狂犬病病毒抗體納米熒光檢測(cè)試紙條的臨床應(yīng)用

吳昊星，劉百紅，劉雪微，王 敏，呂艷麗，陳西釗

（1.北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司，北京 100089；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100089）

狂犬?。╮abies）是由狂犬病病毒導(dǎo)致的一種人獸共患疾病，又稱恐水癥[1]。狂犬病病毒屬于核糖核酸型彈狀病毒，通過唾液傳播，多見于犬、狼、貓等食肉動(dòng)物?？袢∈鞘澜缟喜∷缆首罡叩募膊?，一旦發(fā)病，病死率幾乎為100%[2-4]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年約有59 000 人死于狂犬病，其中95%的患者來自亞洲、非洲等發(fā)展中國(guó)家。造成這一嚴(yán)重狀況的主要原因是較高的疫苗成本和患病動(dòng)物難以控制等[5]。近年來，我國(guó)狂犬病發(fā)病和死亡人數(shù)呈上升趨勢(shì)，自2003年以來，年發(fā)病例數(shù)均超過2 000 例。疫苗免疫是預(yù)防狂犬病的主要措施之一。而免疫效果的好壞，需要相應(yīng)的技術(shù)方法對(duì)其進(jìn)行評(píng)估和監(jiān)測(cè)。本研究對(duì)一種基于熒光層析技術(shù)的狂犬病病毒抗體檢測(cè)方法進(jìn)行了臨床應(yīng)用，旨在評(píng)價(jià)該納米熒光試紙條的性能。

1 材料和方法

1.1 材料

狂犬病病毒納米熒光抗體試紙條，來源于實(shí)驗(yàn)室自制；AFS-1000 熒光分析儀，購(gòu)自廣州藍(lán)勃公司；犬狂犬病病毒、犬瘟熱病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒與犬細(xì)小病毒五聯(lián)活疫苗（批號(hào)20170607-1），購(gòu)自吉林省五星動(dòng)物保健藥廠；犬貓狂犬病病毒抗體檢測(cè)試劑盒（批號(hào)17ZEAW002），購(gòu)自法國(guó)SYNBIOTICS公司；狂犬病病毒抗體ELISA 試劑盒（批號(hào)RV20181029E），購(gòu)自北京世紀(jì)元亨公司。

1.2 檢測(cè)樣本

A 組：37 份未免疫狂犬病疫苗的犬血清；B 組：36 份免疫狂犬病疫苗后1個(gè)月的犬血清；C 組：36 份免疫狂犬疫苗后2個(gè)月的犬血清。A、B、C 3 組犬血清，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)饋贈(zèng)；免疫疫苗，為吉林五星動(dòng)物保健廠生產(chǎn)的犬狂犬病病毒、犬瘟熱病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒與犬細(xì)小病毒五聯(lián)活疫苗；122 份臨床犬血清，來自合作養(yǎng)犬基地。

1.3 檢測(cè)與結(jié)果判定

將采集的A、B、C 3 組犬血清樣本，按照狂犬病病毒納米熒光抗體檢測(cè)試紙條說明書進(jìn)行檢測(cè)，記錄結(jié)果。試紙條臨界值（Cut-off）為0.5，大于0.5 為狂犬病病毒抗體陽(yáng)性，反之為陰性。采用試紙條、SYNBIOTICS 試劑盒、北京世紀(jì)元亨試劑盒，同時(shí)檢測(cè)122 份臨床犬血清。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)記錄的檢測(cè)結(jié)果，分析3 組犬血清樣本的狂犬病病毒抗體變化；利用SPSS 25 軟件計(jì)算試紙條、SYNBIOTICS 試劑盒、北京世紀(jì)元亨試劑盒的符合率及Kappa 值。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 組犬血清抗體檢測(cè)

從A、B、C 3 組犬血清的檢測(cè)結(jié)果（圖1）可以看出：未免疫狂犬病疫苗的A 組整體抗體水平極低，免疫狂犬病疫苗1個(gè)月后的B 組抗體水平迅速升高，免疫2個(gè)月后的C 組抗體水平出現(xiàn)回落，與犬血清中的狂犬病病毒免疫抗體變化規(guī)律[6]完全相符。

圖1 A、B、C 3 組犬血清的狂犬病病毒抗體檢測(cè)結(jié)果

2.2 臨床犬血清檢測(cè)

試紙條與SYNBIOTICS 試劑盒的臨床犬血清檢測(cè)結(jié)果（表1）顯示，兩者陽(yáng)性符合率為92%，陰性符合率為91.67%，總符合率為90.17%。經(jīng)SPSS 25 統(tǒng)計(jì)分析，Kappa 值為0.832。試紙條與北京世紀(jì)元亨ELISA 試劑盒的檢測(cè)結(jié)果（表2）顯示，兩者陽(yáng)性符合率為96.16%，陰性符合率為97.15%，總符合率為96.73%。經(jīng)SPSS 25 統(tǒng)計(jì)分析，Kappa 值為0.933。

表1 試紙條與SYNBIOTICS 試劑盒符合率試驗(yàn) 單位：份

表2 試紙條與北京世紀(jì)元亨ELISA 試劑盒符合率試驗(yàn) 單位：份

3 討論

狂犬病是一種病死率極高的人獸共患自然疫源性疾病。目前尚無有效治療藥物，注射狂犬病疫苗是目前預(yù)防狂犬病的有效措施之一。市場(chǎng)上的狂犬病病毒抗體檢測(cè)試劑盒較多，技術(shù)方法目前主要集中在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和膠體金免疫層析試驗(yàn)（GIA）。張德寶等[7]以滅活純化的狂犬病病毒SRV9 株為包被抗原，制備了5 批次狂犬病病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒。該試劑盒與FAVN法、商品化進(jìn)口試劑盒相比，總符合率分別為90.80%和94.25%，敏感性較高。本研究臨床應(yīng)用的試紙條是一種基于免疫層析技術(shù)和納米熒光微球標(biāo)記技術(shù)的診斷方法。采用該試紙條檢測(cè)未免疫和免疫后不同時(shí)間的犬血清樣本，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果與免疫抗體變化規(guī)律完全相符。臨床犬血清檢測(cè)結(jié)果顯示，該試紙條與法國(guó)SYBIOTICS 試劑盒、北京世紀(jì)元亨ELISA 試劑盒一致性良好，符合率均在90%以上。臨床應(yīng)用結(jié)果表明，該試紙條可用于犬血清的抗體檢測(cè)，而且能夠量化檢測(cè)結(jié)果并快速檢測(cè)樣本，從而彌補(bǔ)了ELISA 方法時(shí)效性差和GIA 方法靠肉眼觀察無法量化結(jié)果的缺點(diǎn)，便于檢測(cè)人員快速準(zhǔn)確檢測(cè)狂犬病病毒抗體。

從巴斯德開創(chuàng)兔腦脊髓組織狂犬病疫苗到現(xiàn)在，狂犬病病毒已發(fā)展了5 代：早期為神經(jīng)組織來源疫苗，第2 代為禽胚培養(yǎng)疫苗，第3 代為細(xì)胞培養(yǎng)疫苗，第4 代為亞單位疫苗及精制疫苗，第5 代為正在發(fā)展的新一代基因工程疫苗[8]。弱毒疫苗使用的毒株包括SAG1、ERA、Flury 株等。由于弱毒疫苗存在一定的安全隱患，WHO 提倡使用滅活疫苗來代替弱毒疫苗。滅活疫苗使用的毒株包括PM、Flury、CTN、aG 株等[9]。本試驗(yàn)免疫疫苗為“五聯(lián)苗”，其中狂犬病病毒疫苗株為CVS-11 株，對(duì)其他疫苗株未進(jìn)行免疫試驗(yàn)。下一步，需利用該試紙條對(duì)不同疫苗株進(jìn)行免疫效果評(píng)價(jià)，與其他商品試劑盒對(duì)不一致樣本通過中和試驗(yàn)進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證，進(jìn)一步探究該試紙條的臨床檢測(cè)效果。

4 結(jié)論

該研制的狂犬病病毒抗體納米熒光檢測(cè)試紙條可以真實(shí)反映不同免疫階段的狂犬病病毒抗體變化，與法國(guó)SYBIOTICS 公司的犬貓狂犬病病毒抗體檢測(cè)試劑盒、北京世紀(jì)元亨公司的狂犬病毒抗體ELISA試劑盒一致性良好，可應(yīng)用于臨床中狂犬病疫苗的免疫效果評(píng)估，指導(dǎo)臨床建立合理的免疫策略。