五味子丙素緩解血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心臟炎性反應(yīng)和心肌重構(gòu)

談云，葉琳嵐，趙珺瑤，呂衛(wèi)群

作者單位：無錫市第三人民醫(yī)院（江南大學(xué)附屬醫(yī)院）藥劑科，江蘇 無錫214041

生理和病理性心臟結(jié)構(gòu)重塑通常與血流動(dòng)力學(xué)、心室形狀和心肌力學(xué)的慢性改變有關(guān)，這些改變最初為了彌補(bǔ)心臟結(jié)構(gòu)重塑而被觸發(fā)，但最終加重了心肌重構(gòu)[1-3]。細(xì)胞介導(dǎo)的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)對適應(yīng)和非適應(yīng)心肌與基質(zhì)重塑起著重要調(diào)節(jié)作用[1]。機(jī)械負(fù)荷還可誘導(dǎo)血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、內(nèi)皮素1和轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）等因子的釋放，這些因子是心肌細(xì)胞肥大和基質(zhì)重塑的有效活化因子[4-6]。在器官和組織上，壓力超負(fù)荷和運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的生理性肥大時(shí)的同心肥大可以通過正?；趹?yīng)力或增加心輸出量來達(dá)到穩(wěn)態(tài)或代償[7]。這些肥厚反應(yīng)也可能伴隨著細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和冠狀動(dòng)脈系統(tǒng)的適應(yīng)性重塑[8]。五味子是一種常用的中藥，近年來臨床用于治療肝炎[9]，有研究報(bào)道五味子丙素可明顯緩解四氯化碳誘導(dǎo)的肝損傷[10]，但在心血管疾病中五味子丙素的作用尚不明確。2018年7月至2019年1月，本研究以小鼠為對象，研究五味子丙素對AngⅡ誘導(dǎo)小鼠心肌重構(gòu)的影響調(diào)節(jié)，為臨床運(yùn)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 購自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所[許可證號：SCXK（蘇）2018-0008]。

1.2 藥物與試劑 五味子丙素，購自美國selleck公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒，美國Invitrogen公司；血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ），美國Sigma公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）/白介素-6（IL-6）ELISA試劑盒，美國eBioscience公司；RNA提取試劑，大連Takara公司。

1.3 主要儀器 倒置及正置熒光顯微鏡，日本Nikon公司；SpectraMaxM2型酶標(biāo)儀，Molecular Devices生物科技公司；蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜與曝光系統(tǒng)，美國Bio-rad公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇8周齡的雄性C57BL/6小鼠24只，體質(zhì)量為18～22 g，清潔級。在本研究中，24只C57BL/6小鼠被安置在一個(gè)12：12小時(shí)的光-暗循環(huán)中，在恒定的室溫下，用標(biāo)準(zhǔn)的嚙齒動(dòng)物飼料喂養(yǎng)，并給予水。實(shí)驗(yàn)前，動(dòng)物至少在實(shí)驗(yàn)室馴化2周。所有動(dòng)物護(hù)理和實(shí)驗(yàn)程序均按照《實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用指南》（美國國立衛(wèi)生研究院）中概述的指令執(zhí)行。經(jīng)醫(yī)院動(dòng)物倫理審查委員會(huì)同意，實(shí)驗(yàn)用鼠均置于《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)條件下。

1.5 心室重構(gòu)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立 皮下注射AngⅡ磷酸緩沖液（pH7.2）[0.5 mg·kg-1·（2d）-1，持續(xù) 8周]誘導(dǎo)10周大的C57BL/6小鼠心肌重構(gòu)。將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為三組，每組各8只，對照組單獨(dú)接受PBS的未經(jīng)處理的C57BL/6對照小鼠；AngⅡ組為AngⅡ誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)小鼠；AngⅡ+ShC組為AngⅡ誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)小鼠，從AngⅡ注射前第1天開始口服五味子丙素（1%CMC-Na溶液），劑量為5 mg·kg-1·d-1，持續(xù)8周。PBS（磷酸緩沖鹽溶液）組和AngⅡ組小鼠單獨(dú)接受1%的CMC-NA溶液，時(shí)間與ShC治療組相同。動(dòng)物在戊巴比妥鈉麻醉下被處死。小鼠死亡后，解剖心臟并稱重，比較心臟質(zhì)量/體質(zhì)量（hw/bw，mg/kg），將心臟組織置于液氮中快速冷凍，進(jìn)行基因和蛋白表達(dá)分析。此外，在死亡時(shí)，用含肝素的針注射器從右心室采集血液。

1.6 生化指標(biāo)測定 用相應(yīng)的試劑盒（江蘇南京建成生物工程有限公司）檢測血液中的生化分子肌酸磷化脢-同功脢CK-MB。

1.7 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 心臟組織（20～50 mg）由Trizol（Invitrogen，Arlsbad，CA）中根據(jù)說明書提取RNA。cDNA是通過轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)六聚體引物的作用下以mRNA為模版逆轉(zhuǎn)錄而成的。繼而，利用實(shí)時(shí)定量PCR分析檢測心鈉肽（ANP）、腦鈉肽（BNP）、肌球蛋白重鏈（MYHC）、IL-6、TNF-α、TGF-β、膠原IV（CollagenIV）和β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）mRNA的表達(dá)水平，引物序列見表1。

1.8 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測心臟中炎性因子的含量

TNF-α/IL-6水平檢測：研磨組織并用蛋白裂解液提取，而后檢測蛋白濃度。將TNF-α/IL-6的捕獲抗體包被至96孔ELISA板，過夜放置于4℃。第2天，PBST（0.1‰Twen-20的PBS）洗滌3次，每次均置于吸水紙上將剩余液體拍干，后向已包被的ELISA板加入BSA封閉，1 h后棄BSA并將細(xì)胞培養(yǎng)上清液加入至ELISA板中，于室溫?fù)u床放置2 h。隨后PBST洗滌3次，將TNF-α/IL-6的檢測抗體加入至ELISA板，于室溫?fù)u床放置1 h。隨后PBST洗滌3次，將Strapavaidin-HRP加入至ELISA板，于室溫?fù)u床放置30 min。隨后將HRP顯色底物（TMB）加入至ELISA板，于室溫避光放置15 min，而后將終止緩沖液（4%硫酸）加入至ELISA板，利用酶標(biāo)檢測儀，設(shè)置參數(shù)為450 nm，測定吸光度

表1 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引物序列

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有計(jì)量資料以表示。兩組間的比較采用Student's t檢驗(yàn)分析，多組間的差異比較采用單因素方差分析并以Bonferroni校正作后比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 五味子丙素顯著減輕AngⅡ誘導(dǎo)的體內(nèi)心臟損傷 每組8只小鼠，分別每兩天皮下注射注射0.5 mg/kg的AngⅡ誘導(dǎo)小鼠心臟損傷。在小鼠死亡后，我們檢測了血清CK-MB水平。PBS組為（120.9±18.95）μmol/L，AngII組為（198.0±36.43）μmol/L，AngII+ShC組為（113.5±39.47）μmol/L，三組間CK-MB水平比較，F(xiàn)＝12.57，P＝0.000 5；AngⅡ誘導(dǎo)CK-MB水平升高，五味子丙素處理顯著降低。

2.2 給予五味子丙素可顯著減輕AngⅡ誘導(dǎo)的心肌重構(gòu) 圖1A顯示皮下注射AngⅡ可誘導(dǎo)小鼠心重比升高，而五味子丙素處理可得到緩解[AngⅡ組比AngⅡ+ShC 組為（6.32±0.99）‰比（4.93±0.17）‰，P＜0.05]，并且AngⅡ注射液和五味子丙素治療均不影響實(shí)驗(yàn)小鼠的體質(zhì)量變化（圖1B）。五味子丙素處理抑制了AngⅡ誘導(dǎo)的心功能相關(guān)基因ANP[（3.37±0.60）比（1.41±0.37）倍，P＜0.05]、BNP[（2.51±0.75）比（0.78±0.55）倍，P＜0.05]、促肥大基因 MYHC[（2.57±0.74）比（1.18±0.26）倍，P＜0.05]的mRNA過度表達(dá)（圖1C）。此外，AngⅡ組比AngⅡ+ShC組分別 為（3.70±1.47）比（1.68±0.56）倍 、（5.25±0.94）比（1.78±0.57）倍（P＜0.05），見圖1C，并且發(fā)現(xiàn)AngⅡ可升高小鼠血壓，但五味子丙素治療卻不改善血壓的升高，AngⅡ組比AngⅡ+ShC組為（132.50±8.86）比（133.10±12.16）mmHg，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1D）。

2.3 五味子丙素可顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的小鼠心臟炎癥 實(shí)時(shí)qPCR分析顯示，與對照組相比，AngⅡ組小鼠的TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá)顯著增加，而五味子丙素處理后，這些因子表達(dá)的增加被明顯抑制，AngⅡ組比AngⅡ+ShC組分別為（7.18±2.85）比（2.92±0.86）倍，（12.89±5.40）比（4.29±3.43）倍，P＜0.05）（圖2A）。通過ELIAS檢測心臟中TNF-α和IL-6的蛋白水平，結(jié)果顯示AngⅡ組小鼠的TNF-α和IL-6的蛋白水平顯著升高，而服用五味子丙素可顯著降低這些升高[AngⅡ組比AngⅡ+ShC組分別為（4.80±0.78）比（2.09±0.41）ng/mg，（2.56±0.73）比（1.23±0.41）ng/mg，P＜0.05]（圖2B）。

圖1 五味子丙素顯著減輕Ang II誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)：A為小鼠心臟質(zhì)量體重量比，B為小鼠體質(zhì)量變化，C為小鼠心臟ANP、BNP、MYHC、Collagen IV、TGF-β的mRNA水平變化，D為小鼠血壓變化

圖2 五味子丙素可顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的小鼠心臟炎癥：A為小鼠心臟IL-6和TNF-α的mRNA水平，B為小鼠心臟IL-6和TNF-α的蛋白水平

3 討論

心力衰竭是大多數(shù)心血管疾病病人最主要的死亡原因，病人的醫(yī)療費(fèi)用也是社會(huì)沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的重要組成部分[11-13]。在心力衰竭的病理發(fā)展過程中，心肌重構(gòu)起著至關(guān)重要的作用[14]。心肌重構(gòu)是心臟的一種適應(yīng)性反應(yīng)，發(fā)生在各種外在和內(nèi)在刺激中，這些刺激會(huì)增加生物力學(xué)壓力[12]。因此，了解心肌重構(gòu)的機(jī)制和潛在靶點(diǎn)對心血管生物學(xué)領(lǐng)域很重要，并可能成為預(yù)防或治療心血管疾病的新策略。臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明，AngⅡ是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的主要效應(yīng)物，在導(dǎo)致心肌重塑的生物學(xué)過程中具有重要作用[1，15]。除了其在動(dòng)脈血壓調(diào)節(jié)中的生理作用（即通過血管收縮和鈉水滯留），AngⅡ還通過激活心臟炎癥直接誘導(dǎo)心肌重構(gòu)[16-17]。許多研究支持AngⅡ?qū)π募〖?xì)胞有著直接影響，包括心肌細(xì)胞炎癥、肥大、纖維化和細(xì)胞外基質(zhì)的積累[7，16，18]。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)五味子丙素可在不改變小鼠體質(zhì)量（圖1B）以及AngⅡ誘導(dǎo)的血壓升高（圖1D）條件下，改善AngⅡ引起的心重比升高（圖1A）。除此之外，心功能相關(guān)指標(biāo)ANP和BNP的mRNA水平在AngⅡ誘導(dǎo)下顯著升高，表明AngⅡ引起心功能紊亂；然而，五味子丙素治療后，AngⅡ誘導(dǎo)的ANP和BNP明顯下調(diào)（圖1C）。膠原生成增多是心肌重構(gòu)中的重要一環(huán)，我們研究發(fā)現(xiàn)，皮下注射AngⅡ后，Collagen IV和TGF-β顯著上升，而五味子丙素可逆轉(zhuǎn)這些變化（圖1C）。以上表明五味子丙素可改善AngⅡ誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)。

AngⅡ誘導(dǎo)的心肌炎癥是心肌重塑和心力衰竭的關(guān)鍵因素之一[16-17，19]。文獻(xiàn)報(bào)道阻斷TLR4（經(jīng)典炎癥信號通路的上游蛋白）可減輕AngⅡ誘導(dǎo)的心肌炎癥，并改善高血壓引起的心臟功能紊亂[20]。Echem等人發(fā)現(xiàn)，局部炎性反應(yīng)（如促炎細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的增加）在高血壓相關(guān)的心肌重構(gòu)中起著關(guān)鍵作用，而TLR4依賴的免疫抑制可緩解心肌纖維化和肥大，且血壓水平無變化[21]。除此之外，Matsuda等[22]證明以TLR4缺陷小鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，TLR4缺乏逆轉(zhuǎn)了AngⅡ誘導(dǎo)的心臟肥大、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞浸潤和舒張功能障礙，且血壓水平無變化。因此，除了經(jīng)典的AT1受體和高血壓，炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是連接AngⅡ與心臟疾病的一個(gè)紐帶。本研究發(fā)現(xiàn)AngⅡ可誘導(dǎo)心臟組織中炎性因子（TNF-α和IL-6）的過度表達(dá)，而五味子丙素治療可顯著緩解（圖2）。因此我們推測五味子改善AngⅡ誘導(dǎo)的心室重構(gòu)可能源于其抗炎作用。但并未進(jìn)一步深入探索，此為本研究的局限。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)五味子丙素能有效抑制AngⅡ誘導(dǎo)小鼠的心肌重構(gòu)，并伴隨炎性反應(yīng)的降低，表明五味子丙素可能成為治療心肌重構(gòu)的候選藥物。