藥用植物紫錐菊葉的顯微鑒別研究

王德民，李敏，李峰

（山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355）

紫錐菊［Echinacea purpurea（L.）Moench］，又稱松果菊，為菊科松果菊屬植物，該屬植物已知的有9個種及數(shù)個變種［1］，目前被作為藥物開發(fā)應(yīng)用的主要有紫錐菊、狹葉紫錐菊［Echinacea angustifolia（DC.）Hell］和淡紫松果菊［Echinacea pallida（Nutt.）Nutt］［2］。紫錐菊原產(chǎn)于北美，是西方國家民間的傳統(tǒng)草藥，藥用歷史悠久，最早可追溯到北美洲的印第安人時期，用來治療蛇蟻叮咬及皰疹［3］?，F(xiàn)代科學(xué)研究證明，紫錐菊兼具突出的抗感染和促免疫作用［4-8］。從20世紀(jì)開始，紫錐菊作為廣受矚目的免疫調(diào)節(jié)劑和免疫抑制劑受到國際社會的普遍認(rèn)可；含有紫錐菊的藥物制劑先后在德國、美國、加拿大等西方國家上市，并擴(kuò)大應(yīng)用到保健品及食品領(lǐng)域中，以紫錐菊為原料的產(chǎn)品年銷量常年名列前茅，是國際上公認(rèn)的免疫和抗病毒雙效草藥［9，10］。20世紀(jì)70年代，我國將紫錐菊作為觀賞花卉引入，并首次收載于《北京植物志》中［11］；90年代，紫錐菊首次作為免疫調(diào)節(jié)劑被肖培根院士介紹到國內(nèi)，隨即在我國南北多地相繼開始該屬三種藥用植物的栽培研究工作，并取得了一定的成果［3，12］。2012年6月，紫錐菊及其制劑被農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)為國家一類新獸藥，并收載于《中華人民共和國獸藥典》［11］。紫錐菊為多年生草本植物，多采收于枝葉繁茂的盛花期，目前國內(nèi)市場上流行的生藥大宗通貨多由其花、莖、葉等地上部分組成。有學(xué)者對該植物不同生長期主要有效成分菊苣酸等的含量進(jìn)行動態(tài)分析發(fā)現(xiàn)，盛花期該植物的主要有效成分達(dá)到最高值，且葉為含量最高部位［13］。

目前國內(nèi)有關(guān)紫錐菊的研究報道較傳統(tǒng)中草藥相對較少，主要集中在生藥學(xué)［2，4］、有效成分［5-8］、藥理藥效［3］等方面，對紫錐菊葉的系統(tǒng)研究鮮有報道，而且目前對紫錐菊葉的顯微鑒別描述尚存在一定分歧，尤其對葉橫切面的內(nèi)部結(jié)構(gòu)、表皮非腺毛種類等的觀察結(jié)果有所異議［9，13-15］。因此，筆者從表面特征、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、粉末特征方面對紫錐菊葉進(jìn)行系統(tǒng)的顯微鑒別研究，以期為紫錐菊的相關(guān)研究和開發(fā)應(yīng)用提供更多的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

本實驗所用樣品于2019年5月取自山東中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園，由山東中醫(yī)藥大學(xué)生藥系李峰教授鑒定為菊科植物紫錐菊［Echinacea purpurea（L.）Moench］的新鮮葉片。

所用藥劑為水合氯醛、稀甘油等。所用儀器包括顯微鏡系統(tǒng)（CX41 System Microscope，OLYMPUS公司產(chǎn)品）；顯微數(shù)碼相機(jī)（TOUPCAMTM，P/N TP603100A）；成像軟件（ToupView）；高速萬能粉碎機(jī)（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司，F(xiàn)W-100）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 葉表面制片 取紫錐菊成熟葉一片，清理表面灰塵后將葉片置于適量蒸餾水中浸泡30 min，取出吸去多余水分，撕取葉片中部近中脈一側(cè)的葉上下表皮，迅速浸入蒸餾水中。上、下葉表皮分別制片。將所制備的裝片置于顯微鏡下觀察、描述，并對顯著特征進(jìn)行拍照。

分別隨機(jī)選取相同倍數(shù)下觀察到的葉上、下表皮視野各10個。按《中華人民共和國藥典》（2015）通則中的公式I＝（S×100）/（E+S）計算氣孔指數(shù)，其中，I表示氣孔指數(shù)，S表示氣孔數(shù)，E表示同一視野內(nèi)表皮細(xì)胞數(shù)。最后取平均值作為最終結(jié)果。

1.2.2 葉橫切面制片 取樣品成熟葉一片，清理表面灰塵后切成1 cm×2 cm的短段，置于蒸餾水中浸潤后用刀片重復(fù)切片，切至肉眼觀察呈半透明狀。選擇較完整的切片制作臨時裝片，方法同葉表面制片，置于顯微鏡下觀察、拍照并描述。

1.2.3 葉粉末制片 取樣品葉片適量，清理表面灰塵后進(jìn)行干燥并粉碎，過60目篩，用水合氯醛、稀甘油制成臨時裝片，置于顯微鏡下觀察、拍照、描述。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫錐菊葉表皮特征

紫錐菊葉上表皮細(xì)胞呈不規(guī)則多角形，長51～110μm，寬25～59μm，垂周壁呈微波狀彎曲，排列緊密，氣孔偶見，為不定式，周圍副衛(wèi)細(xì)胞3～4個。下表皮細(xì)胞呈不規(guī)則形，長52～100 μm，寬20～65μm，垂周壁樣式為深波狀彎曲，氣孔眾多，為不定式，保衛(wèi)細(xì)胞半月形，周圍副衛(wèi)細(xì)胞3～4個，可見兩個氣孔共用一個副衛(wèi)細(xì)胞（圖1）。表皮非腺毛偶見，分為四種：第一種為多細(xì)胞圓錐狀，先端銳尖，壁較厚，細(xì)胞腔狹小，表面具有明顯的疣狀突起；第二種為多細(xì)胞棒狀，壁略厚，先端較鈍，表面有疣狀突起；第三種為單細(xì)胞圓錐狀，先端銳尖，壁厚，細(xì)胞腔狹小，表面光滑；第四種為星狀毛，偶見。葉上表皮的氣孔指數(shù)為1.455；葉下表皮的氣孔指數(shù)為19.884（表1）。

表1 紫錐菊葉表皮氣孔指數(shù)

2.2 葉橫切面特征

通過顯微鑒別，紫錐菊葉為典型的異面葉。上、下表皮細(xì)胞各一列，近似長方形，外有角質(zhì)層覆蓋，細(xì)胞外有非腺毛疏被；氣孔上、下表皮均有，下表皮數(shù)量遠(yuǎn)大于上表皮。葉肉組織分為兩種，分別為柵欄組織和海綿組織，柵欄組織位于葉上表皮內(nèi)側(cè)，組織細(xì)胞有兩列，呈長柱形，外層細(xì)胞排列較內(nèi)層更為緊密；海綿組織位于葉下表皮內(nèi)側(cè)，組織細(xì)胞多列，形狀不規(guī)則，排列疏松，有較大的細(xì)胞間隙；葉肉組織中含有大量的葉綠體；中間可見維管束存在。主脈處上、下表皮細(xì)胞呈類圓形或類方形，細(xì)胞外也有角質(zhì)層覆蓋，內(nèi)側(cè)為厚角組織，細(xì)胞壁不均勻加厚；主脈維管束發(fā)達(dá)，為外韌型，呈弧形，數(shù)量1～3個不等，具有明顯的形成層，薄壁細(xì)胞組成一層維管束鞘包圍在維管束外側(cè)（圖2）。

圖2 紫錐菊葉橫切面特征顯微觀察

2.3 葉粉末特征

紫錐菊葉粉末為淺綠色。非腺毛可見四種，一為多細(xì)胞圓錐狀，先端銳尖，壁較厚，細(xì)胞腔狹小，表面具有明顯的疣狀突起；二為多細(xì)胞棒狀，壁略厚，先端較鈍，表面有疣狀突起；三為單細(xì)胞圓錐狀，先端銳尖，壁厚，細(xì)胞腔狹小，表面光滑；四為星狀毛，偶見。表皮細(xì)胞形狀不規(guī)則，垂周壁呈微波狀彎曲或深波狀彎曲，不定式氣孔，周圍副衛(wèi)細(xì)胞3～4個。保衛(wèi)細(xì)胞半月形，且可見有兩個氣孔共用一個副衛(wèi)細(xì)胞。導(dǎo)管多數(shù)以螺紋導(dǎo)管為主，網(wǎng)紋導(dǎo)管偶見。部分可見石細(xì)胞。多見角質(zhì)樣物質(zhì)，有明顯的不規(guī)則線狀紋理。偶見未成熟的花粉粒（圖3）。

圖3 紫錐菊葉粉末顯微觀察

3 討論與結(jié)論

紫錐菊并非傳統(tǒng)的中草藥，且引入我國時間相對較短，故國內(nèi)目前對紫錐菊的生藥研究相對較少，多圍繞其化學(xué)成分及藥效藥理作用開展，且受眾目標(biāo)多為家禽畜類。近年來，隨著紫錐菊在國內(nèi)引種栽培技術(shù)的不斷提高和其生藥商品流通性的不斷增加，該屬植物的“中國化、中藥化”進(jìn)程也隨之加深，為紫錐菊這種舶來品逐漸探索出中醫(yī)藥理論依據(jù)［16］。雖然當(dāng)前國際上該種植物的應(yīng)用范圍正在不斷擴(kuò)大，國內(nèi)相關(guān)領(lǐng)域?qū)W者也加深了對其的研究，并取得了一定的研究結(jié)果，但紫錐菊還未作為藥用植物收錄到《中華人民共和國藥典》中，因而目前國內(nèi)未有規(guī)范、專屬性強(qiáng)的鑒別方法。國內(nèi)對紫錐菊葉的研究在該屬植物的生藥學(xué)等宏觀角度中有所涉及［14］，但缺乏單獨對紫錐菊葉進(jìn)行研究的報道；也有科研人員［17］采用掃描電鏡對其葉部進(jìn)行研究，但該方法所需設(shè)備成本較高，操作相對復(fù)雜，不具有普適性；已發(fā)表文獻(xiàn)中紫錐菊葉面結(jié)構(gòu)類型的鑒別結(jié)果存在差異。因而，對紫錐菊葉進(jìn)行相對獨立的研究就顯得尤為重要。

本研究對紫錐菊葉進(jìn)行了顯微結(jié)構(gòu)的觀察，對葉片上、下表皮分別進(jìn)行單獨觀察、拍照、描述，并計算氣孔指數(shù)。結(jié)果表明，紫錐菊葉組織結(jié)構(gòu)特征具有菊科植物的共性，葉上、下表皮細(xì)胞形狀、垂周壁、不定式氣孔、副衛(wèi)細(xì)胞數(shù)目、維管束類型等均與相關(guān)文獻(xiàn)報道［9，15］基本一致；其葉上表皮的氣孔指數(shù)1.455，下表皮氣孔指數(shù)19.884。

同時也有一些值得商榷的地方：第一，觀察中發(fā)現(xiàn)紫錐菊葉的非腺毛有四種，除前人［9］觀察到的多細(xì)胞圓錐狀和多細(xì)胞棒狀以外，還觀察到了單細(xì)胞圓錐狀和星狀毛。第二，紫錐菊葉為異面葉而非報道［14］中的等面葉，柵欄組織僅存在于上表皮內(nèi)側(cè)。第三，觀察發(fā)現(xiàn)主脈維管束有分離的情況，個數(shù)1～3個不等，主脈維管束的個數(shù)與維管束在主脈中位置有關(guān)，也與葉片的大小和發(fā)育程度有關(guān)，即同一葉片，主脈從葉基部至葉尖端，維管束逐漸分離；相同發(fā)育程度下不同葉片的相同位置，較大的葉片中維管束分離的占大多數(shù)，較小的葉片維管束多不分離；不同發(fā)育程度葉片的相同位置，發(fā)育成熟葉片的維管束多分離，未發(fā)育成熟葉片的維管束多不分離。第四，首次在紫錐菊葉粉末中觀察到石細(xì)胞。第五，在紫錐菊葉粉末中觀察到角質(zhì)層樣物質(zhì)，該物質(zhì)具有明顯的不規(guī)則線狀紋理。第六，關(guān)于紫錐菊葉粉末的研究，有文獻(xiàn)［18］指出其粉末中含有草酸鈣簇晶和草酸鈣柱晶，此次觀察未發(fā)現(xiàn)有這兩種物質(zhì)；在紫錐菊葉粉末中，還偶見未成熟的花粉粒。以上所列觀點，或與相關(guān)文獻(xiàn)記載不符，或未見于文獻(xiàn)記載。

同為菊科紫錐菊屬的狹葉紫錐菊和淡紫松果菊，在《美國藥典》中均有收錄，可作為制劑研發(fā)的正品植物來源，本課題組其他研究中樣品收集情況的反饋表明，國內(nèi)目前栽培種以紫錐菊與狹葉紫錐菊為主，淡紫松果菊少有種植（尚未發(fā)表）。將狹葉紫錐菊和淡紫松果菊以往研究資料［14，19］與本研究中紫錐菊葉片顯微研究結(jié)果橫向?qū)Ρ劝l(fā)現(xiàn)，葉部顯微存在以下異同點：①在橫切面觀察中，狹葉紫錐菊和淡紫松果菊的葉面類型為等面葉，上下表面均為柵欄組織；而本研究中紫錐菊為異面葉。②葉中脈維管束，三種植物均為外韌型，形成層可見。③三種植物上下表皮均發(fā)現(xiàn)多細(xì)胞非腺毛，且非腺毛種類相同；本研究中觀察到的非腺毛類型為四種，首次發(fā)現(xiàn)單細(xì)胞圓錐狀和星狀毛。④在葉片粉末觀察中，三種植物的氣孔類型均為不定式。其中，葉面類型的異同可考慮作為紫錐菊與狹葉紫錐菊、淡紫松果菊的顯微鑒別要點。

本研究結(jié)果可作為對紫錐菊相關(guān)研究內(nèi)容的補充與完善，為紫錐菊的研究提供了更加全面的參考資料。