牛奶中碳、氮、氫和氧穩(wěn)定同位素比的測(cè)定及其在產(chǎn)地溯源分析中的應(yīng)用

侯建波，張曉峰，朱曉雨，謝 文，張明哲，鄧曉軍，韓 芳，史穎珠，祝澤龍

(1.浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，杭州 310016；2.浙江出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，杭州 310016；3.上海市檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，上海 200003；4.安徽出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，合肥 230032)

牛奶具有營(yíng)養(yǎng)豐富、容易消化吸收、物美價(jià)廉、食用方便等特點(diǎn)，備受消費(fèi)者喜愛。隨著人民生活水平的提高，對(duì)牛奶的消費(fèi)需求不斷增長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)牛奶的質(zhì)量要求越來(lái)越高。隨著我國(guó)進(jìn)出口貿(mào)易的蓬勃發(fā)展，食品貿(mào)易已經(jīng)呈現(xiàn)全球化趨勢(shì)，進(jìn)口產(chǎn)品已成為國(guó)內(nèi)消費(fèi)者日常選擇的對(duì)象。目前市場(chǎng)中牛奶的銷售價(jià)格參差不齊，相同類型和規(guī)格的牛奶，由于產(chǎn)地的不同可能會(huì)帶來(lái)幾倍甚至幾十倍的價(jià)格差異，因此追溯牛奶產(chǎn)地的真實(shí)性對(duì)確定其價(jià)值具有非常重要的意義。

歐盟早在1992 年就已提出產(chǎn)地的概念，并在2000年要求在食品的生產(chǎn)、加工和流通等環(huán)節(jié)建立溯源制度，明確產(chǎn)品來(lái)源[1-3]；美國(guó)、日本等國(guó)家也相繼建立可追溯體系；我國(guó)《食品安全法》明確規(guī)定食品生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)者應(yīng)當(dāng)依法建立食品安全追溯體系，保證食品的可追溯性。由于生物的同位素指紋與其生長(zhǎng)方式、生長(zhǎng)環(huán)境密切相關(guān)，穩(wěn)定同位素溯源技術(shù)已成為追溯食品來(lái)源和實(shí)施產(chǎn)地保護(hù)的一種有效工具。該技術(shù)已成功應(yīng)用于肉制品[4-8]、葡萄酒[9-11]、谷物[12-13]、茶葉[14]、蜂蜜[15]、果汁[16-17]、乳制品[18-21]等食用農(nóng)產(chǎn)品和食品的產(chǎn)地溯源研究中。已有人通過采用元素分析儀等設(shè)備串聯(lián)同位素質(zhì)譜儀測(cè)定牛奶樣品或其所含蛋白質(zhì)、氨基酸中的碳、氮、氫、氧、硫和鍶等穩(wěn)定同位素比值來(lái)對(duì)牛奶的產(chǎn)地進(jìn)行溯源研究和及其產(chǎn)地歸屬情況進(jìn)行分析[22-26]。還有研究人員通過紅外光譜法[27]、指紋圖譜法[28]、射頻識(shí)別技術(shù)[29]和微生物群落分析[30-31]等方法，對(duì)牛奶產(chǎn)地溯源開展研究。

本工作通過元素分析-同位素質(zhì)譜儀(EAIRMS)測(cè)定牛奶的碳、氮穩(wěn)定同位素比值(δ13C 和δ15N)，多用途氣體制備-連續(xù)流穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀(GasBench-IRMS)測(cè)定牛奶中水的氫、氧穩(wěn)定同位素比值(δ2H 和δ18O)。以牛奶的δ13C、δ15N、δ2H和δ18O 等4個(gè)指標(biāo)為分析對(duì)象，同時(shí)對(duì)澳大利亞、奧地利、德國(guó)、西班牙、新西蘭、意大利和中國(guó)的牛奶樣品進(jìn)行測(cè)試和統(tǒng)計(jì)比對(duì)，并對(duì)其判別牛奶產(chǎn)地溯源的可行性進(jìn)行分析，提出了判別模型。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Flash型2000 型元素分析儀；Delta/Mat 252 GasBench II型多用途氣體制備儀；Delta V Advantage型穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀；2.5 Triad 型冷凍干燥機(jī)；CPA225D 型分析天平；錫杯(9 mm×5 mm)。

鉑(Pt)催化劑；氦氣(He)和CO2的純度不小于99.999%；O2的純度不小于99.999%；N2的純度不小于99.999%；H2的純度不小于99.999%；H2/He混合氣中H2的體積分?jǐn)?shù)為1.99%；CO2/He混合氣中CO2的體積分?jǐn)?shù)為0.301%。

咖啡 因(IAEA-600):δ13C＝－27.771‰ ±0.043‰(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)為VPDB)。

L-谷氨 酸(USGS40):δ13C＝－26.39‰ ±0.04‰(相對(duì)于VPDB-LSVEC)，δ15N＝－4.52±0.06‰(相對(duì)于空氣中的N2)。

甘氨酸(USGS65):δ13C＝－20.29±0.04‰(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)為VPDB-LSVEC)，δ15N＝20.68±0.06‰(相對(duì)于空氣中的N2)。

水(USGS45):δ2H＝－10.3±0.4‰(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)為VSMOW-SLAP)，δ18O＝－2.238±0.011‰(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)為VSMOW-SLAP)。

水(USGS47):δ2H＝－150.2±0.5‰(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)為VSMOW-SLAP)，δ18O＝－19.80±0.02‰(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)為VSMOW-SLAP)。

水(USGS50):δ2H＝32.8±0.4‰(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)為VSMOW-SLAP)，δ18O＝4.95±0.02‰(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)為VSMOW-SLAP)。

咖啡因(IAEA-600)、L-谷氨酸(USGS40)、甘氨酸(USGS65)、水(USGS45)、水(USGS47)、水(USGS50)均為參考?xì)庑?zhǔn)物質(zhì)和質(zhì)量控制樣品。

采集的牛奶樣品主要有澳大利亞牛奶樣品35個(gè)(12個(gè)品牌)；奧地利牛奶樣品5 個(gè)(1 個(gè)品牌)；德國(guó)牛奶樣品9個(gè)(3個(gè)品牌)；西班牙牛奶樣品4個(gè)(1個(gè)品牌)；新西蘭牛奶樣品13個(gè)(4 個(gè)品牌)；意大利牛奶樣品7個(gè)(2個(gè)品牌)；中國(guó)牛奶樣品10個(gè)(8個(gè)品牌)。

1.2 儀器工作條件

1)元素分析儀(δ13C 和δ15N 的測(cè)定) He載氣流量200 mL·min－1，CO2參考?xì)饬髁?0 mL·min－1，O2流量180 mL·min－1；氧化爐溫度960 ℃，還原爐溫度640 ℃，水阱溫度50 ℃。

2)GasBench(δ2H 和δ18O 的測(cè)定) H2/He或CO2/He混合氣流量100 mL·min－1，He載氣流量0.5 mL·min－1；每個(gè)樣品吹掃5 min；氣相色譜(GC)色譜柱恒溫50 ℃，進(jìn)樣盤溫度25 ℃。

3)同位素質(zhì)譜儀 電子轟擊離子源(EI)，離子源電壓3.06 kV；真空度1.2×10－4Pa；電流1.5 mA；δ13C、δ15N 和δ18O 的連續(xù)測(cè)定精度小于0.06‰(n＝10)；δ2H 的連續(xù)測(cè)定精度小于0.4‰(n＝10)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1δ13C和δ15N 的測(cè)定

取2μL牛奶樣品置于錫杯中，密封，通過自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)入元素分析儀，按照相應(yīng)儀器工作條件進(jìn)行δ13C的測(cè)定。

將牛奶進(jìn)行冷凍干燥成粉末，研磨均勻，取干粉0.8 mg置于錫杯中，密封，通過自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)入元素分析儀，按照相應(yīng)儀器工作條件進(jìn)行δ15N 的測(cè)定。

1.3.2δ2H 的測(cè)定

取混勻的牛奶500μL 至12 mL 樣品瓶中，加入Pt催化劑，密封，樣品瓶放入自動(dòng)進(jìn)樣器，將H2/He混合氣通過吹掃模式充滿樣品瓶，趕出瓶?jī)?nèi)空氣。樣品瓶密封靜止平衡60 min，使得樣品瓶中混合氣的2H/1H 與牛奶水中的2H/1H 達(dá)到同位素平衡。頂空進(jìn)樣，按照相應(yīng)儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3δ18O 的測(cè)定

取混勻的牛奶500μL 至12 mL 樣品瓶中，密封后將樣品瓶置于自動(dòng)進(jìn)樣器，將CO2/He混合氣通過吹掃模式充入樣品瓶趕走瓶?jī)?nèi)空氣。樣品瓶密封靜止平衡18 h，使混合氣CO2的18O/16O 與牛奶水中的18O/16O 達(dá)到同位素平衡狀態(tài)。頂空進(jìn)樣，按照相應(yīng)儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 計(jì)算方法

平行測(cè)試結(jié)果取平均值，每5個(gè)樣品穿插一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行質(zhì)量控制。各元素的穩(wěn)定同位素比計(jì)算公式如下:

式中:δ為穩(wěn)定同位素比，‰；R樣品和R標(biāo)準(zhǔn)分別為樣品和標(biāo)準(zhǔn)品中各元素的重同位素和輕同位素的豐度比，即13C/12C、15N/14N、2H/1H、18O/16O。其中δ13C的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)為VPDB 和VPDB-LSVEC，δ15N的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)為空氣中的N2，δ2H 和δ18O 的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)為VSMOW-SLAP。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析、Duncan 多重比較分析、聚類分析和判別分析。其中，聚類分析采用系統(tǒng)聚類，聚類距離為歐式距離，聚類方法采用組間聯(lián)接聚類法。判別分析采用Fisher線性判別分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 穩(wěn)定同位素的譜圖

按照試驗(yàn)方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品樣品進(jìn)行測(cè)試，δ13C、δ15N、δ2H 和δ18O 譜圖見圖1。

圖1 碳、氮、氫、氧的穩(wěn)定同位素譜圖Fig.1 Spectra ofδ13 C，δ15 N，δ2 H andδ18 O

2.2 碳、氮、氫、氧穩(wěn)定同位素測(cè)試結(jié)果的地域間差異分析

按照試驗(yàn)方法對(duì)澳大利亞、奧地利、德國(guó)、西班牙、新西蘭、意大利和中國(guó)等7個(gè)不同國(guó)家的牛奶中碳、氮、氫、氧穩(wěn)定同位素進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖2。對(duì)測(cè)試結(jié)果進(jìn)行了方差分析，結(jié)果見表1。其中，表1中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，A、B、C、D 表示存在極顯著性差異(p＜0.01)[32]；a、b、c、d表示存在顯著性差異(p＜0.05)[5]。

由圖2和表1可知:對(duì)δ13C的測(cè)試結(jié)果按從大到小的國(guó)家順序依次為中國(guó)/意大利、西班牙、德國(guó)、澳大利亞/奧地利/新西蘭。研究表明，δ13C 可能與奶牛的飼養(yǎng)方式及牧草類型有關(guān)。不同類型植物δ13C差異較大，其中C4植物的δ13C為－12.92‰～－14.38‰，明顯高于C3植物的δ13C(－24.25‰～－31.71‰)，牧草既有C3植物也有C4植物[32]。因此，不同國(guó)家牛奶中δ13C 的差異，可以反映出奶牛在飼養(yǎng)中使用的牧草類型和飼養(yǎng)方式的差異，如果飼養(yǎng)過程中以C3植物類牧草為主，則其δ13C偏小，以C4植物類牧草為主或引入玉米稈等輔料，則其δ13C含量偏大。

圖2 不同國(guó)家牛奶樣品的δ13 C、δ15 N、δ2 H 和δ18 O 分析結(jié)果Fig.2 Analytical results ofδ13 C、δ15 N、δ2 H andδ18 O in milk samples from different countries

表1 不同國(guó)家牛奶樣品的碳、氮、氫、氧穩(wěn)定同位素方差分析結(jié)果Tab.1 Results of variance analysis ofδ13 C，δ15 N，δ2 H andδ18 O in milk samples from different countries

對(duì)δ15N 的測(cè)試結(jié)果按從大到小的國(guó)家順序依次為澳大利亞、新西蘭、德國(guó)、意大利/奧地利/西班牙、中國(guó)。進(jìn)口牛奶中δ15N高于國(guó)產(chǎn)牛奶。研究表明，δ15N 不但與飼料有關(guān)，還受到地域環(huán)境、氣候、土壤狀況以及生產(chǎn)方式和動(dòng)物自身代謝的影響。因此不同地域牛奶中δ15N 會(huì)存在一定的差異。

對(duì)δ2H 的測(cè)試結(jié)果按從大到小的因家順序依次為澳大利亞、新西蘭、西班牙、德國(guó)、意大利、奧地利、中國(guó)。δ2H 測(cè)試結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)差均較大，說(shuō)明牛奶的δ2H 在地域間存在較大的差異。由于氫穩(wěn)定同位素組成與當(dāng)?shù)仫嬘盟芮邢嚓P(guān)，因此，可將其作為地域信息的載體用于產(chǎn)地來(lái)源的分析。

對(duì)δ18O 的測(cè)試結(jié)果按從大到小的國(guó)家順序依次為澳大利亞、新西蘭、西班牙、德國(guó)、意大利、奧地利、中國(guó)，δ18O 與δ2H 的地域排序順序基本一致。對(duì)δ2H 和δ18O 進(jìn)行相關(guān)性分析，見圖3。

由圖3 可知:δ2H 和δ18O 存在一定的正相關(guān)性，所得線性回歸方程為y＝7.097x－0.113 3，相關(guān)系數(shù)為0.842 2。但由于不同地域牛奶中δ2H的測(cè)試結(jié)果差異更明顯，因此試驗(yàn)選擇δ2H 反映地域差異的效果會(huì)更顯著。

圖3 牛奶樣品中δ2 H 和δ18 O 的相關(guān)性Fig.3 Correlationship betweenδ2 H andδ18 O in milk sample

2.3 碳、氮、氫、氧穩(wěn)定同位素測(cè)試結(jié)果的聚類分析

通過聚類分析，可以初步判斷不同地域牛奶中碳、氮、氫、氧測(cè)試結(jié)果的地域差異及分類效果，結(jié)果見圖4。其中，橫坐標(biāo)A、B、C、D、E、F、G 分別代表德國(guó)、西班牙、意大利、澳大利亞、新西蘭、中國(guó)、奧地利。

圖4 牛奶δ13 C、δ15 N、δ2 H 和δ18 O 系統(tǒng)聚類樹形圖Fig.4 Dendrogram of clustering analysis with values ofδ13 C，δ15 N，δ2 H andδ18 O

由圖4所示，在縱坐標(biāo)3.50處用實(shí)線將樹形圖切斷，可將牛奶樣品分為4類，第1類和第2類主要為澳大利亞和新西蘭的牛奶，其中也包含了少量西班牙的牛奶；第3類主要為德國(guó)和意大利的牛奶；第四類主要為中國(guó)和奧地利的牛奶，其中包含了1個(gè)意大利的牛奶。

通過對(duì)穩(wěn)定同位素測(cè)定結(jié)果的聚類分析，可以對(duì)牛奶樣品進(jìn)行一定的分類和區(qū)分，可作為牛奶產(chǎn)地判別的參考指標(biāo)。

2.4 碳、氮、氧、氫穩(wěn)定同位素指標(biāo)對(duì)牛奶產(chǎn)地的判別分析

為了進(jìn)一步確定牛奶產(chǎn)地的判別效果，了解各個(gè)指標(biāo)在牛奶產(chǎn)地分析中的作用，試驗(yàn)采用Fisher線性判別方法對(duì)碳、氮、氫、氧穩(wěn)定同位素測(cè)試結(jié)果等4個(gè)指標(biāo)的判別能力進(jìn)行比較，判別模型的可靠性采用交叉檢驗(yàn)法(留一法)進(jìn)行檢驗(yàn)[8]，結(jié)果見表2。

表2 不同國(guó)家牛奶中碳、氮、氫、氧4種元素穩(wěn)定同位素比值測(cè)試結(jié)果的線性判別分析的交叉驗(yàn)證結(jié)果Tab.2 Results of cross validation test on testing results of linear discriminant analysis on values ofδ13 C，δ15 N，δ2 H andδ18 O in milk samples from various countries

由表2可以看出:在區(qū)分牛奶地域來(lái)源時(shí)，單一指標(biāo)的判別效果較弱，交叉檢驗(yàn)的整體判別正確率低于60%，其中δ2H 指標(biāo)的判別效果略優(yōu)于其他指標(biāo)。將測(cè)試結(jié)果進(jìn)行組合后，判別正確率明顯提升，δ13C、δ15N 和δ2H 等3項(xiàng)指標(biāo)組合交叉檢驗(yàn)整體判別正確率達(dá)到84.3%，其中澳大利亞和新西蘭存在相互誤判的情況。由于δ2H 和δ18O 存在一定的相關(guān)性，在引入δ18O 后，整體判別正確率并未提升，因此可采用δ13C、δ15N 和δ2H 組合指標(biāo)對(duì)牛奶產(chǎn)地進(jìn)行判別分析。

對(duì)δ13C、δ15N 和δ2H 組合指標(biāo)進(jìn)行判別函數(shù)和方差貢獻(xiàn)率分析。根據(jù)SPSS軟件給出的數(shù)據(jù)，判別函數(shù)1方差貢獻(xiàn)率88.8%，同時(shí)包含了δ13C、δ15N 和δ2H 的信息；判別函數(shù)2 的方差貢獻(xiàn)率8.1%，主要包含δ13C 和δ2H 的信息。判別函數(shù)3的方差貢獻(xiàn)率3.1%，主要包含δ15N 的信息。因此推測(cè)δ13C、δ2H 是牛奶產(chǎn)地判別的主要參考指標(biāo)，其次是δ15N。當(dāng)采用δ13C、δ15N 和δ2H 組合指標(biāo)對(duì)不同國(guó)家牛奶樣品進(jìn)行區(qū)分時(shí)發(fā)現(xiàn)，除了德國(guó)和意大利存在部分牛奶重疊的情況、澳大利亞和新西蘭的牛奶產(chǎn)地區(qū)分效果略差等問題，組合指標(biāo)可以對(duì)不同國(guó)家的牛奶進(jìn)行區(qū)分。利用牛奶中δ13C、δ15N和δ2H 組合指標(biāo)建立的判別模型依次是Y(澳大利亞)＝261.78－13.82δ13C＋25.72δ15N－0.38δ2H、Y(奧地利)＝－250.32－14.53δ13C＋22.07δ15N－0.28δ2H、Y(德國(guó))＝－194.36－11.72δ13C＋21.80δ15N－0.07δ2H、Y(新西蘭)＝－273.18－14.54δ13C＋24.16δ15N－0.29δ2H、Y(西班牙)＝－159.48－10.91δ13C＋19.25δ15N－0.17δ2H、Y(意大利)＝－165.70－10.56δ13C＋20.22δ15N－0.20δ2H 和Y(中國(guó))＝－130.69－9.45δ13C＋13.59δ15N－0.48δ2H。

對(duì)來(lái)自不同地區(qū)的盲樣進(jìn)行鑒別歸類時(shí)，可將各樣品的測(cè)定結(jié)果分別代入上述判別模型，比較各地域Y值大小，并將盲樣歸屬于Y值最大的地域。

本工作通過元素分析-同位素質(zhì)譜法和多用途氣體制備-連續(xù)流穩(wěn)定同位素質(zhì)譜分析法，分別對(duì)澳大利亞、奧地利、德國(guó)、西班牙、新西蘭、意大利和中國(guó)等7個(gè)地域牛奶的碳、氮、氫、氧穩(wěn)定同位素指標(biāo)進(jìn)行測(cè)試，并對(duì)測(cè)定指標(biāo)進(jìn)行方差分析、聚類分析和判別分析。結(jié)果表明:碳、氮、氫穩(wěn)定同位素組合指標(biāo)對(duì)牛奶地域的整體判別正確率較高(84.3%)，對(duì)于牛奶的產(chǎn)地溯源分析可以提供一些必要的信息，可作為牛奶產(chǎn)地溯源的有效參考指標(biāo)，對(duì)牛奶產(chǎn)地的監(jiān)管具有一定的意義。后續(xù)研究可通過增加元素分析或紅外光譜等其他參數(shù)和技術(shù)手段進(jìn)行測(cè)定和分析，進(jìn)一步提高牛奶產(chǎn)品地域的判別正確率。