微RNA?21調(diào)控的蛋白酪氨酸磷酸酶MEG2蛋白低表達促進肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制

饒鐘鳴，馬慧，關(guān)耀武

作者單位：駐馬店市中心醫(yī)院胸外科，河南 駐馬店463000

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤，而非小細胞肺癌（NSCLC）占其75%～80%[1-2]，因此，闡明肺癌發(fā)病的分子機制對于肺癌的治療具有重要意義。

據(jù)報道，多種基因改變與肺癌發(fā)生和腫瘤進展有關(guān)，一些致癌基因如HER2、EGFR等被過表達[3-6]。相反，許多腫瘤抑制基因如P53等被滅活或下調(diào)[7-8]。

MEG2是蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）家族的成員[9]。PTPs在細胞酪氨酸磷酸化水平調(diào)節(jié)和多種生理過程的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。最近的研究報道，MEG2能夠通過促進EGFR和ErbB2的去磷酸化，從而抑制STAT3的激活，是乳腺癌的負調(diào)控因子。另外，MEG2在胃癌中也作為抑癌基因發(fā)揮功能，提示在惡性腫瘤中，MEG2可能充當(dāng)著病理因子的角色[10-12]。雖然部分報道發(fā)現(xiàn)MEG2在肺癌中低表達[13]，但是對于MEG2在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中異常低表達及作用機制尚不完全清楚。

miRNAs是大小為20～22個核苷酸的非編碼小RNA，它通過與靶mRNAs 3′-UTR結(jié)合，導(dǎo)致mRNA降解或翻譯抑制，從而沉默靶基因的表達[14]。研究表明miRNAs參與各種細胞過程的調(diào)控，包括細胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移、凋亡、發(fā)育以及代謝[14-15]。

本研究于2015年6月至2018年6月間在體內(nèi)外實驗上探究了miR-21作為腫瘤抑制因子是否可通過靶向MEG2從而影響肺癌細胞的增殖、侵襲和凋亡及其中分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系和人體組織 人肺癌細胞系，A549和H1975，均來自中國科學(xué)院上海細胞庫，用10%胎牛血清的DMEM（Gibco，Carlsbad，CA，USA）培養(yǎng)基，在含5%二氧化碳的加濕空氣中37℃培養(yǎng)。肺癌和癌旁組織從駐馬店市中心醫(yī)院病人的外科手術(shù)中獲取，并同每個捐贈者都簽署了一份簽名同意的表格。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。7例肺癌病人的臨床信息分別如下：①男，64歲，ⅡA型；②女，60歲，ⅠB型；③男，47歲，ⅡA型；④男，49歲，ⅡB型；⑤女，41歲，ⅠB型；⑥男，39歲，ⅢA型；⑦男，54歲，ⅢB型。

1.2 RNA提取和實時熒光定量PCR 總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和TaqMan實時聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）均按照生產(chǎn)商的說明書進行操作，如前所述。為了定量MEG2的mRNA，1 μL的總RNA用oligo dT和Thermoscript（TaKaRa）進行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件如下：42℃，60 min，85℃，5 min。SYBER Green染料（Invitrogen）、MEG2和GAPDH的特異引物用于qRTPCR。引物的序列如下：MEG2正向引物為5′-CCTGCCTTAGACTGGGACT-3′，MEG2 反向引物為 5′-TTCGCTTTGTTAGCTTCACT-3′。

GAPDH正向引物為5′-GATATTGTTGCCATCAATGAC-3′，GAPDH反向引物為5′-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3′。MEG2 mRNA的相對定量以GAPDH基因進行歸一化處理。

1.3 miRNA的過表達或敲降 合成的RNA分子，包括前體miR-21、反義miR-21和無義對照RNA（miR前體對照和反義對照）購買于GenePharma（上海）。細胞接種在6孔板中，將細胞分為四組，24 h后細胞密度在70%時分別用Lipofectamine 2000（Invitrogen）進行轉(zhuǎn)染。每孔中前體miR-21、反義miR-21和無義對照RNA的用量均為100 pmol。24 h后收集細胞進行qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法實驗。

1.4 質(zhì)粒的構(gòu)建和siRNA干擾分析 MEG2過表達質(zhì)粒（pReceiver-M02-MEG2）購買于GeneCopoeia（Germantown，MD，USA），空載質(zhì)粒作為對照。2種靶 向 人 MEG2 基 因 的 siRNAs（siRNA-1：5′-ACAGUUUCAUAGAGCCAUGAAGUAU-3'；siRNA-2：5′-ACUUUGCUGUAACCCUGUA-3′）購買于 GenePharma，無義的 siRNA（GenePharma）作為對照?？俁NA或蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)染后24 h或48 h提取。MEG2蛋白表達水平用蛋白質(zhì)印跡法進行檢測。

1.5 熒光素酶報告實驗 為了驗證miR-21與MEG2的直接結(jié)合，我們進行了熒光素酶報告實驗。由GenePharma直接合成MEG2的正常和突變的3′-UTR序列，然后插入PGL3質(zhì)粒（Ambion）。293 T細胞在24孔板中培養(yǎng)，每孔均用Lipofectamine 2 000轉(zhuǎn)染了β-半乳糖苷酶（β-gal）表達質(zhì)粒（Ambion）和0.2 μg的螢火蟲熒光素酶報告質(zhì)粒，以及等量的前體miR-21和無義對照RNA，其中β-半乳糖苷酶質(zhì)粒用作對照。24 h后，這些細胞通過熒光素酶分析試劑盒（Promega，Madison，WI，USA）進行分析。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法實驗 蛋白質(zhì)水平通過蛋白質(zhì)印跡法檢測，并且用GAPDH抗體進行歸一化處理。所用抗體如下：MEG2抗體（Abcam ab32441，Cambridge，MA，USA）和GAPDH抗體（sc-365062；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA）。運用Image J軟件對蛋白條帶進行灰度分析。

1.7 細胞增殖實驗 將A549細胞以1×104的密度接種在96孔板中，并在12 h后轉(zhuǎn)染。經(jīng)轉(zhuǎn)染后，每孔加入10 μLCCK-8試劑盒中的WST-8溶液（Beyotime，China）。孵育2 h，分別在3個時間點（0 h，12 h和60 h）讀取在450 nm下的吸光度值。計算出的相對細胞數(shù)值即為60 h和12 h的吸光度之比。

1.8 細胞侵襲和凋亡分析實驗 A549細胞的侵襲實驗和凋亡分析分別用Transwell Boyden Chamber（6.5 mm，Costar，Corning，NY，USA）和 Annexin VFITC/PI staining試劑盒（BD Biosciences，San Diego，CA，USA）進行測試?？偟蛲黾毎窃缙诘蛲觯≒I-AV+）和晚期凋亡（PI+AV+）細胞的總和。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 所有的蛋白質(zhì)印跡圖都代表了三次以上獨立實驗的結(jié)果。qRT-PCR、熒光素酶報告實驗、細胞增殖和凋亡分析也均為重復(fù)3次的實驗結(jié)果。所有結(jié)果均以表示，兩組之間的檢驗方法為Student's t-test，兩組以上的檢驗方法為one-way ANOVA，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌組織中蛋白酪氨酸磷酸酶MEG2蛋白和mRNA水平變化不一致 首先，我們檢測了7對人肺癌組織的MEG2蛋白水平（圖1A）。我們發(fā)現(xiàn)，在肺癌組織中MEG2蛋白水平均被下調(diào)（變化倍數(shù)依次為：0.19，0.83，0.21，0.05，0.42，0.37，0.09），隨后，我們用qRT-PCR檢測同樣的7對癌和癌旁組織的MEG2 mRNA水平。結(jié)果顯示MEG2 mRNA水平在癌和癌旁組織之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（變化倍數(shù)依次為：0.95，1.02，0.98，0.96，0.99，0.93，0.98）。在肺癌組織中，MEG2蛋白和mRNA水平之間的這種差異，提示了MEG2的調(diào)節(jié)機制存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。

2.2 蛋白酪氨酸磷酸酶MEG2抑制肺癌細胞增殖，促進肺癌細胞凋亡 MEG2在肺癌組織中的異常表達提示MEG2可能發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用，可能參與肺癌細胞增殖、凋亡或其他生理過程。因此，我們主要研究了MEG2對肺癌細胞增殖和凋亡的影響。首先，我們分別在A549細胞中改變MEG2的表達水平檢測MEG2在肺癌細胞生長中的作用。通過構(gòu)建過表達質(zhì)粒和siRNA分別過表達或抑制MEG2，功能實驗檢測顯示過表達MEG2能抑制肺癌細胞的增殖速率（P＜0.001），促進肺癌細胞凋亡（細胞凋亡率：對照組5.16，質(zhì)粒組17.82，P＝0.000），而轉(zhuǎn)染了MEG2 siRNA的肺癌細胞增殖速率加快（P＝0.000），凋亡減少（細胞凋亡率：對照組5.88，質(zhì)粒組3.28，P＝0.000），見圖1B～E。綜上結(jié)果證明，MEG2能夠影響肺癌細胞的增殖和凋亡。

2.3 miR?21作為靶向蛋白酪氨酸磷酸酶MEG2的預(yù)測microRNA miRNA抑制mRNA的翻譯是一種常見的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式。為了確定哪些miRNAs可以在肺癌細胞中靶向MEG2，我們運用了三種算法，TargetScan，miRanda和PicTar進行預(yù)測分析。在候選的miRNAs中，miR-21是一種在肺癌中普遍被上調(diào)的促癌因子[16-17]。

2.4 肺癌組織中miR?21和蛋白酪氨酸磷酸酶MEG2水平呈負相關(guān) 依據(jù)miRNAs與其目標(biāo)基因的負相關(guān)表達模式，我們接著研究了miR-21在臨床病人組織中是否與MEG2水平呈負相關(guān)。在檢測了7對肺癌組織和癌旁組織中的miR-21水平后，發(fā)現(xiàn)miR-21在肺癌組織中顯著升高（值：LN組為0.96 0.33 0.23 0.18 0.06 0.11 0.08；LC組為2.86 1.32 0.96 0.85 0.94 0.54 0.62；P＝0.000）?；谏镄畔W(xué)預(yù)測和人肺癌組織中miR-21和MEG2水平呈負相關(guān)的結(jié)果，提示了MEG2是miR-21的潛在靶基因。

2.5 驗證蛋白酪氨酸磷酸酶MEG2是miR?21的直接靶基因 通過對人肺癌細胞系A(chǔ)549和H1975中miR-21的過表達或敲降，進一步證實miR-21和MEG2的直接相關(guān)性。如預(yù)期一樣，A549細胞和H1975細胞中轉(zhuǎn)染miR-21 mimic后，miR-21的水平顯著提高，轉(zhuǎn)染反義miR-21后miR-21水平急劇下降。對應(yīng)的，在兩種細胞中，miR-21的過表達顯著抑制了MEG2蛋白的表達（變化倍數(shù)：A549 0.26；H1975 0.18），促進Vimentin表達（變化倍數(shù)：A549 2.04；H1975 3.22）；而miR-21的下調(diào)顯著增加了肺癌細胞中的MEG2蛋白水平（變化倍數(shù)：A549 2.48；H1975 2.18）并抑制Vimentin表達（變化倍數(shù)：A549 0.16；H1975 0.08），見圖2。

圖1 肺癌組織中MEG2蛋白和mRNA表達水平及MEG2對肺癌細胞增殖和凋亡的影響：A為7對肺癌和癌旁組織MEG2的蛋白質(zhì)印跡法代表圖，B為在A549中過表達MEG2抑制細胞增殖（P＝0.001），C為在A549中過表達MEG2促進細胞凋亡（P＝0.000），D為在A549中敲降MEG2能促進細胞增殖（P＝0.001），E為在A549中敲降MEG2能抑制細胞凋亡（P＝0.000）

圖2 miR-21直接轉(zhuǎn)錄后調(diào)控MEG2的表達：A為MEG2 3′UTR和miR-21形成雙鏈的結(jié)合位點；B為A549細胞和H1975細胞轉(zhuǎn)染了等量miR-21 mimics，反義miR-21（anti-miR-21）或無義對照RNA后蛋白質(zhì)印跡法分析

為了證明miR-21對MEG2表達的負調(diào)控是通過miR-21與MEG2 mRNA 3′UTR預(yù)測位點的直接結(jié)合，我們進行了熒光素酶報告實驗。在報告質(zhì)粒中，我們把含有miR-21預(yù)測結(jié)合位點的全長3′UTR序列放置在螢火蟲熒光素酶基因的下游。然后將重組質(zhì)粒和miR-21 mimics共同轉(zhuǎn)染進A549細胞。如預(yù)期一樣，熒光素酶活性在共轉(zhuǎn)入熒光素酶報告質(zhì)粒和miR-21 mimics的細胞中顯著減少（過表達：0.26，P＝0.001；抑制：2.82，P＝0.036）。然后我們引入點突變，以消除miR-21與MEG2 3'UTR預(yù)測位點的結(jié)合。突變后的熒光素酶活性無論是在miR-21過表達還是敲降后均不受其影響。這一結(jié)果表明，該結(jié)合位點對miR-21和MEG2 mRNA之間的結(jié)合有著強烈的影響。綜上所述，該結(jié)果證實了miR-21直接識別并結(jié)合到MEG2轉(zhuǎn)錄本的3'UTR區(qū)域進而抑制MEG2的翻譯。

2.6 肺癌細胞中miR?21對蛋白酪氨酸磷酸酶MEG2的調(diào)控作用 我們進一步分析了miR-21通過抑制MEG2表達對肺癌細胞功能的影響。鑒于MEG2已報道能抑制細胞增殖，并促進凋亡[18]，我們猜測miR-21可能通過抑制MEG2表達，繼而影響細胞的增殖和凋亡。如預(yù)期，A549細胞中miR-21過表達促進了細胞增殖（P＝0.020）并抑制了細胞凋亡（細胞凋亡率：對照5.68，miR-21過表達3.28；P＝0.000）；而抑制miR-21對肺癌細胞增殖（P＝0.004）和凋亡有相反的影響（細胞凋亡率：對照4.36，miR-21抑制13.08；P＝0.000）。接著我們在A549細胞中進行了回復(fù)實驗，蛋白分析結(jié)果顯示，過表達miR-21能夠減弱MEG2過表達質(zhì)粒對MEG2的上調(diào)作用。更為重要的是，增殖和細胞凋亡分析顯示，miR-21抵抗的MEG2過表達顯著降低了miR-21對細胞增殖的促進（P＝0.003）作用和對凋亡的抑制作用（細胞凋亡率：對照5.21，miR-21過表達3.66，MEG2過表達11.88，miR-21+MEG2過表達4.02；P＝0.002）。綜上所述，MEG2對肺癌細胞的增殖和凋亡至關(guān)重要，而miR-21可能通過沉默MEG2進而促進肺癌細胞增殖，并抑制其凋亡。見圖3。

圖3 miR-21和MEG2對肺癌細胞增殖和凋亡的影響：A為A549細胞轉(zhuǎn)染了等量的miR-21 mimics或無義對照RNA、等量的反義miR-21或無義對照RNA后的24 h，分別進行了細胞凋亡檢測（P＝0.000，P＝0.000）；B為 A549細胞轉(zhuǎn)染了等量的前體對照、miR-21 mimics、MEG2過表達質(zhì)粒或miR-21 mimics和MEG2過表達質(zhì)粒48 h，蛋白質(zhì)印跡法分析MEG2蛋白表達變化；C為A549細胞轉(zhuǎn)染了等量的前體對照、miR-21 mimics、MEG2過表達質(zhì)?；騧iR-21 mimics和MEG2過表達質(zhì)粒后檢測細胞的凋亡水平變化（P＝0.002）

2.7 信號轉(zhuǎn)換器和轉(zhuǎn)錄激活因子3在轉(zhuǎn)錄水平促進miR?21的表達 我們進一步探究了miR-21在肺癌細胞中異常上調(diào)的分子機制，通過檢索文獻發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子STAT3可直接與miR-21啟動子區(qū)結(jié)合進而促進miR-21的表達，為了在肺癌中驗證這一現(xiàn)象，我們在A549細胞中分別用過表達質(zhì)粒和siRNA上調(diào)和下調(diào)STAT3蛋白，然后檢測miR-21的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上調(diào)STAT3可顯著促進miR-21表達（變化倍數(shù)：3.79；P＝0.000），而下調(diào)STAT3則顯著抑制miR-21表達（變化倍數(shù)：0.42；P＝0.000），說明在肺癌細胞中STAT3同樣可直接促進miR-21的表達。

3 討論

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤，NSCLC約占所有原發(fā)性肺癌的75%～80%[1-2]。新療法的療效目前仍然受到藥物耐藥性以及對腫瘤細胞信號通路缺乏了解的限制。許多基因，如癌癥抑制因子（抑癌基因）和癌癥誘導(dǎo)因子（致癌基因）影響著肺癌的發(fā)生。蛋白酪氨酸磷酸酶（Protein Tyrosine Phosphatases，PTPs）是細胞功能的重要調(diào)控因子，PTPs失調(diào)是人類癌癥的主要原因之一[19-20]。蛋白酪氨酸磷酸酶MEG2（MEG2）是屬于PTP組的細胞質(zhì)磷酸酶[21-22]。MEG2可以抑制STAT3（信號轉(zhuǎn)換器和轉(zhuǎn)錄激活因子3）和ErbB家族[包括EGFR（表皮生長因子受體）和ErbB2]的去磷酸化，從而抑制受體酪氨酸激酶（RTK）的激活[10-11]。MEG2蛋白在乳腺癌、前列腺癌、胃癌和肝癌中表達減少[10，23-24]。然而，在肺癌的發(fā)展過程中，MEG2的作用和調(diào)節(jié)機制尚未見報道。

本研究中我們觀察到過表達MEG2能抑制肺癌細胞的增殖以及促進凋亡，而siRNA去沉默MEG2的表達則導(dǎo)致相反的效果，這提示MEG2蛋白在肺癌的發(fā)展過程中扮演著重要的抑癌基因的角色。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)了人肺癌組織中MEG2蛋白和mRNA水平之間的不一致趨勢。這表明了調(diào)節(jié)MEG2表達的機制中存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。這種調(diào)控方式的一個重要模式是通過miRNAs抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄。因此，我們預(yù)測了靶向MEG2的miRNAs，并將miR-21作為候選對象。機制研究表明，miR-21可以直接結(jié)合MEG2的3'UTR，并抑制其在肺癌細胞中的表達。此外，我們還發(fā)現(xiàn)miR-21抑制MEG2表達，促進肺癌細胞增殖并抑制其凋亡，且轉(zhuǎn)錄因子STAT3可在肺癌中上調(diào)miR-21的表達。上述結(jié)果闡明了一條新的調(diào)控軸，即STAT3-miR-21通過靶向MEG2調(diào)節(jié)肺癌細胞的增殖和凋亡。

在過去數(shù)十年中，miRNAs在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著一個重要的角色[15]。在目前的研究中，我們觀察到，與鄰近的癌旁組織相比，肺癌組織的miR-21水平更高。這表明，miR-21可能會作為腫瘤促進因子影響腫瘤發(fā)生。事實上，miR-21在多種癌癥中都被上調(diào)，包括胃癌、乳腺癌和前列腺癌[25-27]。此外，miR-21通過對增殖、轉(zhuǎn)移、上皮-間質(zhì)的轉(zhuǎn)換以及細胞黏附的調(diào)節(jié)，在癌癥中發(fā)揮促腫瘤的作用[28-30]。圖7中，我們發(fā)現(xiàn)過表達miR-21促進肺癌細胞增殖并抑制其凋亡，體內(nèi)外的miR-21功能與沉默MEG2表達的效果類似。同時我們發(fā)現(xiàn)，恢復(fù)MEG2的表達減弱了miR-21對肺癌細胞的促增殖和抗凋亡的作用。盡管miR-21靶向多個目標(biāo)，但上述結(jié)果表明其對MEG2的靶向調(diào)節(jié)是一種在肺癌中促進腫瘤的主要機制。

綜上，本研究描述了一種新的調(diào)控軸，即miR-21作為促癌因子，在肺癌發(fā)生時抑制MEG2的表達。此研究可能為肺癌治療開辟新的視野。