海洋真菌Arthrinium sp.次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究①

李基興，李云秋

(桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西 桂林 541004)

海洋廣闊而獨(dú)特的水體環(huán)境，賦予了代謝成分特殊的微生物資源和結(jié)構(gòu)多樣的海洋天然產(chǎn)物[1]。海洋微生物種類繁多，代謝方式獨(dú)特，具有代謝產(chǎn)物化學(xué)多樣性等特點(diǎn)，海洋真菌作為海洋微生物的重要組成部分，是新穎活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的重要來源之一[2]。據(jù)報(bào)道，活性次級(jí)代謝產(chǎn)物已成為藥物先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)的主要源泉，也為重大疾病的治療和人類的發(fā)展進(jìn)步做出了極其重要的貢獻(xiàn)[3]。

本課題組一直致力于海洋來源真菌活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究[4-5]，筆者對(duì)海洋來源的一株節(jié)菱孢菌屬的菌株進(jìn)行其次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究，從其大米發(fā)酵產(chǎn)物中分離并鑒定了3個(gè)化合物，即：①2,3-dihydroxypropyl 9Z,12Z-octadecadienoate;②dibutyl phthalate;③1H-indole-3-carbaldehyde?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

海洋來源的供試菌株保存于4 ℃環(huán)境中，將其接種到MB瓊脂固體平面培養(yǎng)基上，置于28 ℃培養(yǎng)箱中活化7 d。然后接種到MB種子培養(yǎng)液(麥芽提取物1.5%，海鹽1.5%，水10 ml)中于28 ℃ 、180 rpm條件下?lián)u床活化3 d，最后再接種至大米培養(yǎng)基(大米200 g，海鹽1.5%，水220 ml)中，室溫下靜置發(fā)酵60 d，共發(fā)酵40瓶。

1.2 菌株鑒定

通過提取菌株的總 DNA，并對(duì) DNA 中的Intertek Testing Services(ITS)序列進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增及18S rRNA對(duì)比(18S rRNA基因序列由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)定)，將測(cè)出來的18S rRNA 基因序列進(jìn)行BLAST 分析(http:// blast. ncbi. nlm. nih. gov/)。鑒定為Arthriniumrasikravindrae(KU 940143)，菌種保存于中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.3 主要儀器與試劑

主要儀器：AV-700 超導(dǎo)核磁共振儀(德國(guó) Bruker 公司)，中壓制備色譜儀(Buchi 公司)，Hitachi Primade 高效液相色譜儀(日本日立公司)，ZYJ-S型超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本東京理化株式會(huì)社，EYELAN-1100V-W型)；主要試劑：葡聚糖凝膠 sephadexLH-20(Pharmacia 公司)，薄層色譜及柱色譜用硅膠(青島海洋化工廠)，分析純化學(xué)試劑(廣州化學(xué)試劑廠和天津富宇精細(xì)化工有限公司)。

1.4 提取與分離

菌株發(fā)酵結(jié)束后將大米培養(yǎng)基搗碎，加入與搗碎物等體積的丙酮，超聲15 min。然后用8層紗布減壓過濾，濾液經(jīng)減壓蒸餾至無有機(jī)溶劑，再用乙酸乙酯萃取3遍，減壓蒸干乙酸乙酯相得粗浸膏；殘?jiān)靡宜嵋阴ヌ崛?遍至乙酸乙酯浸提液顏色接近無色，再經(jīng)濃縮得粗浸膏，合并二者得總浸膏共125 g。粗浸膏用100～200目的硅膠拌樣，經(jīng)中壓柱色譜(200～300目硅膠)分離(二氯甲烷/甲醇：100∶0～1∶1)，梯度洗脫，再經(jīng)TLC檢識(shí)合并得8個(gè)流份。Fr.1經(jīng)ODS中壓反相柱色譜( MeOH/H2O：5%∶95%～100%∶0)分離得3個(gè)子流份，其中 Fr. 1-3再用半制備液相(CH3CN/H2O：18%∶82%)，得到化合物3(11 mg)；Fr.3經(jīng)ODS中壓反相柱色譜(MeOH/H2O：5%∶95%～100%∶0)分離得8個(gè)子流份，F(xiàn)r.3-8再用半制備液相(CH3CN / H2O：64%∶36%)得到化合物1(22 mg)；Fr. 5 經(jīng)ODS中壓反相柱色譜(MeOH/H2O:5%∶95%～100%∶0)分離得8個(gè)子流份，其中Fr.5-8用半制備液相(MeOH/H2O：54%∶46%)得到化合物2(21 mg)。化合物結(jié)構(gòu)如圖1。

圖1 化合物1～3的化學(xué)結(jié)構(gòu)

2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1透明油狀物：1HNMR(CD3OD, 700 MHz)δ：5.38(4H, m, H-9’, 10’, 12’, 13’), 4.17(1H, dd , J = 11.2, 4.2 Hz, H-1b), 4.09(1H, dd , J=11.9, 6.3 Hz, H-1a), 3.84 (1H, m, H-2), 3.57, (2H, t , J=4.9 Hz, H-3), 2.80 (1H, t , J=7.0 Hz, H-11’), 2.37 (2H, t , J = 7.0 Hz, H-2’), 2.09 (2H, m , J=7.0 Hz, H-8’), 1.64(3H, m, H-3’), 1.36 (6H, d , H-4’, 7’, 15’), 1.35(8H, m , H-5’, 6’, 16’,17’), 0.93(3H, t , J=7.7, 6.3 Hz, H-18’)；13CNMR(CD3OD, 175 MHz)δ: 175.48 (s, C-1’), 130.9 (d, C-9’), 130.8 (d, C-10’), 129.1 (d, C-12’), 129.0 (d, C-13’), 71.1 (d, C-2), 66.5 (t, C-1), 64.1 (t, C-3), 34.9 (t, C-2’), 32.7 (t, C-7’), 30.7 (t, C-15’), 30.5 (t, C-6’), 30.3 (t, C-5’), 30.2(t, C-4’), 30.1 (t, C-3’), 28.2 (t, C-8’), 26.5 (t, C-11’), 25.9 (t, C-16’), 23.6 (t, C-17’), 14.4 (q, C-18’)?；衔?1 的核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]對(duì)照基本一致，故鑒定該化合物為2,3-dihydroxypropyl 9Z,12Z-octadecadienoate。

化合物2透明油狀物：1HNMR(CD3OD，700 MHz)δ: 7.72(2H, dd, J = 5.6, 3.5 Hz, H- 3, 6), 7.61(2H, dd, J=6.3, 3.5 Hz, H-4, 5), 4.29(4H, t, J=7.0 Hz, H-2’, 2’’), 1.72(4H, m, H-3’, 3’’), 1.46(4H, m, H-4’, 4’’ ), 1.31(2H, m), 0.97(6H, t, J=7.7Hz, H-5’, 5’’)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]對(duì)照基本一致，故鑒定該化合物2為dibutyl phthalate。

化合物3透明油狀物：1HNMR(CD3OD，700 MHz)δ: 9.89(1H, s, H-8), 8.16(1H, d, J=7.7 Hz, H-4), 8.10(4H, s, H-2), 7.49(1H, d, J=8.4 Hz, H-7), 7.28(1H, td, J=7.0, 0.7 Hz, H-6), 7.24(1H, td, J=7.0, 0.7 Hz, H-5)；13CNMR ( CD3OD，175 MHz)δ: 187.4 (s, C-8), 139.7 (d, C-2), 138.9 (s, C-7a), 125.7 (s, C- 3a), 124.9 (d, C-6), 123.6(d, C-5), 122.4 (d, C- 4), 120.1 (s, C-3), 113.1 (d, C-7)?；衔?的核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8-9]對(duì)照基本一致，故鑒定該化合物為1H-indole-3-carbaldehyde。

3 討論

筆者對(duì)海洋來源真菌Arthriniumrasikravindrae的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分離和鑒定，從中共獲得3個(gè)化合物。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，化合物1是一種磷脂酶抑制劑，通過細(xì)胞膜釋放花生四烯酸而縮短了促炎物質(zhì)(前列腺素、白三烯、血栓烷)的生物合成時(shí)間，具有抗病毒、抗菌活性和抗炎活性[10]。隨著海洋開采技術(shù)的發(fā)展，越來越多的海洋微生物資源將被開發(fā)和利用，本研究豐富了海洋來源真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的多樣性，也為后續(xù)活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的探索和藥物先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)及研究提供了參考。