素和誤差引起的，因此需要構(gòu)建F統(tǒng)計(jì)量，做F檢驗(yàn)，根據(jù)數(shù)據(jù)的大小從而判斷出因素作用是否明顯。實(shí)驗(yàn)中的基本計(jì)算過程如表1所示：

表1 計(jì)算公式

根據(jù)F值大小，若F0＞Fa，則認(rèn)為該因素對實(shí)驗(yàn)有顯著影響；若F0＜Fa，則認(rèn)為該因素對實(shí)驗(yàn)無顯著影響。

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 不同料液比對提取率的影響

由圖2可知，料液比較小時(shí)，總黃酮提取量較低，隨著料液比增大，總黃酮提取量增加，當(dāng)料液比達(dá)到1∶6時(shí)，總黃酮的含量最高，為4.84%。因此，最佳料液比為1∶6。

3.1.2 不同提取時(shí)間對提取率的影響

由圖3可知，隨著提取時(shí)間的延長，總黃酮的提取含量也隨之增加，當(dāng)提取時(shí)間為3 h時(shí)，所提取出的總黃酮的提取量最高，為3.91%，因此，確定最佳提取時(shí)間為3 h。

3.1.3 不同超聲功率對提取率的影響

由圖4可知，隨著超聲功率的增加，總黃酮的提取量先增大后減小，當(dāng)超聲功率為300 W時(shí)，總黃酮的提取量最高，為4.75%。因此，確定最佳超聲功率為300 W。

3.2 優(yōu)化最佳提取條件

依據(jù)三因素三水平設(shè)計(jì)L9(33)正交試驗(yàn)，如表2所示。測定提取液中總黃酮含量，結(jié)果如表3所示。直觀分析可知，三個(gè)因素的最優(yōu)水平組合為A2B2C3，即料液比為1∶5、提取時(shí)間為2 h、超聲功率為400 W。根據(jù)表中的極差R數(shù)值的大小，可以判斷出各因素對本次實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響大小。由表3中的數(shù)據(jù)得知，RA(0.35)＞RC(0.3)＞RB(0.15)，即料液比＞ 超聲功率＞提取時(shí)間，因此，料液比對銀杏葉中總黃酮的提取影響最大。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.3 方差分析

由表4可得出，F(xiàn)A是20，F(xiàn)B是3，F(xiàn)C是13，則可得出結(jié)論：因素A影響顯著，因素B和因素C的影響均不顯著，即料液比＞超聲功率＞提取時(shí)間，與極差分析結(jié)論一致。

表4 方差分析表

3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

按照確定的最佳提取工藝（A2B2C3），即料液比1∶5，提取時(shí)間為2 h，超聲功率為400 W，進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，總黃酮的提取率分別為4.93%、5.17%和5.26%，均略高于其它各正交試驗(yàn)值，確定該提取工藝穩(wěn)定性好、可行性高。

4 結(jié)論與展望

采用超聲波輔助提取銀杏葉中的總黃酮，取得了較好的效果，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定了總黃酮提取的最佳提取工藝條件，即料液比為1∶5、提取時(shí)間為2 h、超聲功率400 W。在此條件下進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，銀杏葉中總黃酮的提取率平均可達(dá)5.12%，與傳統(tǒng)溶劑法相比，該提取工藝提取時(shí)間短、效率高、易操作、穩(wěn)定性好，為銀杏葉的開發(fā)利用和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了重要的理論依據(jù)。