厭氧條件下香草酸降解菌的分離與鑒定

趙晴雨 陸依琳 袁茜 劉曹彤 彭學

摘要：以香草酸作為唯一碳源，在厭氧條件下從江蘇徐州奎河河底淤泥中分離和篩選出具有降解香草酸能力的菌株C1和C2，根據(jù)其菌落特征及生理生化分析，得出菌株C1的最適溫度為40 ℃，最適pH值為7;菌株C2的最適溫度為25 ℃，最適pH值為5，初步確定2種菌株降解香草酸的機制。通過16S rDNA序列分析得出，菌株C1與產氣克雪伯菌（Klebsiella aerogenes）的相似度為99.7%;菌株C2與重氮營養(yǎng)菌（Phytobacter diazotrophicus）的相似度為 99.5%。菌株C1、C2的成功分離為利用厭氧微生物治理環(huán)境污染問題的研究提供了一個新方向。

關鍵詞：木質素;香草酸;厭氧菌;革蘭氏染色;PCR擴增;系統(tǒng)進化樹

中圖分類號：X703.5;S182 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）10-0269-04

收稿日期：2019-04-18

基金項目：江蘇師范大學科研創(chuàng)新計劃校立項目（編號：2018YXJ341）。

作者簡介：趙晴雨（1994—），女，江蘇徐州人，碩士研究生，主要從事環(huán)境微生物學研究。E-mail：779491190@qq.com。

通信作者：彭 學，博士，教授，主要從事環(huán)境微生物學研究。E-mail：pengxueinchina@aliyun.com。

自然界中廣泛存在許多芳香族化合物，苯環(huán)是其中分布最廣的化學單元，具有苯環(huán)結構的化合物有很大的毒性，同時有可能致畸和致突變[1]。木質素是其中含量最豐富的芳香族化合物，其與纖維素和半纖維素構成植物骨架的主要成分。木質素十分穩(wěn)定，不易降解，是由苯丙烷單元結構與醚鍵和碳碳鍵組成的無定型芳香族化合物，它的分解與碳循環(huán)相關[2]。同時，木質素是造紙工業(yè)廢棄物以及城市生活垃圾中的一種難降解物質，采用化學試劑進行廢棄物降解時，會造成嚴重的環(huán)境污染。木質素是木質的主要成分之一，自然界中木質素的降解都依賴真菌與細菌的共同作用，高分子木質素被真菌的胞外酶分解成低分子芳香族化合物，然后土壤細菌將其完全降解為二氧化碳[3]，但其降解速度極慢，再加上人類活動因素，導致木質素的堆積量遠遠超過自然界的自我降解量[4-8]。

木質素結構復雜，其代謝途徑和有關的酶和基因還未研究清楚，目前研究較為明確的主要是鞘氨醇單胞菌SYK-6對木質素的代謝途徑[9]。通過前人研究香草酸代謝途徑發(fā)現(xiàn)，紅球菌RHA1可降解β-芳基醚木質素模型物，3-（3′-甲氧基-4′-羥苯基）-3-酮基-丙醇和草酸為主要產物，副產物為香草酸。同時能降解聯(lián)苯木質素模型物生成中間代謝產物5-羧基香草酸，經脫羧形成香草酸。該菌中vdh基因和van A基因分別編碼香草醛脫氫酶和香草酸去甲基化酶。研究發(fā)現(xiàn)，在敲除vdh基因后紅球菌RHA1不能在以香草醛為單一碳源培養(yǎng)基上生長但能在以香草酸為單一碳源培養(yǎng)基上生長[10]。

研究清楚木質素的代謝網(wǎng)絡，對于構建木質素降解菌的酶系統(tǒng)十分重要，不僅有利于進一步了解碳素循環(huán)，還有助于將木質素轉化為有工業(yè)價值的中間代謝產物。研究木質素的生物降解途徑是解決這類環(huán)境問題的關鍵。香草酸是自然界中普遍存在的芳香族化合物，是很多人工化合物的重要中間代謝產物，也是較為常見的環(huán)境污染物之一。目前，香草酸的厭氧降解少見報道。對厭氧環(huán)境中香草酸降解菌進行研究，不僅能夠更好地了解芳香族化合物的碳素循環(huán)，還有利于水環(huán)境污染的治理。關于香草酸的微生物降解途徑已有一些研究報道，但關于厭氧微生物的研究較少，本試驗以香草酸為唯一碳源，從江蘇省徐州市奎河河底淤泥中分離篩選出能夠分解香草酸的厭氧微生物，再通過16S rDNA序列測定和系統(tǒng)發(fā)育樹構建鑒定菌種，測定其生理生化性質，從而進一步了解厭氧菌對香草酸的降解機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 徐州奎河河泥。

1.1.2 試驗試劑 NH4Cl、Na2SO4、MgSO4·7H2O、K2HPO4·3H2O、Fe（NH4）2（SO4）2·6H2O、CaCl2、結晶紫、草酸銨、番紅染液、甘油、無水乙醇、95%乙醇、LB肉湯粉。細菌基因組DNA抽提試劑盒、DNA maker、DNA loading buffer。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株分離 菌株分離以0.2%香草酸為唯一碳源，在厭氧工作站（95% N2和5% H2）中先富集培養(yǎng)，然后平板涂布，采用三區(qū)劃線法獲得單一菌株，得到菌株后采用甘油保藏法于-80 ℃長久儲存。該試驗所有菌株的培養(yǎng)均在厭氧工作站中完成。

1.2.2 菌種鑒定

1.2.2.1 革蘭氏染色 采用經典革蘭氏染色法進行鑒別性染色，于顯微鏡下觀察顏色反應，紫色為陽性菌，紅色為陰性菌。

1.2.2.2 16S rDNA測定 提取菌株全基因組DNA，以全基因組DNA為模板進行16S rDNA PCR反應，冰浴條件下加以下成分于250 μL離心管中。反應體系如下：27.8 μL ddH2O、5 μL 10×PCR Buffer、5 μL dNTP Mix、4 μL 0.2 mmol/L MgCl2、3 μL 10 mmol/L 引物 1（27F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCT-3′）、3 μL 10 mmol/L 引物 2（1 492R，5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）、2 μL模板DNA、0.2 μL Taq DNA聚合酶。混勻后，將離心管放入PCR儀，95 ℃預變性 5 min;95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸 90 s，30個循環(huán);72 ℃保溫10 min。取PCR擴增產物，與DNA loading buffer以體積比為 1 ∶ 1 混勻，以5 μL DNA Maker為對照進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測PCR能否成功擴增出目的條帶。將純化后的16S rDNA送到生工生物工程（上海）股份有限公司測序，通用引物為27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCT-3′）和1 492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。

1.2.3 最適溫度 挑取單菌落于含3 mL LB培養(yǎng)基的試管中，培養(yǎng)至D600 nm值為1.0左右，分別取100 μL菌液于含100 mL LB培養(yǎng)基的三角瓶中，使D600 nm值在0.05～0.10之間。每3個三角瓶為1組平行，同時放置于溫度為20、25、30、35、40、45、50 ℃的搖床（200 r/min）內培養(yǎng)，8 h后測D600 nm值并繪制最適溫度生長的曲線。

1.2.4 最適pH值 挑取單菌落于含50 mL液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)至D600 nm值為1.0左右。加100 μL菌液于含3 mL不同pH值液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的試管中，使D600 nm值在0.05～0.10之間。每3支試管作為1組平行，同時放置于2個菌種最適溫度的搖床（200 r/min）上培養(yǎng)24 h，測D600 nm值。pH值梯度為4、5、6、7、8、9、10。

1.2.5 生理生化反應 挑取單菌落于含3 mL液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的試管中，培養(yǎng)至D600 nm值為1.0左右，將菌液移至1.5 mL離心管內，6 000 r/min離心 2 min，棄上清。用相同體積的無菌水重懸菌體，繼續(xù)6 000 r/min離心2 min，棄上清。加1 mL無菌水于沉淀中制成菌懸液。取微量生化反應管用砂條割開，滴加3～4滴菌懸液，置2個菌種最適溫度下孵育24 h，觀察生化管內培養(yǎng)液顏色變化。

2 結果與分析

2.1 菌株形態(tài)特征

以0.2%香草酸作為唯一碳源、河底淤泥為樣品在厭氧工作站中篩選香草酸降解菌，共篩選獲得2種菌株，分別命名為菌株C1、C2。其中菌株C1單菌落形態(tài)具有較小、圓形、乳白色、不透明、邊緣整齊等特征，該菌株革蘭氏染色后，在油鏡下觀察呈紅色短小棒狀（圖1），可以確定該菌株屬于革蘭氏陰性菌。而菌株C2單菌落呈現(xiàn)較小、淡黃色、不透明、邊緣整齊等特征，革蘭氏染色后為短桿狀的革蘭氏陽性菌（圖2）。

2.2 菌株16S rDNA電泳結果

分別以菌株C1、C2的全基因組DNA為模板，27F、1 492R為引物進行16S rDNA的PCR擴增，獲得片段大小為1 500 bp左右，條帶明亮單一（圖3）。

2.3 測序結果及系統(tǒng)進化樹的構建

菌株C1、C2的16S rDNA PCR產物經測序后獲得相應序列，將測序結果提交到模式菌株數(shù)據(jù)庫（http：//www.ezbiocloud.net/eztaxon/identify），檢索與所測序列相近的已知菌株，并利用MEGA 7軟件繪制系統(tǒng)進化樹。由圖4可知，菌株C1與產氣克雷伯菌（Klebsiella aerogenes）的相似度最高，為997%，產氣克雷伯菌（K. aerogenes）是一種兼性厭氧菌[11]，常見于腸道內容物或土壤等中，目前還沒有相關降解木質素的報道。菌株C2與重氮營養(yǎng)菌（Phytobacter diazotrophicu）P. diazotrophicus最相似，相似度為99.5%，目前關于菌株的研究不是很多。

2.4 最適溫度

從圖5可以看出，菌株C1在20～50 ℃均有生長，且 40 ℃ 下培養(yǎng)的生長情況優(yōu)于 20、25、30、35、45、50 ℃，而在50 ℃下幾乎不生長。因此，菌株C1的最適溫度為40 ℃左右。菌株C2在20～30 ℃有較好生長，25 ℃左右D600 nm值最高，40～50 ℃生長較緩慢，因此，菌株C2的最適溫度為25 ℃左右。

2.5 最適pH值

從圖6可以看出，菌株C1可以在pH值4～10的條件下生長，且在pH值為5～9條件下生長繁殖情況較好，強酸強堿條件下不能生長，菌株C1的最適pH值為7左右。而菌株C2在pH值4～10生長情況無明顯變化，酸性條件下生長更旺盛，推斷其最適pH值為5左右。

2.6 生理生化特征

利用微量生化反應管對降解菌C1、C2的部分生理生化特性進行分析，接菌孵育24 h，根據(jù)生化管內培養(yǎng)液顏色變化可知降解菌C1的生長情況。由表1可知，菌株C1能利用大部分糖類物質，如果糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、棉子糖、山梨糖、D-核糖、甘露糖等，此外還能夠利用一些氨基酸和有機酸，如精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、丙二酸鹽、尿素等。菌株C2只能利用部分糖類物質如果糖、蔗糖、麥芽糖、D-核糖、甘露糖等，以及部分有機酸如丙二酸鹽、七葉苷、β-半乳糖苷，但不能利用如精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸。

3 討論與結論

通過對奎河河底淤泥中微生物的厭氧分離篩選，獲得菌株C1、C2 等2種香草酸降解效率較高的菌株，通過對2種菌株的研究比較發(fā)現(xiàn)，菌株C1可降解的底物較C2更豐富，并且菌株C1適應環(huán)境的能力更強，其菌株活性在較大的溫度范圍及pH值范圍內都較高，因此菌株C1更利于深入研究。

微生物降解環(huán)境有害物質一直都備受研究者關注，目前關于木質素的降解途徑并不是非常完善，研究微生物對香草酸的代謝途徑有助于進一步了解微生物對木質素的降解。通過本研究可以初步了解部分厭氧微生物對香草酸的降解能力，為研究厭氧微生物對香草酸的降解奠定一部分理論基礎。同時，深入研究菌株C1可能會為降解香草酸和木質素提供幫助，將其開發(fā)為環(huán)境有益降解菌，有助于緩解環(huán)境中木質素和香草酸的大量累積導致的污染。但是本研究還只是初步的探究試驗，并未獲得相關降解基因和降解酶的信息，后續(xù)工作還很多，很值得期待。

參考文獻：

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