• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    16S與gyrB基因聯(lián)合建樹快速鑒定一株解淀粉芽胞桿菌

    2020-07-06 13:25:56傅奇林俊杰馮亞棟肖玉娟
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2020年12期
    關(guān)鍵詞:建樹芽胞進(jìn)化樹

    傅奇,林俊杰,馮亞棟,肖玉娟

    (廈門華廈學(xué)院,福建 廈門,361024)

    解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)是芽孢桿菌屬的一種具有重要研究價(jià)值的菌種,在發(fā)酵工業(yè)中可用于生產(chǎn)淀粉酶[1]、蛋白酶[2-3]、纖維素酶[4]等多種工業(yè)用酶,此外還可以表達(dá)幾丁質(zhì)酶[5]、伊枯草菌素[6-7]等具有重要研究價(jià)值的生物活性物質(zhì)。但由于芽胞桿菌屬中各菌種間保守序列高度相似,無法單獨(dú)依靠常用的16S rDNA/RNA測序來準(zhǔn)確定位到種, 通常需要結(jié)合生理生化鑒定[8-9],或者其他序列,如5′端16S-23S ITS核苷酸序列[10]、gyrB基因[11]、gyrA[12]甚至全基因序列[13-14]進(jìn)行分析。CHEN等[15]、XU等[16]在篩選解淀粉芽胞桿菌時(shí),使用16S與gyrA基因分別建樹的方法進(jìn)行鑒定;LIM等[17]采用16S序列比對結(jié)合API系統(tǒng)鑒定1株產(chǎn)廣譜細(xì)菌素的解淀粉芽胞桿菌;NEL等[18]采用16S rDNA擴(kuò)增片段限制性內(nèi)切酶分析與rpoB基因建樹結(jié)合的方法,區(qū)分并鑒定南非制糖廠中篩選得到的解淀粉芽胞桿菌與枯草芽胞桿菌。鑒定方法較為繁瑣,目前還沒有通用、簡便、快速的鑒定方法。

    gyrB基因編碼DNA促旋酶的B亞單位,在細(xì)菌中廣泛存在,序列相對保守,但進(jìn)化速度快于16S,目前在細(xì)菌鑒定中的使用逐漸增加[19],積累了較為豐富的比對信息,但單獨(dú)使用時(shí)部分芽胞桿菌也難以準(zhǔn)確定位,而16S與gyrB序列分別比對建樹的方法容易出現(xiàn)進(jìn)化樹結(jié)構(gòu)沖突,干擾定位的情況。利用16S與gyrB基因聯(lián)合建樹,以較少的序列數(shù)和進(jìn)化樹數(shù)實(shí)現(xiàn)對篩選菌株快速鑒定的方法,可提高數(shù)據(jù)的利用率,減少數(shù)據(jù)沖突,為芽胞桿菌種群的分子生物學(xué)鑒定方法開發(fā)提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1.1 土壤樣本

    土壤樣本,采集自廈門同安國家農(nóng)業(yè)科技園區(qū)竹壩農(nóng)場。

    1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

    營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,廣東環(huán)凱生物科技有限公司;苯丙氨酸脫氨酶鑒定管、MR-VP鑒定管、SIM培養(yǎng)基(用于硫化氫和吲哚試驗(yàn))等,青島海博生物科技有限公司。

    細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)試劑,生工生物工程(上海)股份有限公司生產(chǎn);16S通用引物27F/1492R、gyrB擴(kuò)增引物UP-1/UP-2r、gyrB測序引物UP-1S/UP-2Sr[20],生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

    1.1.3 儀器與設(shè)備

    Aeris-bg096PCR儀,新加坡ESCO公司;HE99核酸電泳儀,美國GE公司;211B搖床,上海蘇坤公司;LRH-250生化培養(yǎng)箱,上海一恒公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 樣本采集

    于農(nóng)場蔬菜種植區(qū)取土壤25 g加入225 mL蛋白胨生理鹽水稀釋均質(zhì)后稀釋涂布營養(yǎng)瓊脂平板,30 ℃培養(yǎng)24 h,取單菌落進(jìn)行純化。

    1.2.2 16S與gyrB序列提取

    用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒,提取菌株的總DNA;分別用16S與gyrB引物擴(kuò)增,所得PCR產(chǎn)物電泳純化后,送由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

    16S擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s,65 ℃退火40 s,72 ℃延伸90 s,共35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。

    gyrB擴(kuò)增條件[20]:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性1 min,60 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,共35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。

    1.2.3 16S與gyrB序列比對與進(jìn)化分析

    將測序結(jié)果在Genbank進(jìn)行比對。為保障數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性,取與受試菌gyrB序列相似度較高的前1 000個(gè)序列中,來源于各菌種保藏中心菌株的序列進(jìn)行比對,包括ATCC、BCRC、CGMCC、CIP、CECT等。下載相似菌株的16S與gyrB序列、分別用BioEdit[21]和Clustal X[22]進(jìn)行比對和編輯,取有效區(qū)間,分別試驗(yàn)單獨(dú)使用16S序列、單獨(dú)使用gyrB序列和使用16S與gyrB線形拼接序列建樹[23],采用最大簡約算法,用Paup*4.0構(gòu)建進(jìn)化樹[24-25],選擇大腸桿菌ATCC 25922[26]作為外群。

    1.2.4 生理生化驗(yàn)證

    參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[27]進(jìn)行驗(yàn)證。

    1.2.5 聯(lián)合建樹方法適用性分析

    為分析16S與gyrB基因聯(lián)合建樹的方法是否適用于其他解淀粉芽胞桿菌的鑒定,于Genbank下載16S與gyrB基因均可得的解淀粉芽胞桿菌序列,按照上述方法進(jìn)行序列拼接。選擇《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[27]中芽胞桿菌屬模式菌株,于Genbak和EZBiocloud下載16S和gyrB序列,選擇大腸桿菌ATCC 25922作為外群,構(gòu)建進(jìn)化樹。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 菌株分離純化

    從土壤中篩選得到1株革蘭氏陽性桿菌,產(chǎn)芽胞,菌落白色、干燥、表面粗糙,編號為HX2016004。

    2.2 16S與gyrB基因測序

    PCR擴(kuò)增所得16S序列有效區(qū)共1 436 bp,gyrB序列有效區(qū)共1 207 bp。

    2.3 序列比對與進(jìn)化樹構(gòu)建

    16S序列比對結(jié)果中,高相似度菌株過多,且多數(shù)菌株無法獲得更多的遺傳標(biāo)記序列;而gyrB序列比對結(jié)果中,多數(shù)菌株同時(shí)可獲取16S序列,因此,以gyrB相似菌株作為建樹群,下載16S與gyrB基因序列,如表1所示,比較分別使用16S、gyrB和16S與gyrB線形拼接序列建樹結(jié)果。

    16S比對后去除頭尾不整齊片段,保留中心區(qū)域1 467 bp(含gap);gyrB比對后去除頭尾不整齊片段,保留中心區(qū)域1 175 bp(含gap)。構(gòu)建進(jìn)化樹如圖1所示,A樹基于16S序列構(gòu)建(圖1-a),b樹基于gyrB序列構(gòu)建(圖1-b),c樹基于16S與gyrB拼接序列構(gòu)建(圖1-c),計(jì)算次數(shù)為1 000,參數(shù)如表2所示。

    注:*表示Bacillus_velezensis為Bacillusamyloliquefaciens的異名[28-29]

    表2 基于16S與gyrB序列的進(jìn)化樹參數(shù)表Table 2 Parameters of phylogenetic trees based on the combined sequences of 16S and gyrB

    由圖1可知,僅使用16S序列構(gòu)建的進(jìn)化樹a分枝自展值低,無法準(zhǔn)確定位HX2016004菌株的族群;僅使用gyrB序列構(gòu)建的進(jìn)化樹b較a整體分枝自展值高,但一致性指數(shù)(consistency index,CI)相對較低,且與a樹存在較大的結(jié)構(gòu)沖突;使用16S與gyrB拼接序列構(gòu)建的進(jìn)化樹c結(jié)構(gòu)與b一致,表明建樹群中16S的差異較小,不足以影響分類結(jié)構(gòu),HX2016004菌株與解淀粉桿菌聚合在一枝,自展值為94,表明該菌株為解淀粉芽胞桿菌可能性高。c樹中BacillussubtilisATCC 13952的進(jìn)化關(guān)系存在疑問,有待進(jìn)一步分析,但不影響HX2016004菌株的鑒定。

    a-基于16S的進(jìn)化樹;b-gyrB基因的進(jìn)化樹; c-基于16S與gyrB基因的進(jìn)化樹
    圖1 HX2016004菌株基于16S與gyrB序列的進(jìn)化樹
    Fig.1 Phylogenetic trees about HX2016004 based on sequences of 16S andgyrB

    2.4 生理生化驗(yàn)證

    菌株HX2016004生理生化特征如表3所示,與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》中的解淀粉芽胞桿菌特征吻合,與進(jìn)化分析結(jié)果一致,命名為BacillusamyloliquefaciensHX2016004。

    表3 菌株HX2016004生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of HX2016004

    注:+代表革蘭氏染色呈陽性;-代表革蘭氏染色呈陰性

    2.5 聯(lián)合建樹方法適用性

    Genbank中16S與gyrB序列同時(shí)可得,且鑒定結(jié)果較為可靠的解淀粉芽胞桿菌菌株共有37株,另選擇親緣關(guān)系較近的芽胞桿菌屬其他菌種模式菌株16株,拼接16S與gyrB基因序列后構(gòu)建進(jìn)化樹如圖2所示。其中所有的解淀粉芽胞桿菌很好的聚合在一簇,與親緣關(guān)系相近菌種Bacillussubtilis、Bacilluslicheniformis、Bacilluspumilus具有較高的種間自展值,分類結(jié)構(gòu)可靠。也就是說,如這37株菌中的任意1株菌種還未鑒定的情況下,利用該方法建樹時(shí)均與其他36株解淀粉芽胞桿菌聚合在1枝,可準(zhǔn)確鑒定為解淀粉芽胞桿菌。表明16S與gyrB基因聯(lián)合建樹的方法適用于已知的37株解淀粉芽胞桿菌鑒定,可以預(yù)測該方法在解淀粉芽胞桿菌鑒定中具有普適性。

    圖2 Genbank已知菌株基于16S與gyrB序列的進(jìn)化樹
    Fig.2 Phylogenetic tree based on sequences of 16S andgyrBin Genbank

    3 結(jié)論

    利用16S與gyrB基因聯(lián)合建樹的方法,課題組快速將1株從土壤中篩選得到的芽胞桿菌HX2016004準(zhǔn)確鑒定為解淀粉芽胞桿菌。該方法中使用的引物均為通用引物,只需要1次擴(kuò)增即可得到16S與gyrB基因序列,測序量小,時(shí)間短,數(shù)據(jù)利用率高;與多基因分別建樹的方法相比,可避免進(jìn)化樹結(jié)構(gòu)之間的沖突和數(shù)據(jù)紊亂,提高了進(jìn)化樹準(zhǔn)確性,適用于16S序列高度相似的菌群鑒定。經(jīng)驗(yàn)證,該方法在解淀粉芽胞桿菌的鑒定中具有較普遍的適用性,課題組下一步將繼續(xù)研究該方法在其他菌群鑒別中的有效性。

    猜你喜歡
    建樹芽胞進(jìn)化樹
    勇毅執(zhí)著的追求 堅(jiān)實(shí)豐厚的建樹
    ——郭克儉《中國豫劇演唱藝術(shù)》評介
    單細(xì)胞分析研究二氧化氯對殺蚊細(xì)菌球形賴氨酸芽胞桿菌芽胞的影響
    基于心理旋轉(zhuǎn)的小學(xué)生物進(jìn)化樹教學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告
    一種簡單高效的芽胞純化方法及其效果評價(jià)
    常見的進(jìn)化樹錯(cuò)誤概念及其辨析*
    高壓熱殺菌技術(shù)滅活細(xì)菌芽胞機(jī)理研究進(jìn)展
    艾草白粉病的病原菌鑒定
    抓黨建樹品牌 聚民心促發(fā)展
    層次聚類在進(jìn)化樹構(gòu)建中的應(yīng)用
    芽胞結(jié)構(gòu)的研究進(jìn)展
    久久精品国产亚洲av高清一级| 女人精品久久久久毛片| 国产精品一区二区免费欧美| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产三级在线视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 黄频高清免费视频| 午夜老司机福利片| 久久青草综合色| 亚洲成人免费电影在线观看| 1024香蕉在线观看| 免费看十八禁软件| 欧美成人免费av一区二区三区| 日日夜夜操网爽| www日本在线高清视频| 精品电影一区二区在线| 99在线人妻在线中文字幕| 国产成人影院久久av| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 91在线观看av| 国产高清视频在线播放一区| 亚洲av成人av| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 91麻豆av在线| 99国产精品一区二区三区| 亚洲专区中文字幕在线| 久久香蕉国产精品| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 啦啦啦在线免费观看视频4| 不卡av一区二区三区| 亚洲国产精品合色在线| 超碰97精品在线观看| 麻豆久久精品国产亚洲av | 国产欧美日韩一区二区精品| x7x7x7水蜜桃| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 窝窝影院91人妻| 色老头精品视频在线观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 悠悠久久av| 韩国精品一区二区三区| 村上凉子中文字幕在线| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产成年人精品一区二区 | 精品久久久精品久久久| 国产精品一区二区精品视频观看| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲全国av大片| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 欧美日本中文国产一区发布| 在线观看免费日韩欧美大片| 欧美大码av| 国产乱人伦免费视频| 午夜a级毛片| 日韩av在线大香蕉| 国产精品一区二区在线不卡| 在线观看舔阴道视频| 日韩国内少妇激情av| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲伊人色综图| 免费av毛片视频| 性色av乱码一区二区三区2| 电影成人av| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 在线观看免费午夜福利视频| 成年女人毛片免费观看观看9| 欧美大码av| 一级毛片精品| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 久热爱精品视频在线9| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 99国产精品免费福利视频| 国产三级黄色录像| 俄罗斯特黄特色一大片| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 欧美亚洲日本最大视频资源| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 精品国产国语对白av| 一级黄色大片毛片| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 韩国精品一区二区三区| 国产真人三级小视频在线观看| 男女床上黄色一级片免费看| 欧美激情极品国产一区二区三区| 成在线人永久免费视频| 中亚洲国语对白在线视频| aaaaa片日本免费| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产在线精品亚洲第一网站| 老司机深夜福利视频在线观看| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 久久久水蜜桃国产精品网| 国产成人精品久久二区二区91| 成年人黄色毛片网站| 欧美黄色淫秽网站| av天堂久久9| 一本综合久久免费| 国产视频一区二区在线看| 三上悠亚av全集在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 午夜福利在线免费观看网站| 老司机午夜十八禁免费视频| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 亚洲片人在线观看| 久久香蕉激情| 超碰成人久久| 两个人免费观看高清视频| 久久精品91无色码中文字幕| 精品久久久久久久久久免费视频 | 亚洲精华国产精华精| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| av免费在线观看网站| 1024香蕉在线观看| 国产熟女午夜一区二区三区| 久久久久久久久中文| 无遮挡黄片免费观看| 中文字幕人妻丝袜制服| 制服人妻中文乱码| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 久热爱精品视频在线9| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 视频区图区小说| 国产伦一二天堂av在线观看| 午夜免费观看网址| 99精品久久久久人妻精品| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 免费观看人在逋| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲专区国产一区二区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲熟女毛片儿| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 人人妻人人澡人人看| 成人永久免费在线观看视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 久久精品成人免费网站| 9色porny在线观看| 无遮挡黄片免费观看| 高清黄色对白视频在线免费看| 级片在线观看| 三上悠亚av全集在线观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 激情在线观看视频在线高清| 天堂√8在线中文| 免费在线观看亚洲国产| 欧美精品亚洲一区二区| 久久久国产精品麻豆| www国产在线视频色| 久久国产精品影院| 成年人免费黄色播放视频| 国产97色在线日韩免费| 亚洲av成人一区二区三| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 老司机午夜福利在线观看视频| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 丰满的人妻完整版| 黄片大片在线免费观看| 欧美乱色亚洲激情| 亚洲久久久国产精品| 亚洲人成伊人成综合网2020| 又紧又爽又黄一区二区| 国产精品九九99| 精品一区二区三区四区五区乱码| 亚洲欧美激情在线| 亚洲精品粉嫩美女一区| 日本三级黄在线观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产精品av久久久久免费| 老司机午夜福利在线观看视频| 又紧又爽又黄一区二区| 精品久久久久久久毛片微露脸| 一级片'在线观看视频| 精品国产亚洲在线| 90打野战视频偷拍视频| 国产片内射在线| 精品电影一区二区在线| 狠狠狠狠99中文字幕| 9色porny在线观看| 一a级毛片在线观看| 波多野结衣一区麻豆| 午夜日韩欧美国产| 国产精品久久久人人做人人爽| 制服诱惑二区| 激情在线观看视频在线高清| 久久久精品欧美日韩精品| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产男靠女视频免费网站| 最近最新免费中文字幕在线| 美国免费a级毛片| av欧美777| 成年人黄色毛片网站| 色播在线永久视频| 免费av毛片视频| 三级毛片av免费| 成年版毛片免费区| 久久久国产精品麻豆| √禁漫天堂资源中文www| 成人av一区二区三区在线看| 一级,二级,三级黄色视频| 一级毛片精品| 在线免费观看的www视频| 国产区一区二久久| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲黑人精品在线| 黄色毛片三级朝国网站| 一区福利在线观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 身体一侧抽搐| 麻豆av在线久日| 黄色怎么调成土黄色| 精品久久久久久,| 免费在线观看黄色视频的| av电影中文网址| 亚洲激情在线av| 亚洲成a人片在线一区二区| 麻豆成人av在线观看| 嫩草影院精品99| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 神马国产精品三级电影在线观看 | 午夜精品国产一区二区电影| 国产黄色免费在线视频| 超碰成人久久| 一二三四社区在线视频社区8| 精品一区二区三区四区五区乱码| 丝袜在线中文字幕| 这个男人来自地球电影免费观看| 91在线观看av| 99精品欧美一区二区三区四区| 狂野欧美激情性xxxx| 在线观看www视频免费| 欧美激情高清一区二区三区| 91大片在线观看| 在线视频色国产色| 99久久国产精品久久久| 超碰97精品在线观看| 亚洲av熟女| 麻豆一二三区av精品| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 无人区码免费观看不卡| 亚洲精品国产区一区二| 夜夜爽天天搞| 欧美人与性动交α欧美软件| 日韩欧美三级三区| 国产精品 欧美亚洲| 欧美日韩亚洲高清精品| 高清毛片免费观看视频网站 | 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 99久久国产精品久久久| 国产成人欧美| 色精品久久人妻99蜜桃| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产主播在线观看一区二区| 大码成人一级视频| 午夜免费成人在线视频| 国产色视频综合| 午夜91福利影院| 啦啦啦免费观看视频1| av在线天堂中文字幕 | 黄色成人免费大全| 午夜免费观看网址| 一区二区三区精品91| 人人澡人人妻人| 黄色 视频免费看| www.999成人在线观看| 欧美精品一区二区免费开放| 中文字幕av电影在线播放| 精品电影一区二区在线| 99国产综合亚洲精品| 一级片'在线观看视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 日韩欧美一区视频在线观看| 中文欧美无线码| 久久 成人 亚洲| 国产亚洲精品第一综合不卡| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲男人的天堂狠狠| 麻豆成人av在线观看| 91av网站免费观看| 咕卡用的链子| 村上凉子中文字幕在线| 亚洲黑人精品在线| 电影成人av| 99国产精品一区二区蜜桃av| 丰满迷人的少妇在线观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸 | 免费高清视频大片| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 一级a爱视频在线免费观看| 新久久久久国产一级毛片| 久久精品成人免费网站| 国产区一区二久久| 亚洲三区欧美一区| 成年人免费黄色播放视频| 欧美中文日本在线观看视频| 岛国在线观看网站| 午夜福利在线免费观看网站| 国产精品永久免费网站| 神马国产精品三级电影在线观看 | 女人被狂操c到高潮| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 久久伊人香网站| 一边摸一边做爽爽视频免费| av在线天堂中文字幕 | 久久香蕉精品热| www.999成人在线观看| 国产av精品麻豆| 欧美另类亚洲清纯唯美| 妹子高潮喷水视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 久久影院123| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲成a人片在线一区二区| av免费在线观看网站| 啦啦啦 在线观看视频| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 一级a爱视频在线免费观看| 宅男免费午夜| 99久久精品国产亚洲精品| 身体一侧抽搐| 久久香蕉激情| 日韩免费av在线播放| 成年人黄色毛片网站| av免费在线观看网站| 99国产精品一区二区蜜桃av| 9热在线视频观看99| 成在线人永久免费视频| 日日爽夜夜爽网站| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲男人天堂网一区| av网站在线播放免费| 亚洲精品一区av在线观看| 日本wwww免费看| 欧美日韩亚洲高清精品| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 国产精华一区二区三区| 欧美日韩黄片免| 老鸭窝网址在线观看| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 欧美激情极品国产一区二区三区| 免费在线观看日本一区| 欧美黑人欧美精品刺激| 久久人妻av系列| 一进一出好大好爽视频| 9色porny在线观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 精品久久久久久成人av| 在线永久观看黄色视频| 久久人妻av系列| 国产精品免费一区二区三区在线| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产91精品成人一区二区三区| 多毛熟女@视频| 男人舔女人下体高潮全视频| 多毛熟女@视频| 欧美日韩黄片免| 亚洲一区二区三区欧美精品| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产黄色免费在线视频| 精品国产亚洲在线| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 黄色 视频免费看| 久久性视频一级片| 热re99久久精品国产66热6| 午夜免费激情av| 日本黄色视频三级网站网址| 午夜精品在线福利| 国产高清视频在线播放一区| 精品无人区乱码1区二区| 99国产极品粉嫩在线观看| aaaaa片日本免费| 日本五十路高清| 日本一区二区免费在线视频| 亚洲 国产 在线| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲一区二区三区色噜噜 | 一二三四在线观看免费中文在| 久久久久久久精品吃奶| 国产精品免费视频内射| 国产黄色免费在线视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 99久久国产精品久久久| 亚洲成人精品中文字幕电影 | 乱人伦中国视频| 午夜老司机福利片| 神马国产精品三级电影在线观看 | 宅男免费午夜| av天堂久久9| 欧美黑人欧美精品刺激| 午夜免费鲁丝| 久久久久久久午夜电影 | 免费人成视频x8x8入口观看| 国产视频一区二区在线看| 免费看十八禁软件| 中文亚洲av片在线观看爽| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲 国产 在线| 人人妻人人澡人人看| av天堂在线播放| 亚洲人成伊人成综合网2020| 免费少妇av软件| 人妻久久中文字幕网| 欧美黑人精品巨大| 在线播放国产精品三级| 亚洲av成人av| 久久精品国产综合久久久| 国产免费现黄频在线看| 超碰成人久久| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 美女福利国产在线| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 日本 av在线| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 色婷婷av一区二区三区视频| 精品久久久久久,| 精品欧美一区二区三区在线| 欧美在线黄色| 国产亚洲欧美精品永久| 国产主播在线观看一区二区| 制服人妻中文乱码| 一二三四社区在线视频社区8| 91老司机精品| www.999成人在线观看| 黄片播放在线免费| 亚洲精品美女久久av网站| 欧美最黄视频在线播放免费 | 久久久国产一区二区| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 老司机亚洲免费影院| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲三区欧美一区| 电影成人av| 欧美日韩精品网址| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲精品在线美女| 后天国语完整版免费观看| 黄色成人免费大全| 国产伦人伦偷精品视频| 国产精品久久电影中文字幕| 最近最新中文字幕大全电影3 | 亚洲av熟女| 亚洲色图综合在线观看| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 欧美丝袜亚洲另类 | 在线视频色国产色| 在线观看日韩欧美| 亚洲色图av天堂| 国产成人精品在线电影| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲av成人av| 69av精品久久久久久| 国产成+人综合+亚洲专区| 久久久国产精品麻豆| 我的亚洲天堂| 欧美日本亚洲视频在线播放| 99在线视频只有这里精品首页| 在线观看免费视频日本深夜| 久久精品91无色码中文字幕| 97人妻天天添夜夜摸| 亚洲九九香蕉| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 午夜免费激情av| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 中文字幕色久视频| 另类亚洲欧美激情| 一区二区三区国产精品乱码| 99国产精品一区二区蜜桃av| 一边摸一边做爽爽视频免费| 午夜免费激情av| 亚洲精品成人av观看孕妇| av福利片在线| 欧美av亚洲av综合av国产av| 色婷婷av一区二区三区视频| 涩涩av久久男人的天堂| √禁漫天堂资源中文www| 免费高清视频大片| 99国产精品一区二区三区| a级毛片在线看网站| 国产成人欧美| 十分钟在线观看高清视频www| 另类亚洲欧美激情| 久久久久久久久中文| 人成视频在线观看免费观看| 国产一区二区三区视频了| e午夜精品久久久久久久| 一a级毛片在线观看| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲熟女毛片儿| 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲,欧美精品.| 国产99久久九九免费精品| 天天添夜夜摸| 国产精品一区二区精品视频观看| 欧美日韩视频精品一区| 色在线成人网| 黄片播放在线免费| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲精品在线美女| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 午夜福利一区二区在线看| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产亚洲精品久久久久5区| 老司机在亚洲福利影院| 久久午夜亚洲精品久久| 村上凉子中文字幕在线| 两个人看的免费小视频| 午夜福利在线免费观看网站| 激情在线观看视频在线高清| 在线观看免费午夜福利视频| 免费少妇av软件| 黄色a级毛片大全视频| 男女下面插进去视频免费观看| 美女国产高潮福利片在线看| 一区在线观看完整版| 久久久国产欧美日韩av| 精品一区二区三区av网在线观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 日本黄色视频三级网站网址| 国产单亲对白刺激| 91精品三级在线观看| 欧美性长视频在线观看| 国产黄色免费在线视频| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲情色 制服丝袜| 国产精品av久久久久免费| 成年版毛片免费区| 无人区码免费观看不卡| 免费av毛片视频| 亚洲欧美一区二区三区久久| 一级,二级,三级黄色视频| 神马国产精品三级电影在线观看 | 天天添夜夜摸| 水蜜桃什么品种好| 三级毛片av免费| 另类亚洲欧美激情| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 嫁个100分男人电影在线观看| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲精品久久午夜乱码| 在线看a的网站| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 色综合欧美亚洲国产小说| 欧美黄色片欧美黄色片| 在线观看舔阴道视频| 大香蕉久久成人网| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲七黄色美女视频| 不卡一级毛片| 一级片'在线观看视频| 国产精品九九99| 激情在线观看视频在线高清| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 一进一出好大好爽视频| 一本大道久久a久久精品| 麻豆国产av国片精品| 精品久久久久久,| 看免费av毛片| а√天堂www在线а√下载| 成人av一区二区三区在线看| 多毛熟女@视频| 黄色视频,在线免费观看| 热re99久久精品国产66热6| 老司机福利观看| 成人免费观看视频高清| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 亚洲欧美日韩无卡精品| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 黑人猛操日本美女一级片| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 日日夜夜操网爽| 日韩av在线大香蕉| 国产精品影院久久| 黄色a级毛片大全视频| 一夜夜www| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产精品日韩av在线免费观看 | 欧美黑人欧美精品刺激| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产精品99久久99久久久不卡| 三级毛片av免费| 88av欧美| 97人妻天天添夜夜摸| 热99re8久久精品国产| 精品乱码久久久久久99久播| 岛国在线观看网站| x7x7x7水蜜桃| 国产精品一区二区三区四区久久 | 久久人妻av系列| 男女下面插进去视频免费观看| 三上悠亚av全集在线观看| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 水蜜桃什么品种好| 在线av久久热| 深夜精品福利| 亚洲国产精品合色在线|