上海市偽狂犬病病毒相關(guān)毒力基因分子變異分析

（上海市動物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103）

偽狂犬病病 毒（pseudorabies virus，PRV）又名豬皰疹病毒I 型（porcine herpesvirus type I），屬于皰疹病毒科（Herpesviridae）甲亞科（Alphaerpesvirinae）水痘病毒屬（Varicellovirus），為線狀雙股DNA 病毒，全長約150 kb，含77個讀碼框，平均G+C 含量高達73.6%。PRV 由獨特的長區(qū)段（unique long region，UL）和短區(qū)段（unique short region，US）及位于US 兩側(cè)的末端重復(fù)序列（TR）和內(nèi)部重復(fù)序列（IR）所組成，即形成了UL-IR-US-IR 結(jié)構(gòu)[1]。

PRV 毒力由多基因控制。與其毒力相關(guān)的蛋白可分為3 類：囊膜糖蛋白、病毒自身的酶和非必需的衣殼蛋白。糖蛋白gB 是PRV 的必需囊膜糖蛋白，位于UL27 區(qū)，全長2 745 bp，編碼914個氨基酸。gB 是重要的免疫原，能夠刺激機體產(chǎn)生補體依賴性和非依賴性中和抗體[2]。gB 在病毒增殖和感染過程中參與細胞融合過程，是病毒復(fù)制必不可少的[3]。糖蛋白gC 是PRV 的重要囊膜蛋白，位于UL44 區(qū)，全長1 464 bp，編碼488個氨基酸。盡管gC 對病毒感染是非必需的，但它可刺激機體產(chǎn)生補體非依賴性中和抗體，還能誘導(dǎo)細胞免疫[5-6]。gB、gC 糖蛋白是PRV 的主要T 細胞抗原，也是誘導(dǎo)體液免疫的重要中和抗原，與病毒釋放密切相關(guān)[7]。gD 蛋白是PRV 的必需糖蛋白，位于US6 區(qū)，全長1 209 bp，編碼402個氨基酸，具有糖蛋白固有的特征。gD 能識別細胞表面的受體，介導(dǎo)病毒與靶細胞的穩(wěn)定結(jié)合，同時能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體。gE 蛋白是PRV 的一種非必需糖蛋白，位于US 區(qū)，長1 734 bp，編碼577個氨基酸，具有典型的膜蛋白特征。gE是PRV 主要的毒力基因，能介導(dǎo)細胞的融合，并有助于PRV 向中樞神經(jīng)系統(tǒng)擴散。

本研究利用PCR 技術(shù)，對2010—2012年分離的28 株P(guān)RV 毒株的4種相關(guān)毒力基因（gB、gC、gD和gE）進行克隆、測序和相關(guān)生物學(xué)分析，旨在了解上海市PRV 主要毒力基因的分子特征及變異情況，為PRV 分子致病機制及分子流行病學(xué)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株

28 株P(guān)RV 由本中心實驗室于2010—2015年分離鑒定保存，具體信息見表1。

表1 本研究所用毒株

1.2 主要試劑

核酸提取試劑盒QIAamp MinElute Virus Spin Kit，購 自QIAGEN 公 司；PrimeSTAR HS DNA Polymerse with GC Buffer、DL 2 000 Marker、DNA膠回收試劑盒和pMD 18-T 載體，均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 引物

根據(jù)PRVgB、gC、gD和gE基因核苷酸保守序列，采用Primer 5.0 軟件設(shè)計引物（表2）。引物由上海Invitrogen 公司或上海桑尼生物科技有限公司合成。

表2 本研究所用引物

1.4 核酸提取及PCR

參照QIAGEN 公司病毒核酸提取試劑盒（QIAamp MinElute Virus Spin Kit）說明提取病毒核酸。

PCR 反應(yīng)體系 為50 μL：2×PrimeSTAR GC Buffer（Mg2+plus）25 μL，上下游引物各1 μL（20 pmol/L），dNTP Mixture 2 μL，上 述DNA 5 μL，補H2O 至50 μL。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，51～64 ℃退火1～2 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。

1.5 PCR 產(chǎn)物克隆、鑒定和序列測定

PCR 產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收后，與pMD-18T 載體連接，轉(zhuǎn)化，篩選重組質(zhì)粒；重組質(zhì)粒用PCR 鑒定，每個樣品挑取3個陽性質(zhì)粒，交由上海Invitrogen 公司進行序列測定。

1.6 序列拼接和分析

應(yīng)用Lasergene V7.1 DNAstar 軟件進行序列拼接和氨基酸序列推導(dǎo)，并用Mega 5.0 軟件繪制gB、gC、gD和gE基因系統(tǒng)發(fā)育基因進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 gB 基因進化分析

2.1.1gB基因擴增 用gB基因引物進行PCR 擴增，擴增出大小約2.8 kb 的條帶，與預(yù)期片段大小相符（圖1）。

圖1 PRV gB 基因擴增產(chǎn)物

2.1.2gB基因序列分析 測序結(jié)果顯示，上海市2010—2015年分離毒株gB基因序列全長為2.8 kb，編碼914個氨基酸殘基組成的多肽。它們之間的核苷酸同源性和氨基酸同源性分別為99.6%～100% 和98.7%～100%，與GeneBank 上 國內(nèi)外其他18 株的核苷酸同源性和氨基酸同源性分別為98.2%～100%和96.0%～100%（圖2）。與國內(nèi)Ea 毒株的氨基酸序列相比，存在6個位點的氨基酸一致性替換，即T82A、G393D、R451K、H560K、P735L、T737A。應(yīng)用Mega 5.0 軟 件中的Clustal W 方法，將測出的10 株P(guān)RVgB基因核苷酸序列與GenBank 上已登錄的國內(nèi)外其他18 株P(guān)RV 相應(yīng)序列進行遺傳距離分析，利用Neighbor-Joining 方法繪制了系統(tǒng)發(fā)育進化關(guān)系（圖3）?；趃B基因進化樹，PRV 毒株可劃分為2個基因型Group1 和Group2。上海市2010年分離毒株與2012年以后分離毒株處于不同的進化分支，均與國內(nèi)Ea 株親緣關(guān)系較近，屬于同一大進化分支（Group2），而與以歐美洲毒株為代表的Group1親緣關(guān)系較遠。

圖2 PRV gB 基因核苷酸序列比較

圖3 PRV gB 基因進化樹分析結(jié)果

2.2 gC 基因進化分析

2.2.1gC基因擴增 用gC基因引物進行PCR 擴增，擴增出大小約1.4 kb 的條帶，與預(yù)期片段大小相符（圖4）。

圖4 PRV gC 基因擴增產(chǎn)物

2.2.2gC基因序列分析 測序結(jié)果顯示：上海市2010—2015年分離的PRVgC基因序列全長為1 464 bp，編碼487個氨基酸殘基，氨基酸序列具有典型的I 型囊膜糖蛋白特征。它們之間的核苷酸同源性和氨基酸同源性分別為94.9%～100%和99.2%～100%，與GeneBank 上國內(nèi)外其他18 株的核苷酸同源性和氨基酸同源性分別為98.2%～100%和96.0%～100%。在對應(yīng)Ea 株gC編碼序列第186～211 位，上海市2010—2015年P(guān)RV 分離株與Ea 株多插入了21個核苷酸，并呈集中分布（圖5）。應(yīng)用Mega 5.0 軟件中的Clustal W 方法，將測出的14 株P(guān)RVgC基因核苷酸序列與GenBank 上已登錄的國內(nèi)外其他72 株P(guān)RV 相應(yīng)序列進行遺傳距離分析，利用Neighbor-Joining 方法繪制了系統(tǒng)發(fā)育進化關(guān)系（圖6）。基于gC基因進化樹，PRV 毒株可劃分為2個基因型Group1 和Group2。上海市2010年分離株與2012年以后分離株處于不同的進化分支，均與國內(nèi)Ea 株親緣關(guān)系較近，屬于同一大進化分支（Group2），而與以歐美洲毒株為代表的Group1 親緣關(guān)系較遠。

2.3 gD 基因進化分析

2.3.1gD基因擴增 用gD基因引物進行PCR擴增，擴增出大小約1.5 kb 的條帶，與預(yù)期片段大小相符（圖7）。

圖5 PRV gC 基因核苷酸序列比較

圖6 PRV gC 基因進化樹分析結(jié)果

圖7 PRV gD 基因擴增產(chǎn)物

圖8 PRV gD 基因核苷酸比對結(jié)果

2.3.2gD基因序列分析 測序結(jié)果（圖8）顯示：上海市2010年分離的3 株P(guān)RVgD基因序列全長為1 203 bp，編碼400個氨基酸殘基，而2012—2015年分離的12 株P(guān)RVgD基因序列全長為1 209 bp，編碼402個氨基酸殘基。相比，存在6個堿基（2個氨基酸）的缺失。這是由于gD基因802～837 nt處有1個C（A）GGCCC 重復(fù)高變區(qū)，對應(yīng)的是267～279 位氨基酸Arg～Pro 的重復(fù)高變區(qū)。正是這一重復(fù)高變區(qū)的堿基缺失或插入，使得PRV-gD 的ORF 在1 194～1 215 nt 間變化，gD 前體的氨基酸殘基為398～404個不等。2010—2015年分離的15 株P(guān)RV 的gD基因核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列同源性分別為99.7%～100%和99.2%～100%；與其他32株P(guān)RVgD基因核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列同源性分別為98.7%～100%和97.2%～100%。應(yīng)用Mega 5.0 軟件中的Clustal W 方法，將測出的15 株P(guān)RVgD基因核苷酸序列與GenBank 上已登錄的國內(nèi)外其他32 株P(guān)RV 相應(yīng)序列進行遺傳距離分析，利用Neighbor-Joining 方法繪制了系統(tǒng)發(fā)育進化關(guān)系。由圖9 可知，PRV 毒株可以分為三大群（Group1、Group2 和Group3）。2010—2015年分離的15株P(guān)RV 與Min-A 株、Ea 株、FZ 株、SA215 株和LA 株親緣關(guān)系最近，均屬于Group3，而與以Bartha 株為代表的Group1 群和以Becker 為代表的Group2 群親緣關(guān)系最遠。

圖9 PRV gD 基因進化樹分析結(jié)果

2.4 gE 基因進化分析

2.4.1gE基因擴增 用gE基因引物進行PCR 擴增，擴增出大小約1.0 kb 的條帶，與預(yù)期片段大小相符（圖10）。

圖10 PRV gE 基因擴增產(chǎn)物

2.4.2gE基因序列分析 用DNAstar V7.1 軟件，將測出的26 株gE基因部分序列及推導(dǎo)的氨基酸序列與國內(nèi)外39 株P(guān)RV 分離株序列進行同源性比較分析。結(jié)果顯示：2010—2015年分離的26 株P(guān)RVgE基因核苷酸及推導(dǎo)氨基酸序列的同源性分別為99.5%～100%和99.0%～100%；與其他39 株P(guān)RV 的gE基因核苷酸及推導(dǎo)氨基酸序列的同源性分別為97.2%～100%和95.2%～100%，最低為NiA3 株。與國內(nèi)Ea 毒株相比，2010—2015年分離的26 株P(guān)RV 存在多處堿基突變（圖11）。應(yīng)用Mega 5.0 軟件中的Clustal W 方法，將測出的26 株P(guān)RVgE基因核苷酸序列與GenBank 上已登錄的國內(nèi)外其他39 株P(guān)RV 相應(yīng)序列進行遺傳距離分析，利用Neighbor-Joining 方法繪制了系統(tǒng)發(fā)育進化關(guān)系。由圖12 可知，PRV 毒株可以分為兩大群（Group1 和Group2），Group1 又分為兩個亞群（Subgroup1.1 和Subgroup1.2），Group2 分為5個亞 群（Subgroup2.1、Subgroup2.2、Subgroup2.3、Subgroup2.4 和Subgroup2.5）。2010—2015年 分離的26 株P(guān)RV 均在Group2 中，其中2010年分離的4 株分布在Subgroup2.4 中，與Ea 株、P-PrV 株和Yangsan 株親緣關(guān)系最近；2012—2015年分離的22 株均在Subgroup2.5 中，與國內(nèi)2012年以后分離的流行毒株親緣關(guān)系最近；均與以Min-A 株為代表的國內(nèi)和東南亞分離株屬同一大的進化分支（Group2），遺傳關(guān)系相對較近；與國外歐美分離株Becker 株、Kaplan 株和NiA3 株分屬不同的進化分支（Group1），親緣關(guān)系較遠。

圖11 PRV gE 基因核苷酸比對結(jié)果

圖12 PRV gE 基因進化樹分析結(jié)果

3 分析與討論

3.1 PRV 相關(guān)毒力基因的PCR 擴增

PRV 基因組DNA 大小為150 kb，由于G+C含量高達73%以上，所以導(dǎo)致整個基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜。局部DNA 復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)經(jīng)常影響PCR 的順利擴增，同時對測序反應(yīng)也提出了更高的要求。本研究開始使用寶生物L(fēng)ATaqE，結(jié)果未能很好地擴增出PRV 基因片段，隨后提高退火溫度，采用了寶生物PrimeSTAR HS DNA E。此酶具有高保真和高擴增效率，能直接高保真地擴增出高G+C 含量的PRV功能基因片段。建立的高保真擴增高G+C 含量基因的方法，對PRV 在構(gòu)建重組病毒和克隆其余功能基因片段的研究方面提供了借鑒。此方法，也為擴增高G+C含量的基因片段提供一個不錯的選擇。

3.2 PRV 毒力相關(guān)基因分析

本研究對上海市2010—2015年分離的PRV 流行毒株毒力相關(guān)基因gB、gC、gD和gE進行了克隆和測序。測序分析顯示，PRV 不同毒株間gB、gC、gD和gE基因在核苷酸和氨基酸水平的同源性均較高，但在高度保守的基礎(chǔ)上，仍存在一些差異，部分差異具有特征性，如gB基因的集中突變區(qū)和gC編碼序列186～211 bp 處集中多插入了21個核苷酸序列等。在皰疹病毒中，gB 蛋白屬于最保守的糖蛋白之一。該糖蛋白不僅可誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的中和抗體，而且對病毒的感染過程是必須的。PRV gB 蛋白的主要抗原表位已比較清楚。gB 蛋白分別在59～129、214～289、507～734 aa 處存在優(yōu)勢抗原位點[8]；氨基酸變異位點主要集中在50～100氨基酸區(qū)段。本研究分析出的集中突變區(qū)正好位于此區(qū)域內(nèi)。

PRVgD基因在803～837 bp 處有一重復(fù)高變區(qū)。在目前已發(fā)表的毒株gD基因序列中，只有Ea 株的gD基因最長，為1 215 bp，編碼405個氨基酸的gD 前體；Rice 株與NiA3 株在這相應(yīng)區(qū)域缺失6個核苷酸（AGCCCC），均為1 209 bp，編碼402個氨基酸的gD 前體；LA 株與Kaplan株的這重復(fù)高變區(qū)均在相應(yīng)區(qū)域缺失12個核苷酸（AGGCCCAGCCCC），均為1 203 bp，編碼400個氨基酸的gD 前體；Hubei 株在這重復(fù)高變區(qū)有2 處缺失，在803～815 位缺失12個核苷酸（GGCCCAGCCCCA），在831～817 位缺失6個核苷酸（AGCCCC），共計缺失18個核苷酸，其gD基因長僅為1 197 bp，編碼398個氨基酸的gD前體[9]。而上海市2010年分離的3 株P(guān)RVgD基因序列全長均為1 203 bp，編碼400個氨基酸殘基，而2012—2015年分離的12 株P(guān)RVgD基因序列全長均為1 209 bp，編碼402個氨基酸殘基。

gE基因在PRV 基因組中并不是最保守的基因。但PRV 本身遺傳變異性不大，這不僅體現(xiàn)在PRV 只有1個血清型，而且也體現(xiàn)在基因水平上。gE基因的高同源性在一定程度上也體現(xiàn)了PRV 基因組的保守性。研究發(fā)現(xiàn)，堿基序列在1 037～1 407間的同源性高達100%，是gE基因中最保守的序列，編碼的429～453 位氨基酸是疏水的膜錨定片段[10]。這個功能可能對于gE 蛋白非常重要。

3.3 PRV 毒力相關(guān)基因進化分析

基于gB、gC、gD和gE基因的進化樹分析顯示：歐美分離株可歸為一大分支（Group 1），為基因I 型；上海市2010—2015年分離株，中國分離株與韓國分離株可歸為另一個大支（Group 2），為基因II 型；2010年上海市分離毒株與以Min-A株和Ea 株為代表的毒株親緣關(guān)系較近，處于同一小的分支；2012—2015年上海市分離毒株與2012年國內(nèi)分離的流行毒株親緣關(guān)系較近，與以Min-A株和Ea 株為代表的毒株親緣關(guān)系較遠，處于另一分支。由此可見，2012年后分離毒株的幾個相關(guān)毒力基因均發(fā)生了變異，出現(xiàn)了PRV 變異株，從而導(dǎo)致了2013年偽狂犬病疫情的出現(xiàn)。