利用非靶向代謝組學(xué)方法研究龍膽瀉肝湯治療急性肝損傷的機(jī)制

張艷 王爽 李永哲 宋爽

摘要：以龍膽草、黃芩、山梔子、生地黃、澤瀉、車前子、當(dāng)歸、木通、柴胡和甘草組成的龍膽瀉肝湯為試材，采用氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)，并結(jié)合代謝組學(xué)的方法研究龍膽瀉肝湯對大鼠急性肝損傷（ALI）的治療作用及機(jī)制。結(jié)果表明，龍膽瀉肝湯有明顯的治療ALI的作用，其機(jī)制與影響丙酮酸、肌氨酸、延胡索酸、琥珀酸、L-別蘇氨酸、4-羥基脯氨酸、檸檬酸和吲哚乳酸8個具有特征性的內(nèi)源性生物標(biāo)志物有關(guān)，這些標(biāo)志物屬于三羧酸循環(huán)，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，乙醛酸和二羧酸代謝，丙酮酸代謝和糖酵解或糖異生5個代謝途徑。龍膽瀉肝湯能改善ALI大鼠的癥狀，調(diào)節(jié)ALI大鼠代謝通路異常，具有明顯的保肝作用。

關(guān)鍵詞：龍膽瀉肝湯;急性肝損傷;標(biāo)志物;代謝組學(xué);氣相色譜-質(zhì)譜

中圖分類號： R285.5 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）10-0208-06

收稿日期：2019-04-17

基金項目：吉林省教育廳科學(xué)技術(shù)項目（編號：JJKH20190825KJ）;吉林市科技創(chuàng)新發(fā)展計劃（編號：201831779）。

作者簡介：張 艷（1981—），吉林吉林人，博士，副教授，主要從事藥理學(xué)和代謝組學(xué)研究。E-mail：zhangyan@jlict.edu.cn。

龍膽瀉肝湯是我國的傳統(tǒng)中藥復(fù)方方劑，由龍膽草、黃芩、山梔子、生地黃、澤瀉、車前子、當(dāng)歸、木通、柴胡、甘草組成，最早由汪昂在《醫(yī)方集解》中提出，主要用于治療肝膽實火上炎癥[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，龍膽瀉肝湯具有調(diào)節(jié)免疫[2-3]、抗炎[4]、抗氧化[5]、抗病毒[6]、鎮(zhèn)痛[7]，調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)功能[8]等作用。此外，黃芩、山梔子等中草藥形態(tài)優(yōu)美，花朵秀麗，將中草藥種植用于園林綠化工程中，既節(jié)省了苗木投入，又可以從藥材種植中獲得一定的經(jīng)濟(jì)收益，具有較高的園林開發(fā)價值。

我國傳統(tǒng)的中藥方劑是以多味中藥協(xié)同的形式組成的復(fù)方制劑，倡導(dǎo)聯(lián)合用藥以及整體性。根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論，中藥方劑以每味中藥的有效成分協(xié)調(diào)發(fā)揮藥理作用的形式治療疾病，“整體大于部分之和”是方劑作用的基本特征[9]。代謝組學(xué)是20世紀(jì)末發(fā)展起來的一門新興技術(shù)，它借助于現(xiàn)代的分析手段，通過考察生物體系受疾病擾動后其代謝產(chǎn)物的變化，系統(tǒng)地揭示疾病的發(fā)展過程和分子機(jī)制[10]。其整體性的特點與中醫(yī)理論不謀而合，因此代謝組學(xué)可以為中藥方劑復(fù)雜的作用機(jī)制研究提供新方法，對于提高其臨床療效和安全性，促進(jìn)中醫(yī)藥的進(jìn)一步發(fā)展具有重要意義[11]。

急性肝損傷（ALI）是一種源于病毒性肝炎、藥物誘導(dǎo)、乙醇、毒物和肝臟局部缺血而導(dǎo)致的以肝細(xì)胞大量壞死為主要特征的急性肝功能障礙[12]。ALI是多種嚴(yán)重肝?。ㄈ绺斡不⒏伟┑龋┑恼T因，嚴(yán)重或持續(xù)的損傷最終可導(dǎo)致肝衰竭[13]。據(jù)估計在世界范圍內(nèi)，每100萬ALI患者中有8位患者會最終導(dǎo)致肝衰竭，其發(fā)病率和死亡率逐年升高，給家庭和社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)[14]。本研究借助高通量、高靈敏度、高分辨率的氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用分析手段，利用代謝組學(xué)方法，研究篩選龍膽瀉肝湯對ALI的治療作用并探尋其代謝組學(xué)機(jī)制，為開發(fā)龍膽瀉肝湯的新用途提供相關(guān)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 SPF級SD大鼠，體質(zhì)量為 200～240 g，雄性，購自吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動物試驗中心，試驗許可證號：SCXK（吉）2016-0002。

1.1.2 藥物與試劑 龍膽草、黃芩、山梔子、生地黃、澤瀉、車前子、當(dāng)歸、木通、柴胡、甘草，購自北京同仁堂藥店;以6 ∶ 9 ∶ 9 ∶ 12 ∶ 9 ∶ 9 ∶ 8 ∶ 20 ∶ 16 ∶ 6比例配伍（共784 g），5倍水量煎煮3次，每次2 h，合并濾液，濃縮至480 mL（即相當(dāng)于3 mg/mL生藥量的藥液）備用。N，O-雙三甲硅基三氟乙酰胺（BSTFA）和三甲基氯硅烷（TMCS），購自上海麥克林公司;乙腈，色譜純，購自美國Fisher公司;吡啶、二十二烷、正庚烷、四氯化碳（CCl4）均為分析純，購自北京化學(xué)試劑廠;谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒、堿性磷酸酶（ALP）試劑盒，購自深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司。

1.1.3 主要儀器 Chemray 24型全自動生化分析儀，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司;GCMS-QP2010型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配備EI離子源，AOC-20i自動進(jìn)樣器），日本島津公司;HP-5色譜柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm），美國Agilent公司;H2050R型低溫高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司;DY89-Ⅱ型電動玻璃勻漿機(jī)，寧波新芝科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物分組、造模及給藥 30只SD大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為3組：空白對照組，模型對照組、龍膽瀉肝湯組?？瞻讓φ战M、模型對照組給予水，龍膽瀉肝湯組給予10 mL/kg的龍膽瀉肝湯藥液（即相當(dāng)于30 mg/kg生藥量），連續(xù)灌胃給藥 7 d，末次給藥后6 h，除空白對照組給予花生油 2 mL/kg 腹腔注射外，模型對照組、龍膽瀉肝湯組按2 mL/kg腹腔注射50% CCl4花生油（V/V）1次，建立ALI模型。造模后24 h，腹主動脈取血，分離血清，取肝臟部分進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，部分-80 ℃保存。

1.2.2 血清肝功能指標(biāo)的測定 以全自動生化分析儀測定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）水平。

1.2.3 肝組織樣品前處理 取適量（約1.0 g）肝臟加2倍重生理鹽水，以電動玻璃勻漿機(jī)研磨制成勻漿，放置于4 mL離心管中于4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，移取上清液100 μL于1.5 mL離心管中，加入250 μL乙腈，混懸3 min，冰浴超聲10 min，于 4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，吸取上清液200 μL于1.5 mL離心管中冷凍干燥。冷凍干燥后，加入 50 μL 衍生化試劑[V（BSTFA） ∶ V（TMCS）=99 ∶ 1]和50 μL吡啶，于80 ℃水浴反應(yīng)0.5 h，1 h后加含0.10 g/L二十二烷的正庚烷150 μL，混勻后4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，移取上清液到 1.5 mL 離心管，用于GC-MS分析。

1.2.4 GC-MS條件 參考文獻(xiàn)方法[15-16]設(shè)置GC-MS條件如下：進(jìn)樣口溫度：280 ℃;分流比為10 ∶ 1;載氣：He;流速：1.88 mL/min;柱溫程序：起始溫度60 ℃，保持3 min后，以4 ℃/min的速度升溫，升溫到290 ℃，290 ℃保持10 min。進(jìn)樣量：0.2 μL。離子源和接口溫度分別為200 ℃和 300 ℃;電子能量：0.85 eV;溶劑延遲：5.5 min;全掃描模式，掃描范圍35～600 m/z。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

GC-MS工作站自動獲取總離子流（TIC）圖和離子片段譜。采用XCMS Online對得到的TIC圖進(jìn)行峰提取、峰對齊、峰匹配和峰強(qiáng)度校正等操作，采用SIMCA-P 13.0進(jìn)行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法-判別分析（O-PLS-DA）。篩選出 VIP>1且P<0.05的數(shù)據(jù)，利用NIST數(shù)據(jù)庫、METLIN數(shù)據(jù)庫、HMDB數(shù)據(jù)庫進(jìn)行標(biāo)志物鑒定。利用MetaboAnalyst進(jìn)行熱圖分析和代謝通路分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 龍膽瀉肝湯對ALI大鼠血清ALT、AST和ALP的影響

從表1可以看出，與空白對照組比較，模型對照組血清ALT、AST和ALP水平極顯著升高（P<001）;與模型對照組比較，龍膽瀉肝湯能顯著降低ALI血清中的ALT、AST和ALP水平（P<0.05），表明經(jīng)龍膽瀉肝湯治療后ALI損傷有所減輕。

2.2 龍膽瀉肝湯對ALI大鼠肝臟組織病理學(xué)的影響

從圖1可以看出，空白對照組大鼠肝臟組織未見任何異常;模型對照組肝臟組織肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂不清，肝細(xì)胞明顯變性及氣球樣變性，小區(qū)出現(xiàn)多量炎細(xì)胞浸潤，匯管區(qū)大量炎細(xì)胞浸潤及明顯纖維結(jié)締組織增生;經(jīng)龍膽瀉肝湯治療后肝細(xì)胞壞死情況有明顯改善，部分區(qū)域存在肝細(xì)胞稍有輕微水腫，但大部分肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，偶見氣球樣變。

2.3 龍膽瀉肝湯治療ALI大鼠的代謝組學(xué)機(jī)制

2.3.1 代謝輪廓分析 通過XCMS Online軟件構(gòu)建完整的TIC（圖2）。采用SIMCA-P 13.0對肝勻漿代謝物進(jìn)行PCA分析，由PCA（圖3）可以看出，空白對照組，模型對照組、龍膽瀉肝湯組能夠分開并且呈明顯的聚類特征?？瞻讓φ战M樣本主要聚集在PCA圖的下方，模型對照組樣本主要聚集在PCA圖的上方，給予龍膽瀉肝湯治療后，樣本點的分布逐漸向下方移動，與模型對照組分離且有向空白對照組趨近的趨勢。

2.3.2 標(biāo)志物的鑒定 分別對空白對照組、模型對照組龍膽瀉肝湯組和模型對照組進(jìn)行O-PLS-DA分析，得出O-PLS-DA、S-plot（圖4）。S-plot圖遠(yuǎn)離原點，VIP>1.0且P<0.05的代謝物被認(rèn)為是潛在的生物標(biāo)志物。經(jīng)過篩選鑒定最終確定了8種化合物為生物標(biāo)志物（表2），分別為丙酮酸、肌氨酸、延胡索酸、琥珀酸、L-別蘇氨酸、4-羥基脯氨酸、檸檬酸和吲哚乳酸。其中與空白對照組比較，模型對照組中丙酮酸、延胡索酸、琥珀酸、L-別蘇氨酸和檸檬酸含量下降（P<0.05），肌氨酸、4-羥基脯氨酸和吲哚乳酸含量升高（P<0.05），而龍膽瀉肝湯組中丙酮酸、延胡索酸、琥珀酸、L-別蘇氨酸和檸檬酸含量較模型組有顯著升高（P<0.05），肌氨酸、4-羥基脯氨酸和吲哚乳酸含量降低（P<0.05）。

2.3.3 熱圖分析 利用MetaboAnalyst生成可視化熱圖以概述空白對照組、模型對照組和龍膽瀉肝湯組生物標(biāo)志物的強(qiáng)度情況。從圖5可以看出，每列表示空白對照組、模型對照組和龍膽瀉肝湯組，增加的表達(dá)式值從綠色到紅色編碼。從熱圖中可以看出龍膽瀉肝湯組中生物標(biāo)志物有向空白對照組轉(zhuǎn)移的趨勢。

2.3.4 代謝通路分析 通過數(shù)據(jù)庫的匹配和相關(guān)文獻(xiàn)的查閱，利用MetaboAnalyst對鑒定的8種生物標(biāo)志物進(jìn)行相代謝通路分析（表3）。選取影響因子（pathway impact）>0.05的代謝通路為主要的影響通路，即三羧酸（TCA）循環(huán)，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，乙醛酸和二羧酸代謝，丙酮酸代謝和糖酵解或糖異生5個代謝途徑是與ALI的最相關(guān)代謝途徑（圖6）。

3 結(jié)論與討論

CCl4在體內(nèi)經(jīng)肝臟的細(xì)胞色素P450酶系統(tǒng)可生物轉(zhuǎn)化成大量的活性氧自由基，進(jìn)而引起細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化[17]。ALT和AST是存在于肝細(xì)胞內(nèi)的2種轉(zhuǎn)氨酶，一旦肝細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化，肝細(xì)胞膜損傷，ALT和AST就會釋放入血[18]。因此，血液中ALT和AST水平異常升高是ALI的特征標(biāo)志[19]。此外，ALP也是與ALI密不可分的判斷指標(biāo)[20]。經(jīng)龍膽瀉肝湯治療后，ALI大鼠ALT、AST和ALP水平明顯降低，表明龍膽瀉肝湯有明顯的治療ALI的作用。

CCl4引起的ALI可以導(dǎo)致肝臟線粒體的氧化損傷[21]。據(jù)相關(guān)研究，線粒體是肝臟能量代謝的主要場所，氧化損傷狀態(tài)下，線粒體能量代謝受阻[22]。丙酮酸、延胡索酸、琥珀酸和檸檬酸均參與丙酮酸代謝、TCA循環(huán)和糖酵解途徑。與空白對照組比較，模型對照組丙酮酸、延胡索酸、琥珀酸和檸檬酸水平均降低，表明ALI狀態(tài)下，丙酮酸代謝、TCA循環(huán)和糖酵解途徑介導(dǎo)的能量代謝受阻。與模型對照組比較，龍膽瀉肝湯組丙酮酸、延胡索酸、琥珀酸和檸檬酸水平上升，表明龍膽瀉肝湯通過調(diào)節(jié)丙酮酸代謝、TCA循環(huán)和糖酵解途徑可以改善ALI能量代謝異常。

乙醛酸和二羧酸代謝與體內(nèi)的氧化反應(yīng)有關(guān)，擾動此代謝可間接導(dǎo)致TCA循環(huán)異常[23]。檸檬酸是乙醛酸和二羧酸代謝與TCA循環(huán)的共同產(chǎn)物，模型對照組檸檬酸水平降低，表明經(jīng)CCl4刺激后，模型對照組大鼠出現(xiàn)了乙醛酸和二羧酸代謝的異常。龍膽瀉肝湯可通過升高檸檬酸水平，調(diào)節(jié)此代謝通路而發(fā)揮保肝作用。

甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝與氧化損傷引起的炎癥密切關(guān)系[24]。炎癥導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷加劇，進(jìn)而引起機(jī)體對甘氨酸、色氨酸代謝的水平異常[25]。肌氨酸和L-別蘇氨酸屬于甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，與空白對照組比較，模型對照組甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝異常升高，表明在ALI狀態(tài)下，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝異常。經(jīng)龍膽瀉肝湯治療后，肌氨酸和L-別蘇氨酸降低，表明龍膽瀉肝湯還可以通過調(diào)節(jié)抗甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝水平改善機(jī)體的氧化損傷，發(fā)揮保肝作用。

綜上所述，龍膽瀉肝湯有明顯的治療ALI作用，其機(jī)制與影響TCA循環(huán)，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，乙醛酸和二羧酸代謝，丙酮酸代謝和糖酵解或糖異生等通路有關(guān)。

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