煙色離褶傘生長(zhǎng)特性分析

李宏亮，呂立濤，張敏，王紅，張士義，劉娜，宋瑩

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，遼寧省食用菌優(yōu)質(zhì)栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽(yáng)110161）

煙色離褶傘（Lyophyllum fumosumy） 屬于傘菌目（Agricales）白蘑科（Tricholomataceae）離褶傘屬（Lyophyllum）真菌，又稱檳榔菇、賓王菇[1-2]。其鮮食肉肥質(zhì)嫩、食味鮮美，干品香氣更加濃郁，是深受人們喜愛(ài)的一種珍貴野生菌，市場(chǎng)前景廣闊[3-4]。目前煙色離褶傘已有小規(guī)模人工馴化栽培報(bào)道，但由于其抗雜菌能力較差、出菇條件要求高、栽培周期很長(zhǎng)（約140～160 d）、產(chǎn)量不穩(wěn)定等問(wèn)題，嚴(yán)重影響了煙色離褶傘的產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)應(yīng)用[5]?；谝陨蠁?wèn)題，以實(shí)現(xiàn)煙色離褶傘規(guī)?；耘酁槟繕?biāo)開(kāi)展了系列研究。對(duì)遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所采集到的野生菌株進(jìn)行篩選，探索不同碳源、氮源、外源添加物、碳氮比、溫度對(duì)母種菌絲體生長(zhǎng)及子實(shí)體在培養(yǎng)皿內(nèi)分化的影響，并以新鮮金針菇菌糠和秸稈為主要栽培基質(zhì)，以人工培養(yǎng)的煙色離褶傘菌絲為母鐘，開(kāi)展出菇條件研究，為煙色離褶傘菌種人工培養(yǎng)及規(guī)模化栽培奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株。8 個(gè)煙色離褶傘子實(shí)體分別編號(hào)為BW-1、BW-2、BW-3、BW-4、BW-5、BW-6、BW-7、BW-8，采自遼寧省彰武縣四合城鄉(xiāng)不同地塊。將野生菌株子實(shí)體組織分離后，采用PDA 培養(yǎng)基進(jìn)行活化，然后轉(zhuǎn)入膠塞試管，置于4℃條件下保藏待用[6]。

1.1.2 培養(yǎng)基?；A(chǔ)培養(yǎng)基：土豆200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，水1000 mL；原種培養(yǎng)基：草炭78%，麥麩20 %，石膏1%，石灰1%，含水量58%[7]；栽培培養(yǎng)基：①草炭23%，木屑8%，玉米秸稈20%，玉米芯25%，麥麩20%，豆面2%，石膏1%，石灰1%，含水量60%[8]；②新鮮金針菇菌糠38%，秸稈38%，豆面2%，麥麩20%，石膏1%，石灰1%，含水量60%。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化。采用PDA 培養(yǎng)基平皿對(duì)煙色離褶傘進(jìn)行活化。

1.2.2 菌種篩選。將8 個(gè)野生煙色離褶傘菌種接到裝有等量基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中央，每一菌株做5 個(gè)重復(fù)，封好封口膜，轉(zhuǎn)移到恒溫培養(yǎng)箱中25℃培養(yǎng)。計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速度、觀察菌絲長(zhǎng)勢(shì)和培養(yǎng)皿內(nèi)子實(shí)體分化情況等[9-10]。

1.2.3 溫度試驗(yàn)。用直徑0.6 cm 的打孔器取大小一致的菌塊，接種到PDA 培養(yǎng)皿正中，每3 個(gè)培養(yǎng)皿一組，分別置于20、22.5、25、27.5、30℃條件下培養(yǎng)，觀察菌絲長(zhǎng)勢(shì)并計(jì)算菌絲平均生長(zhǎng)速度[11]。

1.2.4 碳氮源試驗(yàn)。在每升基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入20 g木糖（T1）、果糖（T2）、海藻糖（T3）、山梨醇（T4）、葡萄糖（T5）、麥芽糖（T6）、紅糖（T7）、可溶性淀粉（T8）、蔗糖（T9）、蜜糖（T10），配成10 種包含不同碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；在每升基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入2 g 酸水解酪蛋白（D1）、蛋白胨（D2）、尿素（D3）、酵母浸粉（D4）、氯化銨（D5）、牛肉膏（D6）、豆面（D7）、玉米面（D8），配成8 種包含不同氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基[12-14]。用內(nèi)徑5 mm 打孔器在供試平皿菌落的同一半徑處打孔取菌塊，將菌塊接種到上述各種供試平皿培養(yǎng)基上，在25℃條件下恒溫培養(yǎng)，觀察菌絲生長(zhǎng)狀況，每個(gè)處理做3 次重復(fù)。

1.2.5 碳氮源比例試驗(yàn)。以最佳碳源為標(biāo)準(zhǔn)，添加不同重量的最佳氮源，使培養(yǎng)基中碳源和氮源的質(zhì)量比分別為10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，設(shè)3 次重復(fù)[15]（接種及觀察方法同1.2.4）。

1.2.6 外源添加物試驗(yàn)。利用篩選出的最佳碳、氮源替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中碳、氮源，在每升培養(yǎng)基中分別加入0.5%草炭土、草炭加麥麩（3∶1）、玉米秸稈、玉米秸稈加麥麩（3∶1）、玉米芯、玉米芯加麥麩（3∶1）浸汁、麥麩、復(fù)合維生素B，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基作對(duì)照[16]，設(shè)3 次重復(fù)，接種及觀察方法同1.3.4。

1.2.7 栽培研究。對(duì)篩選出來(lái)的2 個(gè)菌株進(jìn)行栽培研究。栽培培養(yǎng)料配方的含水量均為58%，pH 自然，裝200 瓶，每瓶裝干料200～220 g。121℃條件滅菌2 h，降溫至30℃以下，用生長(zhǎng)速度快、長(zhǎng)勢(shì)健壯且培養(yǎng)皿中分化原基較多的原種接菌，接菌后置25℃黑暗條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)室空氣相對(duì)濕度60%～70%。20～25 d 后菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基，此時(shí)進(jìn)入后熟期，將培養(yǎng)溫度降至21～23℃，10 d 后進(jìn)行騷菌、覆土處理，溫度16～18℃，散射光，濕度90%～95%[17-19]。隨機(jī)采集20 個(gè)子實(shí)體測(cè)量其性狀（菌蓋直徑、菌柄長(zhǎng)度、顏色等），取其平均值。并計(jì)算每瓶子實(shí)體的鮮重，求出生物學(xué)效率。

1.2.8 測(cè)定方法。（1）菌絲平均生長(zhǎng)速度測(cè)定：煙色離褶傘菌種接種于平皿培養(yǎng)基中間，培養(yǎng)7 d 后，測(cè)量菌落直徑，以菌落平均半徑除以天數(shù)即為菌絲的日平均生長(zhǎng)速度。（2）生長(zhǎng)勢(shì)測(cè)定：菌絲生長(zhǎng)濃密，長(zhǎng)勢(shì)較好，用“+++”表示；菌絲生長(zhǎng)密，長(zhǎng)勢(shì)一般，用“++”表示；菌絲生長(zhǎng)稀，長(zhǎng)勢(shì)較弱，用“+”表示。（3）生物學(xué)效率：生物學(xué)效率=（子實(shí)體鮮重/培養(yǎng)料干重）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

從表1 可以看出，8 個(gè)野生煙色離褶傘菌株菌絲生長(zhǎng)速度、長(zhǎng)勢(shì)及子實(shí)體分化情況有差異[20]。菌株BW-1、BW-2和BW-8 的菌絲生長(zhǎng)速度顯著高于BW-5、BW-6 和BW-7，而與菌株BW-3 和BW-4 沒(méi)有顯著差異。菌株BW-1、BW-2和BW-8 的菌絲長(zhǎng)勢(shì)明顯強(qiáng)于其他5 個(gè)野生菌株，其中，BW-1 和BW-2 的平皿子實(shí)體分化較多，且分布均勻，而B(niǎo)W-3 和BW-7 平皿子實(shí)體只在接種點(diǎn)周圍有少量分化，BW-4、BW-5、BW-6 和BW-8 在平皿內(nèi)未見(jiàn)子實(shí)體分化。綜合性狀比較，野生菌株BW-1 和BW-2 的菌絲生長(zhǎng)較為理想，可作為下一步試驗(yàn)菌株。

表1 不同野生菌株菌絲生長(zhǎng)及子實(shí)體分化情況

2.2 溫度對(duì)煙色離褶傘菌絲生長(zhǎng)的影響

從圖1 可以看出，煙色離褶傘菌絲體在20～30℃條件下均能生長(zhǎng)，隨溫度升高2 個(gè)野生菌株菌絲生長(zhǎng)速度表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。在25℃條件下，2 個(gè)野生菌株的菌絲生長(zhǎng)速度最快，之后生長(zhǎng)速度隨溫度上升而減慢。在20℃和27.5℃時(shí)菌絲邊緣整齊，22.5℃和25℃時(shí)菌絲邊緣相對(duì)稀疏。

2.3 碳、氮源對(duì)煙色離褶傘菌絲生長(zhǎng)的影響

從圖2、3、4 可以看出，煙色離褶傘菌絲在供試的10種碳源和8 種氮源上都可以生長(zhǎng)，但菌絲生長(zhǎng)速度存在顯著差異。以木糖和紅糖為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)量顯著小于分別以果糖、海藻糖、山梨醇、葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉、蔗糖和蜜糖等8 種碳源上的生長(zhǎng)量；2 個(gè)菌株在果糖和麥芽糖上菌絲生長(zhǎng)速度相對(duì)較其他幾種碳源快，且2 種碳源均能較好地促進(jìn)2 株煙色離褶傘菌絲的生長(zhǎng)；海藻糖、葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖和蜜糖5 種碳源之間生長(zhǎng)量差異不顯著；在原基分化方面，原基分化較多且均勻的為麥芽糖和海藻糖。形態(tài)試驗(yàn)結(jié)果表明，以海藻糖、山梨醇、葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉、蔗糖為碳源的培養(yǎng)基上菌絲呈螺旋狀；在果糖、蜜糖培養(yǎng)基上菌絲濃密、潔白。在參試的8 種氮源中，煙色離褶傘菌絲以尿素為氮源時(shí)，菌絲不萌發(fā)；在玉米面為氮源的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度最快，長(zhǎng)勢(shì)旺盛；酸水解酪蛋白、蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏和豆面之間差異不顯著；在原基分化方面，原基分化較多的為玉米面和豆面，其次為酵母浸粉和蛋白胨。

2.4 碳氮比對(duì)煙色離褶傘菌絲生長(zhǎng)的影響

從圖5 和圖6 可以看出，煙色離褶傘能夠在碳氮比為10∶1～50∶1 的范圍內(nèi)生長(zhǎng)，BW-1 菌株在20∶1 時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度最快，BW-2 菌株在碳氮比為30∶1～50∶1 時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度差異不明顯，但明顯快于碳氮比為10∶1～20∶1；在原基分化方面，2 個(gè)菌株在碳氮比為50∶1 時(shí)培養(yǎng)皿內(nèi)均不分化原基，在碳氮比為10∶1～40∶1 時(shí)原基分化速度與數(shù)量大小為（10∶1）＞（20∶1）＞（30∶1）＞（40∶1）。

2.5 外源添加物對(duì)煙色離褶傘菌絲生長(zhǎng)的影響

從圖7 和圖8 可以看出，煙色離褶傘菌絲對(duì)供試的8種外源添加物提取液均能利用。從菌絲生長(zhǎng)速度來(lái)看，添加維生素B 的菌絲生長(zhǎng)速度較其他幾種提取液快；菌絲長(zhǎng)勢(shì)最好，菌絲濃密、潔白，生長(zhǎng)健壯的是麥麩提取液培養(yǎng)基；菌絲邊緣整齊度最好的為復(fù)合維生素B、秸稈和秸稈加麥麩提取液的培養(yǎng)基。綜合來(lái)看，復(fù)合維生素B 是煙色離褶傘菌絲利用較好的外源營(yíng)養(yǎng)。

2.6 栽培研究

從表2 和圖9 可以看出，2 個(gè)菌株在2 種培養(yǎng)料上均能出菇。2 個(gè)菌株生育期相差4～5 d，BW-2 的生育期短于BW-1；在生物學(xué)效率方面：配方②的生物學(xué)效率略低于配方①，生育期短于配方①，但配方②生產(chǎn)成本低于配方①；2 個(gè)菌株農(nóng)藝性狀略有不同，在配方①中，BW-2菌株菌蓋小于BW-1，菌柄長(zhǎng)于BW-1，菌柄直徑比BW-1大[21]。

表2 不同配方對(duì)煙色離褶傘農(nóng)藝性狀的影響

3 結(jié)論與討論

通過(guò)菌絲生長(zhǎng)速度、長(zhǎng)勢(shì)及培養(yǎng)皿內(nèi)子實(shí)體分化情況篩選出煙色離褶傘菌株2 個(gè)，煙色離褶傘菌絲生長(zhǎng)最佳溫度為25℃，菌絲生長(zhǎng)最佳碳氮源為麥芽糖和玉米面，適宜碳氮比為10∶1～20∶1，最佳外源添加物為復(fù)合維生素B，篩選出的2 個(gè)煙色離褶傘菌株在試驗(yàn)涉及的2 個(gè)配方中均能出菇，2 個(gè)菌株中，BW-2 因生育期相對(duì)較短，菌蓋略小，但菌柄較長(zhǎng)，可以作為工廠化品種進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，煙色離褶傘在原基形成過(guò)程中對(duì)溫差不敏感，原基形成數(shù)量大，影響菇質(zhì)，出菇期水分是保證子實(shí)體能否長(zhǎng)大的關(guān)鍵因素，因此，如何進(jìn)行定點(diǎn)出菇、控制原基數(shù)量，基質(zhì)成分對(duì)子實(shí)體營(yíng)養(yǎng)成分影響仍需進(jìn)一步進(jìn)行研究。