上海市某奶牛場(chǎng)牛型結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)疑似結(jié)果影響因素分析

夏爐明，孫泉云，龔國(guó)華，顧 曉，翁永剛，戴蓮群，朱九超，趙洪進(jìn)

（1.上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103；2.奉賢區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201400；3.金山區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201500）

牛結(jié)核病（bovine tuberculosis）是由牛分支桿菌引起的一種人獸共患慢性消耗性傳染病，其特點(diǎn)是在多種組織器官形成結(jié)核結(jié)節(jié)和干酪樣壞死或鈣化結(jié)節(jié)[1]。該病在世界各國(guó)廣泛分布，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列入須通報(bào)動(dòng)物疫病名錄，我國(guó)將其列為二類動(dòng)物疫病。目前，牛結(jié)核病已在許多發(fā)達(dá)國(guó)家得到有效控制，但在防制措施不健全的國(guó)家和地區(qū)，普遍呈地區(qū)性流行[2]。我國(guó)牛結(jié)核病流行近年來(lái)呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì)[3]。牛分支桿菌屬于細(xì)胞內(nèi)寄生菌，因此細(xì)胞免疫介導(dǎo)的診斷方法是最理想、有效的活畜檢測(cè)方法。目前廣泛應(yīng)用的檢測(cè)方法包括，提純牛型結(jié)核菌素（PPD）皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)（TST）、PPD 比較皮內(nèi)變態(tài)試驗(yàn)（SICTT）和牛γ-干擾素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（IFN-γ-ELISA）[4-5]。

上海市通過多年監(jiān)測(cè)、撲殺等凈化措施的實(shí)施，在牛結(jié)核病防控方面取得了顯著成效，陽(yáng)性率已逐步下降到0.1%以下，達(dá)到了穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)[6-7]。根據(jù)《上海市牛結(jié)核病監(jiān)測(cè)方案》要求，各區(qū)動(dòng)物疫病控制中心奶牛結(jié)核病專職檢疫隊(duì)伍，在上、下半年對(duì)奶牛場(chǎng)所有適齡奶牛，采用TST 進(jìn)行結(jié)核病檢測(cè)，對(duì)初次檢測(cè)陽(yáng)性或可疑的奶牛，間隔42 d后再用牛型和禽型PPD，在頸部?jī)蓚?cè)或同側(cè)相距12～15 cm 的兩個(gè)部位進(jìn)行SICTT 確診?！秳?dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)》（GB/T18645—2002）和《牛結(jié)核病防治技術(shù)規(guī)范》規(guī)定，犢牛出生20 d 后即可用TST 進(jìn)行檢疫[8]。但上海市個(gè)別奶牛場(chǎng)將犢牛首次結(jié)核病檢測(cè)日齡推遲至90 日齡甚至更晚，導(dǎo)致初篩時(shí)出現(xiàn)TST 疑似反應(yīng)率偏高的現(xiàn)象。

本研究選擇奶牛群數(shù)量較多、犢牛結(jié)核病首次檢測(cè)日齡為180 d、初篩疑似反應(yīng)比較典型的某大型奶牛場(chǎng)作為研究對(duì)象，通過檢測(cè)結(jié)果分析，全面了解TST 初篩疑似反應(yīng)奶牛的個(gè)體特征和風(fēng)險(xiǎn)因素。

1 材料和方法

1.1 檢測(cè)方法

按照《動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)》（GB/T18645—2002）[8]，采用國(guó)產(chǎn)牛型PPD TST 試驗(yàn)，對(duì)某奶牛場(chǎng)6 月齡以上所有的適齡奶牛進(jìn)行結(jié)核病檢測(cè)。

1.2 主要試劑

牛型PPD，購(gòu)自哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，批號(hào)為201008。

1.3 結(jié)果判定

1.3.1 陽(yáng)性反應(yīng) 皮厚差≥4.0 mm，局部有明顯的炎性反應(yīng)。

1.3.2 疑似反應(yīng) 2.0 mm ≤皮厚差＜4.0 mm 或皮厚差≥4.0 mm，但局部炎性反應(yīng)不明顯。

1.3.3 陰性反應(yīng) 皮厚差＜2.0 mm，無(wú)炎性反應(yīng)。

1.4 奶牛個(gè)體特征調(diào)查

記錄所有TST 檢測(cè)奶牛的年齡、胎次、配種情況、懷孕情況、奶產(chǎn)量、是否自繁自養(yǎng)等個(gè)體特征，以TST 結(jié)果為因變量，奶牛個(gè)體特征為自變量，用Epi infoTM7 軟件進(jìn)行單因素分析。

2 結(jié)果

2.1 TST 疑似反應(yīng)率

對(duì)2 031 頭適齡奶牛進(jìn)行TST 初篩，共有320頭出現(xiàn)疑似反應(yīng)，疑似反應(yīng)率為15.76%。其中：2.0 mm ≤皮厚差＜4.0 mm 的奶牛194 頭，局部炎性反應(yīng)不明顯（局部腫脹為硬結(jié)塊，非彌散性軟腫塊），皮厚差≥4.0 mm 的奶牛126 頭。所有疑似反應(yīng)牛于當(dāng)日全部轉(zhuǎn)入隔離棚，同步采集所有TST疑似反應(yīng)奶牛的全血樣品進(jìn)行IFN-γ-ELISA 試驗(yàn)，結(jié)果均為陰性。間隔42 d 后，對(duì)320 頭TST 疑似反應(yīng)奶牛進(jìn)行牛型和禽型PPD SICTT 試驗(yàn)，全部排除結(jié)核病陽(yáng)性反應(yīng)。

2.2 TST 疑似反應(yīng)奶牛個(gè)體特征

2.2.1 年齡 該奶牛場(chǎng)此次TST 檢測(cè)的最小適齡奶牛為0.5 歲。以0.5 歲為間隔進(jìn)行年齡分段，將各年齡段奶牛TST 檢測(cè)結(jié)果按所占比例進(jìn)行加權(quán)平均，得到標(biāo)準(zhǔn)化疑似反應(yīng)率。檢測(cè)結(jié)果顯示，該奶牛場(chǎng)TST 疑似反應(yīng)主要集中在2 歲以下奶牛，其中1.5～2 歲奶牛疑似反應(yīng)率最高，標(biāo)準(zhǔn)化后疑似反應(yīng)率為4.83%，隨著年齡增長(zhǎng)，TST 疑似反應(yīng)率呈下降趨勢(shì)。詳細(xì)檢測(cè)結(jié)果見表1。

2.2.2 泌乳量 該奶牛場(chǎng)主要泌乳年齡段為2～6歲，占總泌乳奶牛數(shù)的88.6%，泌乳量集中在30～45 kg/d，占泌乳奶牛數(shù)的62.3%。以10 kg/d 為間隔進(jìn)行泌乳量分段，將各泌乳量段奶牛TST 結(jié)果按所占比例進(jìn)行加權(quán)平均，得到標(biāo)準(zhǔn)化疑似反應(yīng)率。檢測(cè)結(jié)果顯示，該奶牛場(chǎng)出現(xiàn)TST 疑似反應(yīng)的主要集中在未泌乳奶牛和干奶牛，隨著泌乳量的增加，疑似反應(yīng)率呈下降趨勢(shì)。詳細(xì)檢測(cè)結(jié)果見表2。

2.2.3 位置 該奶牛場(chǎng)2 031 頭TST 檢測(cè)奶牛分布于22個(gè)棚舍，每個(gè)棚舍均有疑似反應(yīng)奶牛，且呈現(xiàn)一定的聚集性，主要集中在青牛舍。各棚舍奶牛TST 疑似反應(yīng)率和標(biāo)準(zhǔn)化率見表3。

2.2.4 胎次 該奶牛場(chǎng)TST 檢測(cè)奶牛的胎次分布在0～10 胎。將各胎次TST 結(jié)果按所占比例進(jìn)行加權(quán)平均，得到標(biāo)準(zhǔn)化疑似反應(yīng)率。檢測(cè)結(jié)果顯示，該奶牛場(chǎng)TST 疑似反應(yīng)集中在0～2 胎次的奶牛，其中0 胎次奶牛疑似反應(yīng)率最高，標(biāo)準(zhǔn)化后的疑似反應(yīng)率為10.98%，隨著胎次增加，疑似反應(yīng)率呈下降趨勢(shì)。詳細(xì)檢測(cè)結(jié)果見表4。

表1 上海市某奶牛場(chǎng)各年齡段奶牛TST 疑似反應(yīng)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

表2 上海市某奶牛場(chǎng)各泌乳量段奶牛TST 疑似反應(yīng)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

表3 上海市某奶牛場(chǎng)各棚舍奶牛TST 疑似反應(yīng)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

表4 上海市某奶牛場(chǎng)各胎次奶牛TST 疑似反應(yīng)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.3 單因素分析

對(duì)問卷調(diào)查收集的自繁自養(yǎng)、配種、懷孕和泌乳等4個(gè)二分類變量進(jìn)行單因素分析，計(jì)算自繁自養(yǎng)、配種等風(fēng)險(xiǎn)因素的OR 值。單因素分析結(jié)果顯示，自繁自養(yǎng)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，未配種、未懷孕和未泌乳（或干奶期）奶牛出現(xiàn)TST 疑似反應(yīng)的概率分別是配種、懷孕和泌乳奶牛的2.02、1.37 和3.72 倍，因此導(dǎo)致奶牛場(chǎng)出現(xiàn)TST 疑似反應(yīng)的危害性風(fēng)險(xiǎn)因素是未配種、未懷孕、未泌乳或干奶期。單因素分析結(jié)果見表5。

表5 上海市某奶牛場(chǎng)TST 疑似反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)因素單變量分析結(jié)果

3 討論

上海市奶牛養(yǎng)殖全部實(shí)現(xiàn)規(guī)模化飼養(yǎng)，從1983年開始實(shí)施奶牛結(jié)核病和布魯氏菌病（以下簡(jiǎn)稱“兩病”）健康化改造工程，通過落實(shí)經(jīng)費(fèi)保障，狠抓奶?！皟刹　睂Ｂ殭z疫隊(duì)伍建設(shè)，建立奶牛商業(yè)保險(xiǎn)機(jī)制，全面開展一年兩次的全群監(jiān)測(cè)，及時(shí)淘汰和無(wú)害化處置陽(yáng)性牛只，構(gòu)建奶?！皟刹　标幮苑忾]群，促進(jìn)了健康牛群的逐年壯大。特級(jí)奶牛場(chǎng)制度的建立，將牧場(chǎng)管理和“兩病”防控與經(jīng)濟(jì)效益掛鉤，與市發(fā)改委和行業(yè)協(xié)會(huì)建立奶價(jià)聯(lián)動(dòng)機(jī)制，進(jìn)一步加快了奶牛場(chǎng)健康化步伐。通過30 余年的不懈努力，上海市奶?！皟刹　狈揽厝〉昧孙@著成效[9]。近年來(lái)，隨著全國(guó)奶牛飼養(yǎng)總量增加，活?？缡∈姓{(diào)運(yùn)日益頻繁，導(dǎo)致奶牛結(jié)核病陽(yáng)性率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[10]。為加強(qiáng)奶牛結(jié)核病防控和凈化，防止奶牛結(jié)核病傳入和傳播，上海市進(jìn)一步加強(qiáng)了奶牛調(diào)運(yùn)監(jiān)管，對(duì)奶牛的出生、調(diào)運(yùn)、銷售、淘汰、死亡等過程進(jìn)行全周期點(diǎn)對(duì)點(diǎn)監(jiān)控，確保每頭奶牛的精確定位和管理[11]，以維持來(lái)之不易的防控成果。

TST 是OIE 推薦的國(guó)際貿(mào)易奶牛結(jié)核病檢疫方法，是我國(guó)國(guó)標(biāo)規(guī)定的方法，也是上海市實(shí)施奶牛結(jié)核病健康化改造工程過程中開展一年兩次全群監(jiān)測(cè)的檢疫方法。但其檢測(cè)結(jié)果易受病原感染、試劑質(zhì)量及劑量、人為誤差和奶牛個(gè)體差異等因素影響[12]，從而降低該方法的敏感性和特異性。SICTT是TST 的改進(jìn)方法，可有效排除因感染禽型分支桿菌引起的假陽(yáng)性，從而提高特異性[13]。鑒于上海市奶牛結(jié)核病防控和凈化的良好基礎(chǔ)，自2013年以來(lái)，上海市在奶牛結(jié)核病監(jiān)測(cè)方案中調(diào)整為采用SICTT 進(jìn)行確診。

近年來(lái)，上海市部分奶牛場(chǎng)進(jìn)行TST 初篩時(shí)，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)疑似反應(yīng)比例較高的主要為2 歲以下青年牛。分析原因：一是青年牛結(jié)核病首次檢測(cè)日齡過于滯后，由于犢牛散放，難以保定的緣故，大部分奶牛場(chǎng)犢牛開展結(jié)核病首次檢測(cè)的日齡為90 d，有的甚至推遲至180 d 才進(jìn)行首次結(jié)核病檢疫，從而導(dǎo)致青年牛PPD 脫敏時(shí)間不夠，出現(xiàn)檢測(cè)時(shí)應(yīng)答反應(yīng)較強(qiáng)；二是可能與國(guó)產(chǎn)PPD 試劑質(zhì)量有關(guān)[14]。在今后的奶牛結(jié)核病防控過程中，需結(jié)合實(shí)際的可操作性和檢測(cè)科學(xué)性，將犢牛結(jié)核病首次檢測(cè)的日齡提前至90 日齡以內(nèi)。同時(shí)，對(duì)TST初篩出現(xiàn)疑似反應(yīng)的奶牛立即隔離，采用IFN-γ-ELISA 和SICTT 平行檢測(cè)策略（兩者中出現(xiàn)任意陽(yáng)性結(jié)果即判為陽(yáng)性反應(yīng)），提高檢測(cè)方法的敏感性，以達(dá)到減少假陰性的目的[7]。