高效液相色譜?電霧式檢測(cè)法測(cè)定甘草中4種有效成分的含量

任霞，胡沖，張亞中

作者單位：1安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230031；2安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽 合肥 230051

甘草（Radix Glycyrrhizae）為豆科植物Glycyrrhiza uralensis Fisch.脹果甘草或光果甘草的干燥根及根莖，是我國(guó)醫(yī)藥管理部門收載和管理的重要中藥材之一[1]。甘草也是臨床上應(yīng)用最廣泛的傳統(tǒng)中藥，始載于東漢時(shí)期我國(guó)古代第一部藥學(xué)專著《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，味甘、性平，歸心、肺、脾、胃經(jīng)，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、止咳祛痰、緩急止痛、調(diào)和諸藥的功效[2-3]。甘草中主要有效成分分為兩種，一為三萜類化合物，包括甘草酸、甘草次酸等。二為黃酮類化合物，包括芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、甘草素等。最初認(rèn)為甘草的藥理作用均起因于甘草中三萜類成分，其主要藥理作用包括抗炎、抗過敏、保肝、抗癌等[4-9]。自被報(bào)道甘草抗?jié)冏饔脕碓从诟什蔹S酮后，甘草中黃酮類成分才得到高度的關(guān)注，目前已經(jīng)證實(shí)黃酮類成分存在抗氧化、抗炎、抗菌、保肝、激素樣作用、降糖、降脂、解痙、抗抑郁等藥理作用[9-14]。

自2010版《中國(guó)藥典》后，甘草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)由控制三萜類化合物甘草酸單一成分，增加為三萜類化合物甘草酸和黃酮類化合物甘草苷兩種成分。但經(jīng)HPLC檢測(cè)可知，色譜圖中有的峰型一般、基線不平穩(wěn)，故嘗試高效液相色譜-電霧式檢測(cè)器（HPLCCAD）方法進(jìn)行檢測(cè)[15]。HPLC-CAD具有較寬的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍、較高的靈敏度和重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用于中性、酸性、堿性及兩性物質(zhì)等，特別是無紫外吸收、非揮發(fā)性或半揮發(fā)性物質(zhì)的檢測(cè)[16-17]。

本研究自2017年6月至2019年6月，完成不同產(chǎn)地烏拉爾甘草的收集和用HPLC-CAD檢測(cè)方法對(duì)甘草藥材中4種成分的含量檢測(cè)，為甘草今后的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供有意義的參考。

1 儀器與試藥

Ultimate 3000液相色譜儀（美國(guó)Dionex公司）配備Corona Ultra電霧式檢測(cè)器及Chromeleon 7.2色譜工作站，紫外檢測(cè)器（美國(guó)Dionex公司DAD），分析天平（Mettler Toledo XP26、Mettler Toledo AG285），超聲儀（Elmasonic S），Millipore Simplicity-185型超純水儀（美國(guó)Millipore公司）。Waters XBridge C 18色譜柱（填料：十八烷基硅烷鍵合硅膠；4.6 mm×250 mm，5 μm）。

芹糖甘草苷對(duì)照品（上海詩丹德生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)6797，含量98%；）、甘草苷對(duì)照品（中國(guó)生物制品檢定研究院，生產(chǎn)批號(hào)111610-700604，含量100%；）、芹糖異甘草苷對(duì)照品（上海詩丹德生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)5063，含量98%；）及甘草酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢驗(yàn)研究院，生產(chǎn)批號(hào)110731-201720，含量97.9%；）乙腈：質(zhì)譜純；甲酸（99.5%）：色譜純；水：超純水；甘草樣品收集信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters XBridge C18色譜柱（4.6mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.05%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～8 min，A相維持在19%；8～35 min，A相由19%上升至50%；35～36 min，A相上升至100%；36～37 min，A相由100%下降至19%；37～47 min，A相維持在19%；），流速：1.0 mL/min；柱溫：35℃；電霧式檢測(cè)器：霧化溫度為40℃、氣源為N2、壓力4.156×105Pa。

表1 甘草樣品來源

2.2 對(duì)照品溶液的配制 取對(duì)照品芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷和甘草酸適量，精密稱定，加適量70%乙醇超聲溶解，冷卻后再用70%乙醇定容到刻度，最終得到各對(duì)照品濃度1分別為0.039 21、0.034 29、0.032 19和0.169 37 mg/mL。

取對(duì)照品芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷和甘草酸適量，精密稱定，加適量70%乙醇超聲溶解，冷卻后再用70%乙醇定容到刻度，最終得到各對(duì)照品濃度 2分別為 0.818 0、0.710 8、1.580 3和6.375 0 mg/mL。

2.3 線性關(guān)系的考察 精密量取“2.2”項(xiàng)下芹糖甘草苷對(duì)照品溶液1、甘草苷對(duì)照品溶液1、芹糖異甘草苷對(duì)照品溶液1和甘草酸對(duì)照品溶液1不同體積溶液，注入高效液相色譜儀，采用CAD進(jìn)行分析。以質(zhì)量為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終得到4種成分線性回歸方程見表2。

表2 線性回歸方程

結(jié)果表明，4種成分的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 0。

2.4 供試品溶液的制備 取甘草藥材粉末（過三號(hào)篩）約0.2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇

100 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密量取同一供試品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次依法測(cè)定，芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷和甘草酸各峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）結(jié)果分別為1.95%、1.99%、2.05%和1.13%（n＝6），RSD＜3.0%，表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，于配制后0、3、6、12、24、36、48 h分別精密量取10 μL，注入液相色譜儀，采用CAD檢測(cè)器進(jìn)行分析，測(cè)定芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷和甘草酸各峰面積RSD分別為1.12%、2.23%、1.89%和2.01%（n＝7），RSD＜3.0%，表明樣品在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取甘草藥材粉末（過三號(hào)篩）約0.2 g，精密稱定，照“2.4”項(xiàng)下方法，共制備6份供試品溶液，分別取10 μL注入液相色譜儀，測(cè)定含量。結(jié)果甘草藥材中平均含量為2.05%、4.73%、0.80%和9.72%，4種成分含量結(jié)果的RSD分別為1.19%、1.78%、1.28%和1.89%（n＝6），RSD＜3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 回收率試驗(yàn) 取甘草藥材約0.1 g各6份，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別加芹糖甘草苷對(duì)照品溶液2（0.818 0 mg/mL）、甘草苷對(duì)照品溶液2（0.710 8 mg/mL）、芹糖異甘草苷對(duì)照品溶液2（1.580 3 mg/mL）和甘草酸對(duì)照品溶液2（6.375 0 mg/mL）各2.5、6.5、0.5、1.5 mL，平衡操作6次，加入相應(yīng)量70%乙醇，使總?cè)芤毫繛?00 mL，密塞，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。各取10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3～6。

表3 芹糖甘草苷的回收率試驗(yàn)結(jié)果

表4 甘草苷的回收率試驗(yàn)結(jié)果

表5 芹糖異甘草苷的回收率試驗(yàn)結(jié)果

表6 甘草酸的回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 供試品含量測(cè)定 取甘草藥材，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，計(jì)算芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷和甘草酸的含量，結(jié)果見表7及圖1。

3 討論

3.1 檢測(cè)器的選擇 HPLC-CAD色譜圖基線較為平穩(wěn)、峰型良好、分離度良好、靈敏度高，故選擇HPLC-CAD進(jìn)行各成分的含量測(cè)定。CAD是一種新型通用性檢測(cè)器，不依賴于化合物的分子結(jié)構(gòu)，對(duì)大多數(shù)化合物響應(yīng)性一致，有著靈敏度高、低檢測(cè)限、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。

3.2 色譜條件的優(yōu)化 CAD檢測(cè)器適用揮發(fā)性的有機(jī)酸，所以本試驗(yàn)對(duì)有機(jī)酸進(jìn)行了篩選，嘗試用乙腈-甲酸和乙腈-乙酸和乙腈-三氟乙酸流動(dòng)相系統(tǒng)，其中以乙腈-甲酸流動(dòng)相分離效果最佳，且基線較為平穩(wěn)，經(jīng)進(jìn)一步優(yōu)化后，確定了本試驗(yàn)的乙腈-0.05%甲酸溶液作為流動(dòng)相體系，各色譜峰分離效果良好，噪音小，系統(tǒng)較為穩(wěn)定可行。

3.3 甘草含量測(cè)定結(jié)果的分析 用HPLC-CAD方法測(cè)定甘草藥材的含量結(jié)果是：芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷和甘草酸的含量分別在0.26%～2.27%、0.33%～5.07%、0.14%～0.81%、0.77%～9.76%范圍。根據(jù)2015版本《中國(guó)藥典》甘草含量測(cè)定項(xiàng)下限度要求：甘草苷不小于0.5%，甘草酸不小于2.0%，只有GC-007和GC-008批次甘草樣品含量不符合規(guī)定，其余均符合藥典要求。

此收集的甘草均為烏拉爾甘草，產(chǎn)地分別為新疆庫(kù)爾勒、新疆輪臺(tái)、內(nèi)蒙古呼和浩特、內(nèi)蒙古赤峰和甘肅蘭州。從不同成分進(jìn)行分析，芹糖甘草苷成分：新疆兩個(gè)產(chǎn)地＞內(nèi)蒙古兩產(chǎn)地＞甘肅蘭州；且新疆兩產(chǎn)地含量相近、內(nèi)蒙古兩產(chǎn)地的含量也相近。甘草苷成分：新疆兩產(chǎn)地＜甘肅蘭州＜內(nèi)蒙古兩產(chǎn)地；新疆兩產(chǎn)地含量相近，內(nèi)蒙古兩產(chǎn)地含量相差較明顯，內(nèi)蒙古赤峰產(chǎn)地中的甘草苷是其他產(chǎn)地的約3～5倍；芹糖異甘草苷成分：新疆兩產(chǎn)地＞內(nèi)蒙古兩產(chǎn)地大于甘肅蘭州；且新疆兩產(chǎn)地含量相近，內(nèi)蒙古兩產(chǎn)地也含量相近。甘草酸成分：明顯可以看出新疆和內(nèi)蒙古兩產(chǎn)地的含量較高于甘肅蘭州。根據(jù)以上結(jié)論，可為選用不同產(chǎn)地甘草提供依據(jù)，如主要作用于抗炎、抗過敏、保肝、抗癌等[4-9]的，則可以選擇內(nèi)蒙古和新疆產(chǎn)地的甘草藥材，尤其可以選擇內(nèi)蒙古赤峰產(chǎn)地。如主要作用于抗氧化、抗炎、抗菌、保肝、激素樣作用、降糖、降脂、解痙、抗抑郁等藥理作用[9-14]的，則可選擇新疆和內(nèi)蒙古兩產(chǎn)地，尤其可以選擇內(nèi)蒙古赤峰的。

本研究采用HPLC-CAD技術(shù)，對(duì)甘草中芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷和甘草酸4種成分進(jìn)行含量測(cè)定，快速、準(zhǔn)確，可為客觀評(píng)價(jià)甘草質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

表7 甘草藥材中四種有效成分的含量測(cè)定結(jié)果

圖1 甘草藥材HPLC和CAD檢測(cè)器檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果：A回收率試驗(yàn)—供試品溶液色圖譜（CAD檢測(cè)器）；B供試品溶液色圖譜（CAD檢測(cè)器）；C供試品溶液色圖譜（HPLC-UV）；D混合對(duì)照品溶液色譜圖（CAD檢測(cè)器）