碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌耐藥基因型檢測及同源性分析

胡志軍，吳希靜，潘曉龍，崇慧峰，朱娟娟，趙哲，唐吉斌

作者單位：銅陵市人民醫(yī)院，a檢驗(yàn)科，b婦產(chǎn)科，安徽 銅陵244000

碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌（Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE）在我國臨床上越來越常見，美國疾病控制和預(yù)防中心（CDC）已經(jīng)將CRE定義為對全球公眾健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅三種微生物之一[1]，但碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌分離率相對穩(wěn)定，一直維持在2%左右[2-3]。大腸埃希菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥機(jī)制在各地區(qū)均見到不同報(bào)道。因此，筆者檢測臨床分離的碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌所攜帶的碳青霉烯酶耐藥基因型，并對其進(jìn)行同源性分析，為醫(yī)院感染和臨床提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 25株碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌分離自2012年9月至2016年10月銅陵市人民醫(yī)院臨床標(biāo)本，剔除同一病人重復(fù)菌株?？咕幬锛埰团囵B(yǎng)基分別為英國OXOID公司和合肥天達(dá)公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)鑒定和藥敏試驗(yàn) 嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行，梅里埃公司Vitek-2 Compact型細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定。采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，依據(jù)CLSI 2015年[4]標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。

1.2.2 EDTA雙紙片協(xié)同試驗(yàn) 將培養(yǎng)過夜的細(xì)菌制成0.5麥?zhǔn)蠞舛染?，接種MH平板，晾干后中間貼IPM，相距1～2 cm處貼EDTA紙片（含4 μL 0.5 M EDTA）。培養(yǎng)18～24 h后，以IPM抑菌圈在EDTA紙片側(cè)明顯擴(kuò)大者為金屬酶陽性。

1.2.3 改良Hodge試驗(yàn) 參照CLSI 2015推薦方法進(jìn)行。

1.2.4 碳青霉烯酶基因檢測 （1）PCR試劑與儀器：PCR試劑盒、瓊脂糖（進(jìn)口分裝）、DNA Marker、電泳緩沖液等試劑為上海生工產(chǎn)品。擴(kuò)增用瑞士羅氏cobas z 480型PCR儀進(jìn)行。（2）PCR方法：煮沸法提取細(xì)菌DNA模板，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。各引物序列（表1）由上海生工合成。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)（137V）凝膠電泳30 min后，置凝膠成像系統(tǒng)上成像。（3）基因測序：陽性擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生工公司進(jìn)行純化和測序，測序結(jié)果經(jīng)BLASTn比對來確定碳青霉烯酶基因型。

表1 PCR引物序列

1.2.5 腸桿菌科基因間重復(fù)一致序列PCR （ERIC-PCR）（1）ERIC-PCR方法：煮沸法提取細(xì)菌DNA模板，嚴(yán)格按照生工PCR反應(yīng)試劑盒（B532073）說明書操作。反應(yīng)體系共50 μL，ERIC-PCR引物：E1 5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′，E2 5′-AAGTAAGTGACTGGG GTGAGCG-3′。反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃ 7 min，變性94℃ 1 min，退火52℃ 1 min，延伸65℃8 min，共30個(gè)循環(huán)，最后65℃延伸16 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)（46 V）凝膠電泳2 h后，置凝膠成像系統(tǒng)上成像。（2）DNA同源性分析：電泳后，分型條帶位置完全相同和相差1～2條者為同一基因型，相差3條及以上者為不同型別。

2 結(jié)果

2.1 碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌的科室和標(biāo)本來源 25株碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌分離自臨床13個(gè)科室，其中肝膽外科和胃腸外科各4（16.0%）株，泌尿外科和神經(jīng)外科各3（12.0%）株，耳鼻喉頭頸外科和骨科各2（8.0%）株，急診科、婦科、呼吸內(nèi)科、神經(jīng)內(nèi)科、腎內(nèi)科、重癥醫(yī)學(xué)科和中醫(yī)風(fēng)濕科各1（4.0%）株。標(biāo)本分布中，分離自中段尿最多，11（44.0%）株，其次是痰液6（24.0%）株，膿標(biāo)本3（12.0%）株，膽汁和引流液各2（8.0%）株，血液標(biāo)本1（4.0%）株。

2.2 改良Hodge試驗(yàn)結(jié)果 25株碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌改良Hodge試驗(yàn)8株陽性，陽性率32.0%。

2.3 金屬酶初篩試驗(yàn)結(jié)果 25株碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌中，EDTA協(xié)同試驗(yàn)13株陽性，陽性率52.0%。

2.4 碳青霉烯酶基因型檢測結(jié)果

2.4.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 25株碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌中分別擴(kuò)增出4株NDM基因、1株IMP基因和1株KPC基因陽性產(chǎn)物；未見VIM和OXA-48型陽性產(chǎn)物。

2.4.2 PCR產(chǎn)物測序結(jié)果 擴(kuò)增陽性產(chǎn)物測序序列經(jīng)BLASTn網(wǎng)上比對后與目標(biāo)基因型同源性均為100%，分別為4株NDM-1型（圖1）、1株IMP-4型和1株KPC-2型碳青霉烯酶。

2.5 ERIC?PCR同源性分析結(jié)果

2.5.1 ERIC-PCR同源性分型結(jié)果 25株碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌應(yīng)用ERIC-PCR擴(kuò)增后電泳，對電泳條帶進(jìn)行基因分型，每株細(xì)菌產(chǎn)生3～7條擴(kuò)增條帶，稱為指紋圖譜，部分結(jié)果見圖2。16株碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌共分10型，無明顯優(yōu)勢型別。其中9株細(xì)菌未擴(kuò)增出有效條帶，未分型。

2.5.2 10型碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌在科室流行情況 10型碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌在臨床科室中呈散在分布，未見同一型別的細(xì)菌在同一科室集中出現(xiàn)，并且同一科室的幾株細(xì)菌還分離自不同年份。

3 討論

大腸埃希菌是醫(yī)院感染最多見的病原菌，但令人欣慰的是細(xì)菌耐藥性監(jiān)測顯示碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌感染率并未出現(xiàn)明顯增加，維持在1%～3%。盡管近年大腸埃希菌耐藥率未見明星上升，而且存在一定的好轉(zhuǎn)趨勢[8]，但仍需密切關(guān)注此類細(xì)菌的變化。

CRE的耐藥機(jī)制目前報(bào)道最多的是產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌，在大腸埃希菌中報(bào)道的較少，基本都是散在出現(xiàn)。而且國內(nèi)外研究均提示碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌的耐藥機(jī)制有明顯的地域性差異，在不同的地方檢出的耐藥基因型也不一樣[9-13]。本研究中，金屬酶篩選試驗(yàn)雙紙片協(xié)同試驗(yàn)陽性率為52.0%；而改良Hodge試驗(yàn)陽性率較低，為32.0%，說明本地區(qū)碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌的耐藥機(jī)制可能以產(chǎn)B類金屬酶為主，隨后的耐藥基因也證實(shí)上面觀點(diǎn)。本研究中，檢出5例B類金屬酶耐藥基因（4例blaNDM-1和1例blaIMP-4）和1例A類碳青霉烯酶耐藥基因（blaKPC-2）。近年，國內(nèi)外均有報(bào)道攜帶blaNDM-1型耐藥基因的碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌[9-10，14-15]，而新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶（NDM）在2008年首次從肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)，被稱為“超級細(xì)菌”。隨后在印度、巴基斯坦、科威特、美國等國家[16-17]均有報(bào)道，尤其NDM-1在新加坡、印度等國家是最常見的碳青霉烯酶基因型。但在我國并不多見，只有一些散在報(bào)道。本研究中碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌卻是攜帶blaNDM-1型耐藥基因?yàn)橹?，這類細(xì)菌耐藥性強(qiáng)，需要我們高度重視，密切監(jiān)測這類細(xì)菌，避免出現(xiàn)暴發(fā)流行。

圖1 碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌的NDM-1型測序結(jié)果部分峰圖

圖2 碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌的基因間重復(fù)一致序列聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)指紋圖譜

此外，本研究還檢測到1例攜帶blaIMP-4型耐藥基因的碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌，IMP是最常見的B類碳青霉烯酶，在我國主要為IMP-4和IMP-8型。同時(shí)，還檢出1例攜帶blaKPC-2型耐藥基因的碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌，KPC-2基因主要見于肺炎克雷伯菌，也是本地區(qū)碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌的主要耐藥基因，在碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌中也是時(shí)有報(bào)道，但一般并不構(gòu)成主要類型。遺憾的是，實(shí)驗(yàn)條件限制，本研究可能漏檢了其他基因型，膜孔蛋白和外排泵機(jī)制也未作研究。

脈沖場凝膠電泳（PFGE技術(shù)）是目前國際公認(rèn)的病原菌同源性分析的金標(biāo)準(zhǔn)，但其儀器昂貴，操作復(fù)雜，不適用于基層實(shí)驗(yàn)室開展。而ERIC-PCR技術(shù)操作簡單、分型效率高，已成為腸桿菌科DNA基因分型常用方法[18-19]。本研究的ERIC-PCR同源性分析結(jié)果顯示，碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌分屬于10個(gè)不同的流行克隆型，10型碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌在臨床科室中均呈散在分布，25株細(xì)菌分離自13個(gè)不同的臨床科室，未見同一型別的細(xì)菌在同一科室集中出現(xiàn)，并且同一科室的幾株細(xì)菌還分離自不同年份，這些都提示該細(xì)菌在本院只是散在流行，未出現(xiàn)暴發(fā)流行的情況。

綜上所述，本地區(qū)碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌的耐藥機(jī)制以攜帶B類碳青霉烯酶（金屬酶）為主，尤其是攜帶blaNDM-1型耐藥基因最常見，同時(shí)還存在blaIMP-4和blaKPC-2型耐藥基因，未發(fā)現(xiàn)暴發(fā)流行，呈現(xiàn)散在流行，為院感控制工作提供了實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。