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    16S與gyrB基因聯(lián)合建樹快速鑒定一株解淀粉芽胞桿菌

    2020-07-06 13:25:56傅奇林俊杰馮亞棟肖玉娟
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2020年12期
    關(guān)鍵詞:建樹芽胞進(jìn)化樹

    傅奇,林俊杰,馮亞棟,肖玉娟

    (廈門華廈學(xué)院,福建 廈門,361024)

    解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)是芽孢桿菌屬的一種具有重要研究價(jià)值的菌種,在發(fā)酵工業(yè)中可用于生產(chǎn)淀粉酶[1]、蛋白酶[2-3]、纖維素酶[4]等多種工業(yè)用酶,此外還可以表達(dá)幾丁質(zhì)酶[5]、伊枯草菌素[6-7]等具有重要研究價(jià)值的生物活性物質(zhì)。但由于芽胞桿菌屬中各菌種間保守序列高度相似,無法單獨(dú)依靠常用的16S rDNA/RNA測序來準(zhǔn)確定位到種, 通常需要結(jié)合生理生化鑒定[8-9],或者其他序列,如5′端16S-23S ITS核苷酸序列[10]、gyrB基因[11]、gyrA[12]甚至全基因序列[13-14]進(jìn)行分析。CHEN等[15]、XU等[16]在篩選解淀粉芽胞桿菌時(shí),使用16S與gyrA基因分別建樹的方法進(jìn)行鑒定;LIM等[17]采用16S序列比對結(jié)合API系統(tǒng)鑒定1株產(chǎn)廣譜細(xì)菌素的解淀粉芽胞桿菌;NEL等[18]采用16S rDNA擴(kuò)增片段限制性內(nèi)切酶分析與rpoB基因建樹結(jié)合的方法,區(qū)分并鑒定南非制糖廠中篩選得到的解淀粉芽胞桿菌與枯草芽胞桿菌。鑒定方法較為繁瑣,目前還沒有通用、簡便、快速的鑒定方法。

    gyrB基因編碼DNA促旋酶的B亞單位,在細(xì)菌中廣泛存在,序列相對保守,但進(jìn)化速度快于16S,目前在細(xì)菌鑒定中的使用逐漸增加[19],積累了較為豐富的比對信息,但單獨(dú)使用時(shí)部分芽胞桿菌也難以準(zhǔn)確定位,而16S與gyrB序列分別比對建樹的方法容易出現(xiàn)進(jìn)化樹結(jié)構(gòu)沖突,干擾定位的情況。利用16S與gyrB基因聯(lián)合建樹,以較少的序列數(shù)和進(jìn)化樹數(shù)實(shí)現(xiàn)對篩選菌株快速鑒定的方法,可提高數(shù)據(jù)的利用率,減少數(shù)據(jù)沖突,為芽胞桿菌種群的分子生物學(xué)鑒定方法開發(fā)提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1.1 土壤樣本

    土壤樣本,采集自廈門同安國家農(nóng)業(yè)科技園區(qū)竹壩農(nóng)場。

    1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

    營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,廣東環(huán)凱生物科技有限公司;苯丙氨酸脫氨酶鑒定管、MR-VP鑒定管、SIM培養(yǎng)基(用于硫化氫和吲哚試驗(yàn))等,青島海博生物科技有限公司。

    細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)試劑,生工生物工程(上海)股份有限公司生產(chǎn);16S通用引物27F/1492R、gyrB擴(kuò)增引物UP-1/UP-2r、gyrB測序引物UP-1S/UP-2Sr[20],生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

    1.1.3 儀器與設(shè)備

    Aeris-bg096PCR儀,新加坡ESCO公司;HE99核酸電泳儀,美國GE公司;211B搖床,上海蘇坤公司;LRH-250生化培養(yǎng)箱,上海一恒公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 樣本采集

    于農(nóng)場蔬菜種植區(qū)取土壤25 g加入225 mL蛋白胨生理鹽水稀釋均質(zhì)后稀釋涂布營養(yǎng)瓊脂平板,30 ℃培養(yǎng)24 h,取單菌落進(jìn)行純化。

    1.2.2 16S與gyrB序列提取

    用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒,提取菌株的總DNA;分別用16S與gyrB引物擴(kuò)增,所得PCR產(chǎn)物電泳純化后,送由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

    16S擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s,65 ℃退火40 s,72 ℃延伸90 s,共35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。

    gyrB擴(kuò)增條件[20]:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性1 min,60 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,共35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。

    1.2.3 16S與gyrB序列比對與進(jìn)化分析

    將測序結(jié)果在Genbank進(jìn)行比對。為保障數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性,取與受試菌gyrB序列相似度較高的前1 000個(gè)序列中,來源于各菌種保藏中心菌株的序列進(jìn)行比對,包括ATCC、BCRC、CGMCC、CIP、CECT等。下載相似菌株的16S與gyrB序列、分別用BioEdit[21]和Clustal X[22]進(jìn)行比對和編輯,取有效區(qū)間,分別試驗(yàn)單獨(dú)使用16S序列、單獨(dú)使用gyrB序列和使用16S與gyrB線形拼接序列建樹[23],采用最大簡約算法,用Paup*4.0構(gòu)建進(jìn)化樹[24-25],選擇大腸桿菌ATCC 25922[26]作為外群。

    1.2.4 生理生化驗(yàn)證

    參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[27]進(jìn)行驗(yàn)證。

    1.2.5 聯(lián)合建樹方法適用性分析

    為分析16S與gyrB基因聯(lián)合建樹的方法是否適用于其他解淀粉芽胞桿菌的鑒定,于Genbank下載16S與gyrB基因均可得的解淀粉芽胞桿菌序列,按照上述方法進(jìn)行序列拼接。選擇《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[27]中芽胞桿菌屬模式菌株,于Genbak和EZBiocloud下載16S和gyrB序列,選擇大腸桿菌ATCC 25922作為外群,構(gòu)建進(jìn)化樹。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 菌株分離純化

    從土壤中篩選得到1株革蘭氏陽性桿菌,產(chǎn)芽胞,菌落白色、干燥、表面粗糙,編號為HX2016004。

    2.2 16S與gyrB基因測序

    PCR擴(kuò)增所得16S序列有效區(qū)共1 436 bp,gyrB序列有效區(qū)共1 207 bp。

    2.3 序列比對與進(jìn)化樹構(gòu)建

    16S序列比對結(jié)果中,高相似度菌株過多,且多數(shù)菌株無法獲得更多的遺傳標(biāo)記序列;而gyrB序列比對結(jié)果中,多數(shù)菌株同時(shí)可獲取16S序列,因此,以gyrB相似菌株作為建樹群,下載16S與gyrB基因序列,如表1所示,比較分別使用16S、gyrB和16S與gyrB線形拼接序列建樹結(jié)果。

    16S比對后去除頭尾不整齊片段,保留中心區(qū)域1 467 bp(含gap);gyrB比對后去除頭尾不整齊片段,保留中心區(qū)域1 175 bp(含gap)。構(gòu)建進(jìn)化樹如圖1所示,A樹基于16S序列構(gòu)建(圖1-a),b樹基于gyrB序列構(gòu)建(圖1-b),c樹基于16S與gyrB拼接序列構(gòu)建(圖1-c),計(jì)算次數(shù)為1 000,參數(shù)如表2所示。

    注:*表示Bacillus_velezensis為Bacillusamyloliquefaciens的異名[28-29]

    表2 基于16S與gyrB序列的進(jìn)化樹參數(shù)表Table 2 Parameters of phylogenetic trees based on the combined sequences of 16S and gyrB

    由圖1可知,僅使用16S序列構(gòu)建的進(jìn)化樹a分枝自展值低,無法準(zhǔn)確定位HX2016004菌株的族群;僅使用gyrB序列構(gòu)建的進(jìn)化樹b較a整體分枝自展值高,但一致性指數(shù)(consistency index,CI)相對較低,且與a樹存在較大的結(jié)構(gòu)沖突;使用16S與gyrB拼接序列構(gòu)建的進(jìn)化樹c結(jié)構(gòu)與b一致,表明建樹群中16S的差異較小,不足以影響分類結(jié)構(gòu),HX2016004菌株與解淀粉桿菌聚合在一枝,自展值為94,表明該菌株為解淀粉芽胞桿菌可能性高。c樹中BacillussubtilisATCC 13952的進(jìn)化關(guān)系存在疑問,有待進(jìn)一步分析,但不影響HX2016004菌株的鑒定。

    a-基于16S的進(jìn)化樹;b-gyrB基因的進(jìn)化樹; c-基于16S與gyrB基因的進(jìn)化樹
    圖1 HX2016004菌株基于16S與gyrB序列的進(jìn)化樹
    Fig.1 Phylogenetic trees about HX2016004 based on sequences of 16S andgyrB

    2.4 生理生化驗(yàn)證

    菌株HX2016004生理生化特征如表3所示,與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》中的解淀粉芽胞桿菌特征吻合,與進(jìn)化分析結(jié)果一致,命名為BacillusamyloliquefaciensHX2016004。

    表3 菌株HX2016004生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of HX2016004

    注:+代表革蘭氏染色呈陽性;-代表革蘭氏染色呈陰性

    2.5 聯(lián)合建樹方法適用性

    Genbank中16S與gyrB序列同時(shí)可得,且鑒定結(jié)果較為可靠的解淀粉芽胞桿菌菌株共有37株,另選擇親緣關(guān)系較近的芽胞桿菌屬其他菌種模式菌株16株,拼接16S與gyrB基因序列后構(gòu)建進(jìn)化樹如圖2所示。其中所有的解淀粉芽胞桿菌很好的聚合在一簇,與親緣關(guān)系相近菌種Bacillussubtilis、Bacilluslicheniformis、Bacilluspumilus具有較高的種間自展值,分類結(jié)構(gòu)可靠。也就是說,如這37株菌中的任意1株菌種還未鑒定的情況下,利用該方法建樹時(shí)均與其他36株解淀粉芽胞桿菌聚合在1枝,可準(zhǔn)確鑒定為解淀粉芽胞桿菌。表明16S與gyrB基因聯(lián)合建樹的方法適用于已知的37株解淀粉芽胞桿菌鑒定,可以預(yù)測該方法在解淀粉芽胞桿菌鑒定中具有普適性。

    圖2 Genbank已知菌株基于16S與gyrB序列的進(jìn)化樹
    Fig.2 Phylogenetic tree based on sequences of 16S andgyrBin Genbank

    3 結(jié)論

    利用16S與gyrB基因聯(lián)合建樹的方法,課題組快速將1株從土壤中篩選得到的芽胞桿菌HX2016004準(zhǔn)確鑒定為解淀粉芽胞桿菌。該方法中使用的引物均為通用引物,只需要1次擴(kuò)增即可得到16S與gyrB基因序列,測序量小,時(shí)間短,數(shù)據(jù)利用率高;與多基因分別建樹的方法相比,可避免進(jìn)化樹結(jié)構(gòu)之間的沖突和數(shù)據(jù)紊亂,提高了進(jìn)化樹準(zhǔn)確性,適用于16S序列高度相似的菌群鑒定。經(jīng)驗(yàn)證,該方法在解淀粉芽胞桿菌的鑒定中具有較普遍的適用性,課題組下一步將繼續(xù)研究該方法在其他菌群鑒別中的有效性。

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