溶劑萃取分離-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定對(duì)蝦中12種抗生素的殘留量

李飛鵬，黃 炯，王明珠，陳 玲?，陶 紅

(1.上海理工大學(xué) 環(huán)境與建筑學(xué)院，上海 200093；2.同濟(jì)大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200092)

隨著人們對(duì)水產(chǎn)品消費(fèi)需求的增加，對(duì)蝦等水產(chǎn)品的養(yǎng)殖面積和養(yǎng)殖密度不斷增加。然而，在大規(guī)模集約化養(yǎng)殖中，細(xì)菌性蝦病頻繁發(fā)生，抗生素作為防治細(xì)菌性疾病的藥物被廣泛應(yīng)用。殘留在水產(chǎn)品中的抗生素，經(jīng)過食物鏈的富集作用，會(huì)嚴(yán)重威脅人體的健康[1]?；前奉?、喹諾酮類、四環(huán)素類等多種抗生素在不同水產(chǎn)品中不斷被檢出，部分水產(chǎn)品中抗生素的檢出量遠(yuǎn)超過我國規(guī)定的最大殘留限量[2-5]?？股仡愃幬镞M(jìn)入水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)，經(jīng)過吸收、代謝和排泄過程后，其殘留量一般在μg·L－1水平，但是由于水產(chǎn)品中含有蛋白質(zhì)、脂類、色素和水分等物質(zhì)，基質(zhì)十分復(fù)雜，其中任何一種基質(zhì)成分的含量都可能是藥物殘留組分的數(shù)百倍以上，不僅會(huì)干擾目標(biāo)物的檢測準(zhǔn)確度，還會(huì)污染儀器設(shè)備，降低儀器靈敏度和使用壽命[6]。因此，選擇有效的前處理方法和高靈敏度的檢測方法，是分析此類樣品的關(guān)鍵性步驟。

加速溶劑萃取法[7]、加壓液相萃取[8]、酶聯(lián)免疫法[9]等常見的預(yù)處理方法多用于提取水產(chǎn)品中的一類或兩類抗生素，水產(chǎn)品中多種類型抗生素同時(shí)檢測的報(bào)道尚不多見[10-12]。超聲溶劑萃取法被認(rèn)為是有效、直接的一種提取方法，具有提取效果好、省時(shí)、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)[13-15]，因此本工作選用超聲溶劑萃取法提取目標(biāo)物，并對(duì)其條件進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)，然后采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定南美白對(duì)蝦樣品中的5 種磺胺類抗生素及增效劑[磺胺嘧啶(SDZ)、磺胺甲惡唑(SMD)、磺胺二甲基嘧啶(SMZ)、磺胺對(duì)甲氧嘧啶(SMX)和甲氧芐胺嘧啶(TMP)]、2種喹諾酮類抗生素[諾氟沙星(NOF)和左氧氟沙星(LEOF)]、3種四環(huán)素類抗生素[土霉素(OTC)、四環(huán)素(TC)和金霉素(CTC)]以及2種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[紅霉素(ETM)和羅紅霉素(RTM)]，旨在建立一種成本低、適用性廣且能同時(shí)檢測水產(chǎn)品中多種抗生素的分析方法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

TSQ Quantum Access MAX 型高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀；TDL-5-A 型大容量離心機(jī)；Hei-VAP Advantage型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；KQ 2200B型超聲波清洗器；美國SULPELCO SPE-12型固相萃取裝置(內(nèi)置12管)；MTN-2800D 型氮吹儀；Scientz-12N 型冷凍干燥機(jī)；TL-2010型球磨機(jī)。

12種抗生素的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:500 mg·L－1，介質(zhì)為甲醇。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:1 mg·L－1，介質(zhì)為甲醇。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:介質(zhì)為甲醇，質(zhì)量濃度分別為1，2，5，10，20，50，100μg·L－1。

含0.1 mol·L－1Na2EDTA 的Mcllvaine緩沖溶液:稱取11.8 g一水合檸檬酸、13.72 g十二水合磷酸氫二鈉、33.62 g Na2EDTA 溶于1 L水中，溶解搖勻后，用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)pH 至4.0±0.05。

SDZ、SMX、SMZ、SMD、NOF、TC、OTC、CTC、ETM、RTM、TMP、回收率指示物13C-甲氧芐氨嘧啶(13C-TMP)、LEOF 等標(biāo)準(zhǔn)品的純度不小于97%；甲醇、乙腈、丙酮、正己烷、乙酸均為色譜純；乙二胺四乙酸二鈉鹽(Na2EDTA)、一水合檸檬酸(C6H8O7·H2O)、十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)均分析純；試驗(yàn)用水均為超純水(電阻率18.2 MΩ·cm)。

對(duì)蝦樣品隨機(jī)取自杭州灣南岸的南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖基地中的3個(gè)蝦塘，每個(gè)塘采集10～15尾對(duì)蝦。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(150 mm×2.1 mm，5μm)，柱溫30 ℃。流動(dòng)相:A 為0.1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙酸溶液；B 為甲醇；流量0.35 mL·min－1，進(jìn)樣體積10μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program

2)質(zhì)譜條件 電噴霧(ESI)離子源；采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)正離子掃描模式；離子傳輸毛細(xì)管溫度350 ℃；鞘氣為氮?dú)?，流? L·min－1；輔助氣為氮?dú)?，流? L·min－1；碰撞氣為氬氣，流量0.18 mL·min－1；毛細(xì)管電壓4 000 V；霧化器壓力為275.79 k Pa。

目標(biāo)抗生素的定性/定量離子質(zhì)荷比和其他質(zhì)譜參數(shù)見表2，其中“?”為定量離子。

表2 質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 MS parameters

表2 (續(xù))

1.3 試驗(yàn)方法

將對(duì)蝦樣品冷凍干燥后，用球磨機(jī)磨成粉末狀，制成干基樣品，置于－20 ℃冷凍保存，待分析。稱取對(duì)蝦粉末狀試樣1.00 g于50 mL離心管中，加入10 mL體積比為1∶4的含0.1 mol·L－1Na2EDTA的Mcllvaine緩沖溶液-乙腈混合溶液，振蕩1 min，常溫超聲提取10 min，以5 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心5 min，以除去對(duì)蝦樣品中的蛋白質(zhì)，將上清液轉(zhuǎn)移至離心管中，再重復(fù)提取2次，合并提取液。在提取液中加入用乙腈飽和的正己烷20 mL，除去對(duì)蝦樣品中的脂類雜質(zhì)，振蕩5 min，以4 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心10 min。靜置分層，棄去上層正己烷，取下層溶液于40 ℃下旋蒸至體積不變，用水稀釋至200 mL，確保萃取液中有機(jī)溶劑的體積分?jǐn)?shù)小于5%，以防止目標(biāo)抗生素穿透固相萃取柱而無法保留。

CNWBOND LC-C18固相萃取小柱依次用5 mL甲醇和5 mL 水活化后，將樣品溶液以1.0～1.5 mL·min－1的速度過柱，待溶液完全流出后，用5%(體積分?jǐn)?shù))的甲醇溶液5 mL淋洗柱子，棄去全部流出液，用負(fù)壓抽干并以6 mL甲醇洗脫柱子，收集洗脫液并吹氮至近干，用甲醇定容至1.0 mL，經(jīng)0.22μm 針頭式過濾器過濾后，在儀器工作條件下進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

按照儀器工作條件對(duì)50 ng·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，12種抗生素的色譜圖見圖1。

圖1 12種抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖Fig.1 TIC chromatogram of the mixed standard solution of the 12 antibiotics

2.2 提取劑的選擇

四環(huán)素類與氟喹諾酮類抗生素均能與Zn2＋、Fe3＋、Al3＋等金屬離子、有機(jī)固體顆粒形成穩(wěn)定的配合物[16-18]，使其提取效率降低，當(dāng)以含0.1 mol·L－1Na2EDTA 的Mcllvaine緩沖溶液為提取劑時(shí)，這兩種抗生素可以保持電離狀態(tài)，且氟喹諾酮類抗生素的回收率增加[13]，但是這類提取劑對(duì)磺胺類抗生素提取效果較差[19]，可使用乙腈或乙腈和其他緩沖溶液的混合溶液對(duì)磺胺類抗生素進(jìn)行提取[20-23]，同時(shí)乙腈能使樣品中的蛋白質(zhì)變性生成沉淀通過離心去除，其在提取肉類殘留抗生素時(shí)有廣泛的應(yīng)用[24]。

試驗(yàn)考察了以含0.1 mol·L－1Na2EDTA 的Mcllvaine緩沖溶液、不同體積比(1∶1、1∶4、4∶1)的含0.1 mol·L－1Na2EDTA 的Mcllvaine緩沖溶液-乙腈、乙腈為提取劑時(shí)對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液添加量為50 ng·g－1的對(duì)蝦樣品中12種抗生素回收率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 提取劑對(duì)對(duì)蝦中12種抗生素回收率的影響Fig.2 Effect of extract on the recovery of the 12 antibiotics in prawn

由圖2 可以看出:以含0.1 mol· L－1Na2EDTA 的Mcllvaine緩沖溶液或含0.1 mol·L－1Na2EDTA 的Mcllvaine緩沖溶液-乙腈(體積比為4∶1)作為提取劑時(shí)，磺胺類抗生素的回收率均低于60%；以含0.1 mol·L－1Na2EDTA 的Mcllvaine緩沖溶液-乙腈(體積比為1∶1)或含0.1 mol·L－1Na2EDTA 的Mcllvaine緩沖溶液-乙腈(體積比為1∶4)為提取劑時(shí)，磺胺類抗生素的回收率明顯提高，且后者的效果較明顯。這是因?yàn)榛前奉惪股仉y溶于含0.1 mol·L－1Na2EDTA 的Mcllvaine緩沖溶液等非極性有機(jī)溶劑，添加一定量的乙腈有助于增加磺胺類抗生素的溶解度。試驗(yàn)選擇含0.1 mol·L－1Na2EDTA 的Mcllvaine緩沖溶液-乙腈(體積比為1∶4)為提取劑。

2.3 提取劑體積的選擇

提取劑的體積不僅影響提取效果，還影響后續(xù)的旋蒸時(shí)間。試驗(yàn)考察了不同體積(10，15，20 mL)的提取劑對(duì)對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液添加量為50 ng·g－1的對(duì)蝦樣品中12種抗生素回收率的影響，見圖3。

圖3 提取劑體積對(duì)對(duì)蝦中12種抗生素回收率的影響Fig.3 Effect of volume of the extract on the recovery of the 12 antibiotics in prawn

如圖3所示:當(dāng)提取劑體積為10 mL 時(shí)，各抗生素的回收率為74%～109%，可滿足試驗(yàn)要求；而當(dāng)提取劑的體積由10 mL增加至20 mL時(shí)，磺胺類抗生素的回收率增加約5%，其他類抗生素的回收率沒有明顯變化。為減少有機(jī)溶劑的用量及雜質(zhì)干擾，縮短后續(xù)旋蒸時(shí)間，試驗(yàn)選擇提取劑的體積為10 mL。

2.4 超聲時(shí)間的選擇

試驗(yàn)考察了不同超聲(5，10，20，30 min)時(shí)間對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液添加量為50 ng·g－1的對(duì)蝦樣品中12種抗生素回收率的影響，見圖4。

如圖4所示:當(dāng)超聲時(shí)間為5 min時(shí)，各抗生素的回收率均較低(小于80%)；當(dāng)超聲時(shí)間為10～20 min時(shí)，提取效果較好且比較穩(wěn)定；當(dāng)超聲時(shí)間為30 min時(shí)(超聲水浴溫度升高10 ℃以上)，各抗生素回收率明顯下降，尤其是四環(huán)素類和磺胺類抗生素，這是由于隨著超聲時(shí)間的延長，超聲對(duì)抗生素降解作用越來越明顯[25]。試驗(yàn)選擇超聲時(shí)間為10 min。

2.5 固相萃取柱的選擇

圖4 超聲時(shí)間對(duì)對(duì)蝦中12種抗生素回收率的影響Fig.4 Effect of ultrasound time on the recovery of the 12 antibiotics in prawn

在對(duì)對(duì)蝦樣品進(jìn)行提取后，需要使用反相固相萃取柱進(jìn)行進(jìn)一步的凈化以除去其他雜質(zhì)。常用的反相固相萃取柱有HLB柱和C18柱，前者使用的填料為親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物，其可應(yīng)用的酸度范圍較大；后者以十八烷基鍵合硅膠為基質(zhì)，對(duì)上樣操作要求比較嚴(yán)格。為了排除同種填料凈化效果的差異，試驗(yàn)考察了Waters Oasis HLB、Supelco LC-18 和CNWBOND LC-C18等3 種反相固相萃取柱(3種小柱柱容量均為500 mg/6 mL)對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液添加量為50 ng·g－1的對(duì)蝦樣品中12種抗生素回收率的影響，見圖5。

圖5 固相萃取柱對(duì)對(duì)蝦中12種抗生素回收率的影響Fig.5 Effect of SPE column on the recovery of the 12 antibiotics in prawn

如圖5所示:對(duì)于四環(huán)素類物質(zhì)，Supelco LC-18小柱的回收率偏低(約60%)，保留能力不如CNWBOND LC-C18小柱，且洗脫液易出現(xiàn)絮狀物；而提取液過Waters Oasis HLB小柱和CNWBOND LC-C18小柱后均呈澄清狀態(tài)，凈化效果明顯，并且除SDZ、SMD、SMZ、SMX、ETM 外，過CNWBOND LC-C18小柱后的其余7 種抗生素的回收率高于過Waters Oasis HLB小柱的回收率。綜合考慮回收率、凈化效果及經(jīng)濟(jì)成本，試驗(yàn)最終選定的固相萃取柱為CNWBOND LC-C18小柱。

2.6 洗脫劑用量的選擇

洗脫劑的用量是影響洗脫效果的重要因素，洗脫劑用量過少會(huì)導(dǎo)致洗脫不完全，回收率降低；用量過多，不僅會(huì)延長吹氮濃縮的時(shí)間，還會(huì)引入更多的雜質(zhì)，影響后續(xù)檢測。以混合標(biāo)準(zhǔn)溶液添加量為50 ng·g－1的對(duì)蝦樣品為研究對(duì)象，試驗(yàn)選擇用8 mL甲醇對(duì)負(fù)壓抽干的固相萃取柱分8次進(jìn)行洗脫，每次1 mL，收集第3、4、5、6、7、8次的洗脫液，按照試驗(yàn)方法進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。

表2 不同洗脫次數(shù)收集的洗脫液中抗生素的含量Tab.2 Content of antibiotics in eluate collected with the different elution times

由表2可知:第5次的洗脫液中已檢測不到目標(biāo)抗生素，為了保證前處理過程的有效性，試驗(yàn)選擇洗脫劑的用量為6 mL。

2.7 色譜條件的優(yōu)化

當(dāng)溫度高于40℃時(shí)，磺胺類抗生素會(huì)變得極不穩(wěn)定[26]。研究發(fā)現(xiàn)，在30 ℃的色譜柱溫下，3種磺胺類抗生素的吸收值均較高[27]，因此試驗(yàn)選擇的色譜柱柱溫為30 ℃。

由于試驗(yàn)采用甲醇處理樣品，以甲醇作為流動(dòng)相B時(shí)，可以獲得尖銳對(duì)稱的峰形，因此試驗(yàn)選擇甲醇作為流動(dòng)相B。由于酸性的流動(dòng)相能夠增強(qiáng)離子化效果，使抗生素出峰效果更加明顯[28]，因此試驗(yàn)選用0.1%乙酸溶液作為流動(dòng)相A。

2.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按照儀器工作條件對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測定，用外標(biāo)法定量。以12種抗生素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，其對(duì)應(yīng)的的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，12種抗生素的質(zhì)量濃度均在1～100μg·L－1內(nèi)與其對(duì)應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系，線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表3。

按照試驗(yàn)方法對(duì)加標(biāo)量為10 ng·g－1對(duì)蝦樣品進(jìn)行測定，以3倍信噪比計(jì)算12種目標(biāo)抗生素的檢出限(3S/N)，結(jié)果見表3。

表3 12種抗生素的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Tab.3 Linear regression equations，correlation coefficients and detection limits of the 12 antibiotics

由表3 可知:12 種抗生素的檢出限為0.52～3.02 ng·g－1(干重)，說明該方法的靈敏度好，滿足我國對(duì)水產(chǎn)品藥物殘留監(jiān)控的限量要求。

2.9 精密度和回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法對(duì)空白對(duì)蝦樣品中進(jìn)行低、中、高等3個(gè)濃度的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度水平平行測定5 次，計(jì)算回收率和測定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表4。

表4 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝5)Tab.4 Results of tests for precision and recovery(n＝5)%

由表4可以看出:對(duì)蝦中12種抗生素的回收率為70.2%～102%，RSD 均小于14%，說明該方法有較好的準(zhǔn)確度和精密度，符合GB/T 27404－2008中的準(zhǔn)確度和精密度要求(回收率大于60%，RSD小于20%)。

2.10 方法適用性的驗(yàn)證

飼料和對(duì)蝦均為富含蛋白質(zhì)的樣品，為驗(yàn)證該方法的適用性，以飼料樣品為基底，加入100 ng回收率指示物13C-TMP，按照試驗(yàn)方法進(jìn)行測定。結(jié)果表明:13C-TMP回收率為70.3%～104%，說明本方法對(duì)富含蛋白質(zhì)的飼料樣品也具有一定的適用性。

本工作建立了超聲萃取溶劑法-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定南美對(duì)蝦中12種抗生素的方法，該方法的檢出限為0.52～3.02 ng·g－1(干重)；回收率為70.2%～102%，RSD＜14%，符合抗生素類藥物殘留的檢測要求，同時(shí)對(duì)富含蛋白質(zhì)的其他樣品(如飼料)也具有較好的適用性。