高效毛細管電泳法測定桑黃菌絲體提取物中腺苷含量的研究

馬曉穎，肖軍，楊濤，呂立濤，宋艷雨

（遼寧省農業(yè)科學院食用菌研究所，遼寧省食用菌優(yōu)質栽培重點實驗室，遼寧沈陽110161）

桑黃是一種具有開發(fā)價值的珍貴藥用真菌，除了具有傳統(tǒng)中醫(yī)理論上的藥理作用外，還具有抗癌、抗腫瘤、免疫調節(jié)、保肝和抗肝硬化等功效。受生理生態(tài)的特殊性和復雜性以及外部環(huán)境條件的制約，自然界中形成的子實體非常稀少，特別是形成可用子實體需要多年，人工栽培難度較大，這給開發(fā)研究桑黃的生物活性帶來一定的困難。腺苷作為一種遍布人體細胞的內源性核苷，可直接進入心肌經磷酸化生成腺苷酸，參與心肌能量代謝，同時還參與擴張冠脈血管，增加血流量，可用于治療室上性心動過速，同時腺苷也用于合成三磷酸腺苷（ATP）、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中間體。

目前對桑黃的成分分析主要是桑黃多糖、三帖類和黃酮類化合物，對于核苷類化合物研究很少。利用桑黃液體培養(yǎng)的菌絲體作為研究對象可縮短桑黃活性物質的研究周期，該文以桑黃菌絲提取物為測定目標，利用高效毛細管-二極管陣列檢測來測定其中的腺苷含量，建立高效快速的腺苷含量測定方法，簡單可靠，重復性好，不僅可用于桑黃菌絲體中腺苷含量的測定，對其他樣品中的腺苷的定性、定量檢測都有一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑。P/ACE MDQ 毛細管電泳儀（美國貝克曼公司）；精密pH 計（北京泰亞賽?？萍及l(fā)展有限責任公司）；電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HZQ-QX 全溫振蕩器（哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司）；干熱消毒箱（上海精宏實驗設備有限公司）；A11 高速粉碎機（德國IKA 集團）；Cascada 實驗室超純水系統(tǒng)（Pall corporation）微孔濾膜（孔徑0.22 μm，津隆設備有限公司）。

桑黃菌種來源于遼寧省農業(yè)科學院食用菌研究所；腺苷標準品（北京奧博星生物技術有限責任公司）；Na2B4O7、H3BO3、Na2HPO4、NaH2PO4（美國amresco 生物試劑公司）；試驗過程用的試劑均為分析純和色譜純；試驗用水為超純水。

1.1.2 試驗溶液的配制。（1）緩沖液配制，稱取19.07 g 硼砂于1000 mL 容量瓶中，用超純水配成50 mmol/L 的緩沖液，再稱取3.09 g 硼酸于1000 mL 容量瓶中，用硼酸將硼砂溶液pH 調成9.18；（2）對照品的配制，將腺苷配成1 mg/mL 的母液，用50%乙醇溶解。上述溶液均用0.22 μm孔徑的有機濾膜濾過，超聲除氣，置冰箱4℃保存；（3）標準品的配制，將腺苷1 mg/mL 的母液，用緩沖液配成濃度為0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg/mL 的標準液，避光低溫保存。

1.1.3 樣品準備。將實驗室保藏的桑黃菌活化接種于馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基中，25℃，180 r/min 搖床培養(yǎng)7 d。將發(fā)酵液過濾后，用無菌水沖洗菌絲體3 次，60℃烘干，粉碎，過100 目篩子，裝在避光瓶中備用。

1.2 方法

1.2.1 檢測電泳條件。電泳操作條件如下：未涂層石英毛細管（50 μm×57 cm，有效檢測長度48 cm），運行緩沖液50 mmol/L，硼砂緩沖液（pH 9.18），檢測波長218 nm，分離電壓20 kV，溫度25℃，壓力0.5 psi 進樣10 s，運行時間為20 min。

1.2.2 樣品提取。稱取烘干的桑黃菌絲體干粉1 g 放到50 mL 離心管中，加入30 mL 配制好的20%乙醇溶液，超聲提取30 min，用抽濾瓶抽濾后，將上清液收集，剩余物再加入30 mL 溶劑在95℃水浴鍋加熱2 h，過濾后取上清液，合并兩次提取液。將處理好的產物用0.22 μm 孔徑的水系濾膜濾過，收集續(xù)濾液加同體積的運行緩沖液作為樣品溶液。

1.2.3 特異性考察。高效毛細管電泳對桑黃菌絲提取物中腺苷的測定采用內標法，將腺苷配成10 μg/mL 加入到處理好的桑黃菌絲提取物中，將腺苷、桑黃菌絲提取物、以及桑黃菌絲提取物加腺苷分別進樣。每一種樣品進樣5 次，觀察腺苷峰附近有沒有干擾峰，以此判斷方法的特異性。

1.2.4 標準曲線建立。將腺苷配成1 mg/mL 的母液，根據毛細管電泳中的定量計算方法，將腺苷標準品用緩沖液配成濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mg/mL，分別進行進樣測定。記錄峰面積積分值，以對照品濃度為橫坐標，以對照品峰面積為縱坐標，建立線性回歸方程。

1.2.5 靈敏度測定。將適量的腺苷標準品加到桑黃菌絲提取液中，無限稀釋，再分別按照1.2.3 的電泳條件進樣，然后找到信噪比（S/N）為3 的來確定檢測限（LOD）。

1.2.6 回收率測定。在桑黃菌絲體中測得的腺苷濃度基礎上添加低、中、高濃度的標準品，按1.2.3 節(jié)的色譜條件進樣測定，將腺苷的峰面積帶入到標準方程中，得出的濃度再除以理論濃度，得到回收率。

1.2.7 方法的精密度和穩(wěn)定性測定。取對照品溶液用緩沖液配置成0.05 mg/mL 按照1.2.3 節(jié)的色譜條件連續(xù)進樣測定5 次，記錄遷移時間和峰面積，計算腺苷遷移時間相對標準差（RSD）和峰面積的相對標準差（RSD）。將測定的提取好的樣品，分別在室溫下放置0、2、4、6、8 h 后按照1.2.3 節(jié)的色譜條件分別進樣，每次3 個重復，考察腺苷在8 h 內的穩(wěn)定性。

2 結果與分析

2.1 方法特異性檢測結果

從圖1 可以看出，腺苷的對照品9.800 min 左右時有特征峰出現，峰性穩(wěn)定良好，而在桑黃菌絲體中也有相同時間的特征峰，所以表明在桑黃菌絲提取物中含有腺苷，且該方法可以用于定性和定量。

2.2 標準曲線的建立

在1.2.1 中毛細管電泳儀最佳條件下，腺苷標準品峰面積與濃度在0.05～1.00 mg/mL 范圍內呈現良好的線性關系（圖2）。由圖3 可知，回歸方程為y=1E+07x+210943，相關系數r 為0.9992，將目的峰的峰面積帶入方程，得到腺苷的含量為20.2 μg/mL。

2.3 靈敏度測定結果

該試驗利用標準品添加到樣品中的方式來考察靈敏度。信噪比（S/N）為3 的來確定檢測限（LOD），測得腺苷在桑黃菌體提取物中的LOD 為0.12 μg/mL。

2.4 加樣回收試驗結果

量取3 份樣品，分別加入不同量的標準溶液進行測定，實測添加量與標準添加量之比為回收率，從表1 可以看出，測得腺苷回收率在88.9%～95.7%。

表1 樣品中添加腺苷回收率試驗結果

2.5 進樣精密度和穩(wěn)定性考察

取對照品溶液配置成0.05 mg/mL 連續(xù)進樣測定5次，記錄遷移時間和峰面積，計算腺苷遷移時間RSD 為0.33%，峰面積的RSD 為0.9%。將測定的提取好的樣品，在室溫下放置0、2、4、6、8 h 后分別進樣，記錄腺苷位置的遷移時間RSD 為0.22%，峰面積RSD 為1.82%，表明樣品在8 h 內具有良好的穩(wěn)定性。

3 討論

3.1 樣品提取方法確定

該試驗中采用菌粉按照1∶30 加水，選取單獨超聲、單獨高溫水浴、先超聲后水浴這3 種方法進行樣品的提取，結果表明，單獨超聲和單獨水浴的提取方法使得毛細管電泳的指紋圖譜不完整，可能是由于提取不徹底導致，所以選擇先超聲后水浴的方法為最后的提取方法。

3.2 樣品出峰時間討論

毛細管電泳中樣品的分離對于緩沖液的pH 有很大的影響，樣品和對照品的比對應該在同一天電泳中完成。在后期的跑樣中，緩沖液的酸堿性發(fā)生變化會導致總體樣品分離的遷移時間向后延遲，該文中在樣品后期連續(xù)5 次進樣中的腺苷出峰時間與原來的出峰時間有所差異，但并不影響測量結果。