2019年遼寧省獸醫(yī)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力比對(duì)結(jié)果分析

（遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧沈陽(yáng) 110164）

自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2010年實(shí)施全國(guó)獸醫(yī)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室考核制度以來(lái)，實(shí)驗(yàn)室比對(duì)作為檢驗(yàn)和提升各級(jí)獸醫(yī)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力的重要手段，在全國(guó)各級(jí)獸醫(yī)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室范圍內(nèi)被廣泛采用[1-3]，在加強(qiáng)和促進(jìn)全國(guó)各級(jí)獸醫(yī)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室管理體系建立與持續(xù)改進(jìn)、實(shí)驗(yàn)室規(guī)范化管理水平和檢測(cè)能力持續(xù)提升等方面發(fā)揮了重要作用。

2019年10 月，遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心（以下稱遼寧省疫控中心）組織開(kāi)展了全省市、縣級(jí)獸醫(yī)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力比對(duì)。全省14個(gè)地市級(jí)、24個(gè)生豬調(diào)出大縣（具備分子生物學(xué)檢測(cè)能力）和33個(gè)其他縣級(jí)（僅具備血清學(xué)檢測(cè)能力）獸醫(yī)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室參加了比對(duì)，并在規(guī)定時(shí)限內(nèi)完成比對(duì)項(xiàng)目。本次能力比對(duì)是在經(jīng)歷2018年遼寧省機(jī)構(gòu)改革，全省各級(jí)疫控機(jī)構(gòu)發(fā)生重大變革、人員發(fā)生較大變動(dòng)的情況下組織實(shí)施，較為客觀地反映了當(dāng)前遼寧省市、縣級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力水平，為下一步各級(jí)政府獸醫(yī)主管部門制定針對(duì)性政策措施，推進(jìn)全省獸醫(yī)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室整體檢測(cè)能力的提升提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 比對(duì)項(xiàng)目設(shè)置

根據(jù)地市、縣級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室具備分子生物學(xué)檢測(cè)能力和血清學(xué)檢測(cè)能力的不同，14個(gè)地市級(jí)及24個(gè)生豬調(diào)出大縣獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室參加非洲豬瘟病毒（ASFV）核酸熒光PCR、H7 亞型禽流感病毒（AIV）抗體HI 試驗(yàn)和豬O 型口蹄疫病毒（FMDV）抗體阻斷ELISA 等3個(gè)比對(duì)項(xiàng)目；33個(gè)其他縣級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室參加H7 亞型AIV 抗體HI 試驗(yàn)、豬O型FMDV 抗體阻斷ELISA 和豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）抗體間接ELISA 等3個(gè)比對(duì)項(xiàng)目。

1.2 比對(duì)方法、檢測(cè)試劑和標(biāo)準(zhǔn)

針對(duì)不同的比對(duì)項(xiàng)目，依據(jù)相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布或推薦的檢測(cè)方法，各項(xiàng)目使用的檢測(cè)試劑盒及參考標(biāo)準(zhǔn)樣品由遼寧省疫控中心提供，保證每種試劑和標(biāo)準(zhǔn)樣品為同一批次，并通過(guò)遼寧省疫控中心驗(yàn)證符合要求（表1）。

1.3 比對(duì)樣品

比對(duì)項(xiàng)目的參考標(biāo)準(zhǔn)樣品由相應(yīng)項(xiàng)目的國(guó)家參考實(shí)驗(yàn)室、試劑公司提供，經(jīng)遼寧省疫控中心再次驗(yàn)證后，完成各比對(duì)項(xiàng)目的盲樣制備、標(biāo)定、分裝、編號(hào)、保存和發(fā)放。

1.3.1 ASFV 核酸熒光PCR 比對(duì)樣品 參考標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性、陰性核酸樣品進(jìn)行不同倍數(shù)稀釋，重新進(jìn)行定值后制備成盲樣，陰、陽(yáng)性樣品進(jìn)行隨機(jī)組合成一組6 份盲樣。

1.3.2 H7 亞型AIV 抗體HI 試驗(yàn)比對(duì)樣品 參考值為0log2、6log2、8log2 和10log2 的禽血清樣品，隨機(jī)組合成一組6 份盲樣，各參考值樣品數(shù)量不確定。

1.3.3 豬O 型FMDV 抗體阻斷ELISA 比對(duì)樣品 參考值為1:720、1:360、1:90 和＜1:8 的豬血清樣品，隨機(jī)組合成一組6 份盲樣，各參考值樣品數(shù)量不確定。

1.3.4 PRRSV 抗體間接ELISA 比對(duì)樣品 參考值為陽(yáng)性、弱陽(yáng)性和陰性的豬血清樣品，隨機(jī)組合成一組6 份盲樣，陰性、弱陽(yáng)性、陽(yáng)性樣品數(shù)量不確定。

1.4 樣品的傳遞

由14個(gè)地市級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室派專人統(tǒng)一到遼寧省疫控中心領(lǐng)取市本級(jí)和所轄縣區(qū)實(shí)驗(yàn)室的比對(duì)盲樣及檢測(cè)試劑，全程冷藏運(yùn)送，并于當(dāng)日送達(dá)各參加比對(duì)的實(shí)驗(yàn)室。各實(shí)驗(yàn)室須在規(guī)定的時(shí)限內(nèi)完成比對(duì)檢測(cè)工作，并規(guī)范上報(bào)比對(duì)結(jié)果。

表1 比對(duì)項(xiàng)目的檢測(cè)方法、依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)和主要試劑

1.5 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

ASFV 核酸熒光PCR 和PRRSV 抗體間接ELISA 比對(duì)項(xiàng)目的判定標(biāo)準(zhǔn)：盲樣的檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)定值完全一致，即參考值為陽(yáng)性（含弱陽(yáng)性）的盲樣檢測(cè)結(jié)果為“陽(yáng)性”，參考值為陰性的盲樣檢測(cè)結(jié)果為“陰性”，判為比對(duì)結(jié)果正確，否則為錯(cuò)誤；H7 亞型AIV 抗體HI 試驗(yàn)和豬O 型FMDV 抗體阻斷ELISA 比對(duì)項(xiàng)目的判定標(biāo)準(zhǔn)：盲樣的檢測(cè)結(jié)果偏離在1個(gè)滴度范圍內(nèi)，判為比對(duì)結(jié)果正確，如存在2個(gè)及以上滴度的偏離，判為比對(duì)結(jié)果錯(cuò)誤。

1.6 結(jié)果分析

根據(jù)各比對(duì)項(xiàng)目的結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)參加比對(duì)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，另外在比對(duì)項(xiàng)目設(shè)置時(shí)，除ASFV 熒光PCR 外的其他3個(gè)比對(duì)項(xiàng)目在設(shè)置時(shí)為定性檢測(cè)，在本文中不做進(jìn)一步偏離程度分析，只對(duì)定量檢測(cè)比對(duì)項(xiàng)目ASFV 熒光PCR 按照CNAS-GL002《能力驗(yàn)證結(jié)果的統(tǒng)計(jì)處理和能力評(píng)價(jià)指南》中方法進(jìn)行了能力統(tǒng)計(jì)量的計(jì)算[4]，以相對(duì)偏差（D）和Z比分?jǐn)?shù)分析各實(shí)驗(yàn)室熒光Ct檢測(cè)值和給定參考值的差異，計(jì)算公式：D=（檢測(cè)值-參考值）×100%/參考值；Z=（檢測(cè)值-參考值）/σ，其中σ表示能力評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)差，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)值（預(yù)期值）設(shè)定為0.2×參考值。本次比對(duì)試驗(yàn)中強(qiáng)陽(yáng)性樣品Ct 參考值為25.80，弱陽(yáng)性樣品Ct參考值為29.60。結(jié)果分析：|Z|≤2，表明“滿意”；2 ＜|Z|＜3，表明“有問(wèn)題”，產(chǎn)生警戒信號(hào)，提醒實(shí)驗(yàn)室應(yīng)引起注意；|Z|≥3，表明“不滿意”，產(chǎn)生措施信號(hào)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)分析原因，制定針對(duì)性整改措施。

2 比對(duì)結(jié)果

2.1 市、縣級(jí)實(shí)驗(yàn)室比對(duì)結(jié)果總體情況

參加2019年度遼寧省獸醫(yī)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力比對(duì)的71家地市、縣級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室均在規(guī)定時(shí)限內(nèi)完成比對(duì)并上報(bào)結(jié)果，其中14家地市級(jí)、53家縣級(jí)實(shí)驗(yàn)室所有比對(duì)項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果全部正確，其余4家比對(duì)不合格的縣級(jí)實(shí)驗(yàn)室中，包括1個(gè)生豬調(diào)出大縣實(shí)驗(yàn)室有2 份樣品檢測(cè)結(jié)果錯(cuò)誤、3家其他縣級(jí)實(shí)驗(yàn)室各有1 份樣品檢測(cè)結(jié)果錯(cuò)誤，總體實(shí)驗(yàn)室正確率為94.37%、樣品檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確率達(dá)99.61%（表2）。

2.2 各比對(duì)項(xiàng)目的檢測(cè)結(jié)果情況

參加ASFV 核酸熒光PCR 比對(duì)項(xiàng)目的14家地市級(jí)和24家生豬調(diào)出大縣實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果全部正確，實(shí)驗(yàn)室正確率和樣品正確率均為100%；參加H7 亞型AIV 抗體HI 試驗(yàn)比對(duì)項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)室中有2家其他縣級(jí)實(shí)驗(yàn)室各出現(xiàn)1個(gè)樣品檢測(cè)結(jié)果錯(cuò)誤；參加O 型FMDV 抗體阻斷ELISA 比對(duì)項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)室中有1家生豬調(diào)出大縣、1家其他縣級(jí)實(shí)驗(yàn)室各出現(xiàn)2個(gè)和1個(gè)樣品檢測(cè)結(jié)果錯(cuò)誤（表3）。

2.3 ASFV 核酸熒光PCR 比對(duì)結(jié)果分析

對(duì)38個(gè)參加該項(xiàng)目比對(duì)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果Ct 值進(jìn)行差異分析表明，盡管均未出現(xiàn)判定結(jié)果結(jié)論性錯(cuò)誤，但實(shí)驗(yàn)室間Ct 值差異較大，利用公式進(jìn)行計(jì)算，各實(shí)驗(yàn)室比對(duì)結(jié)果Ct 值的相對(duì)偏差與Z比分?jǐn)?shù)見(jiàn)表4，Z比分?jǐn)?shù)情況見(jiàn)圖1。結(jié)果：|Z|≥3 的實(shí)驗(yàn)室共9個(gè)，表明為“不滿意”結(jié)果，占比23.68%；2 ＜|Z|＜3 的實(shí)驗(yàn)室共9個(gè)，表明為“有問(wèn)題”結(jié)果，占比23.68%；|Z|≤2 的實(shí)驗(yàn)室共20個(gè)，表明為“滿意”結(jié)果，占比52.64%。

表2 遼寧省市、縣級(jí)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力比對(duì)情況

表3 遼寧省市、縣級(jí)實(shí)驗(yàn)室各比對(duì)項(xiàng)目比對(duì)結(jié)果

表4 遼寧省市、縣級(jí)實(shí)驗(yàn)室ASFV 核酸熒光PCR 比對(duì)結(jié)果

3 討論

圖1 2019年遼寧省市、縣級(jí)實(shí)驗(yàn)室ASFV核酸PCR 比對(duì)Z 比分?jǐn)?shù)結(jié)果

從2019年度檢測(cè)能力比對(duì)的總體結(jié)果來(lái)看，除4個(gè)縣級(jí)實(shí)驗(yàn)室在2個(gè)血清學(xué)檢測(cè)項(xiàng)目上出現(xiàn)共5個(gè)樣品較大偏差外，其他實(shí)驗(yàn)室均100%正確，實(shí)驗(yàn)室總體正確率和樣品正確率分別達(dá)到94.37%和99.61%。與2017、2018年的總體樣品正確率相比，分別提升了0.32 和1.24個(gè)百分點(diǎn)，表明經(jīng)過(guò)近年來(lái)實(shí)施的各級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室考核，積極推進(jìn)市縣獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)認(rèn)定，持續(xù)改進(jìn)實(shí)驗(yàn)室管理體系及開(kāi)展各項(xiàng)業(yè)務(wù)技能培訓(xùn)等措施[5]，遼寧省各級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室在檢測(cè)能力水平上有一定程度提升，具備了較好完成動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)、檢測(cè)的能力。但實(shí)驗(yàn)室間仍存在一定差距，地市級(jí)實(shí)驗(yàn)室的整體水平要高于縣級(jí)實(shí)驗(yàn)室，提示下一步要重點(diǎn)加強(qiáng)縣級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)方面投入，采取針對(duì)性措施提升縣級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室規(guī)范化管理和檢測(cè)能力。

在2019年度檢測(cè)能力比對(duì)項(xiàng)目的設(shè)置中，首次將ASFV 核酸熒光PCR 項(xiàng)目作為遼寧省具備ASFV 檢測(cè)資質(zhì)的14個(gè)地市和24個(gè)生豬調(diào)出大縣獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)的比對(duì)項(xiàng)目之一，主要考慮這些獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室持續(xù)保持ASFV 檢測(cè)能力水平是有效防控該病的重要支撐力量。從比對(duì)結(jié)果來(lái)看，參加該比對(duì)項(xiàng)目的38個(gè)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果均未出現(xiàn)結(jié)論性錯(cuò)誤，但各實(shí)驗(yàn)室間熒光PCR 檢測(cè)結(jié)果熒光Ct 值差異較大，從能力統(tǒng)計(jì)量計(jì)算結(jié)果來(lái)看，相對(duì)偏差較大，|Z|≥3 的實(shí)驗(yàn)室有9個(gè)（其中地市級(jí)2個(gè)），表明這些實(shí)驗(yàn)室該項(xiàng)目檢測(cè)能力為“不滿意”水平，在檢測(cè)一些低拷貝含量臨床樣品中出現(xiàn)錯(cuò)誤檢測(cè)結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)較高；另外，也有9個(gè)實(shí)驗(yàn)室（其中地市級(jí)2個(gè)）處于2 ＜|Z|＜3 的“有問(wèn)題”水平，提示這些實(shí)驗(yàn)室應(yīng)引起警戒。因此，建議上述18個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)認(rèn)真查找原因，并采取針對(duì)性糾正措施，以進(jìn)一步提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

參加PRRSV 抗體間接ELISA 項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果均100%正確，表明各實(shí)驗(yàn)室對(duì)該檢測(cè)項(xiàng)目掌握水平較高，分析可能與間接ELISA 方法操作步驟較少、試劑盒標(biāo)準(zhǔn)化程度較高、檢測(cè)時(shí)間較短等因素有關(guān)；鑒于HI 試驗(yàn)是各級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室最常用的血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)，近年來(lái)，各級(jí)實(shí)驗(yàn)室加強(qiáng)了對(duì)HI 的針對(duì)性培訓(xùn)，但遼寧省每年的實(shí)驗(yàn)室比對(duì)中均有實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)較大偏差，也是2019年各比對(duì)項(xiàng)目中出錯(cuò)率最高的項(xiàng)目，有2個(gè)縣級(jí)實(shí)驗(yàn)室各1個(gè)樣品檢測(cè)結(jié)果存在較大偏差，分析可能與2018年機(jī)構(gòu)改革后實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員變動(dòng)、新的檢測(cè)人員未嚴(yán)格按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程操作、進(jìn)行4 單位抗原配置和回滴不準(zhǔn)確、判定結(jié)果經(jīng)驗(yàn)不足等因素有關(guān)；在豬O 型FMDV 抗體檢測(cè)項(xiàng)目中，有2個(gè)縣級(jí)實(shí)驗(yàn)室各出現(xiàn)2個(gè)和1個(gè)樣品檢測(cè)結(jié)果偏差較大，分析可能與液相阻斷ELISA 試驗(yàn)操作較為繁瑣、試劑標(biāo)準(zhǔn)化程度不高等客觀因素有關(guān)。通過(guò)進(jìn)一步調(diào)查顯示，這2個(gè)實(shí)驗(yàn)室均存在檢測(cè)專職人員不足、老齡化嚴(yán)重、儀器設(shè)備老化且缺乏專業(yè)化維護(hù)等不利因素。

另外，我國(guó)獸醫(yī)領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)極為匱乏，較大程度上影響檢測(cè)結(jié)果的量值溯源過(guò)程，從而對(duì)實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)的評(píng)判尺度一致性產(chǎn)生較大影響。近年來(lái)，中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心牽頭開(kāi)展了多種動(dòng)物疫病核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制[6]，截至目前，已有PRRSV 和ASFV 等2種病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)面世，但遠(yuǎn)不能滿足需求，且抗體方面的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)目前仍是空白，導(dǎo)致我國(guó)獸醫(yī)領(lǐng)域檢測(cè)試劑質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)方面缺乏“金標(biāo)準(zhǔn)”，嚴(yán)重制約了檢測(cè)試劑的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化進(jìn)程，一定程度上也影響了實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性和客觀公正性。

本次比對(duì)試驗(yàn)在ASFV 核酸熒光PCR 比對(duì)項(xiàng)目的方案設(shè)計(jì)上存在一定局限性，應(yīng)事先規(guī)定參加比對(duì)的實(shí)驗(yàn)室選用的核酸提取試劑盒種類及提取方式，以保證實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)的檢測(cè)系統(tǒng)等客觀因素的一致性。

4 建議

一是建議各級(jí)政府部門加強(qiáng)對(duì)獸醫(yī)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)和改造升級(jí)方面的資金投入，尤其是加強(qiáng)條件較差的縣級(jí)實(shí)驗(yàn)室的投入，促進(jìn)老舊儀器設(shè)備及時(shí)更新?lián)Q代，保證硬件條件滿足檢測(cè)要求；二是建議各級(jí)政府部門要著重考慮對(duì)檢測(cè)專職人員緊缺、人員老齡化較嚴(yán)重的實(shí)驗(yàn)室年輕專業(yè)人才的適時(shí)補(bǔ)充，確保人才梯度合理；三是各級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室要加強(qiáng)人員培訓(xùn)，尤其要加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室管理體系建立與運(yùn)行、檢測(cè)技能等全方位的持續(xù)強(qiáng)化培訓(xùn)，進(jìn)一步提升實(shí)驗(yàn)室規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化管理水平及檢測(cè)人員檢測(cè)技能水平，確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠；四是建議實(shí)驗(yàn)室能力比對(duì)的組織者在比對(duì)方案設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)盡量嚴(yán)謹(jǐn)周密，預(yù)先規(guī)定好實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)的各項(xiàng)條件（如檢測(cè)試劑種類、核酸提取方法、檢測(cè)依據(jù)方法和標(biāo)準(zhǔn)等），以確保各實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)系統(tǒng)近可能一致，從而保證比對(duì)結(jié)果客觀公正；五是建議國(guó)家組織各方面科研力量加快標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制和轉(zhuǎn)化應(yīng)用、加快標(biāo)準(zhǔn)方法的制定和更新，促進(jìn)獸醫(yī)領(lǐng)域檢測(cè)試劑的標(biāo)準(zhǔn)化水平提升。