重組菌低溫冷凍保藏試驗

田廣文，程雪妮

(西北農(nóng)林科技大學 生命科學學院，陜西 楊凌 712100)

菌種保藏原理是運用干燥、低溫和隔絕空氣的手段，抑制微生物代謝，使其生命代謝處于半永久性休眠期，盡可能減少突變，達到長期保藏的目的[1,2]。在教學實驗中，針對菌種或不同的實驗要求，試驗選擇最適宜的菌種保存方法，避免其保存期間變異、衰退或死亡，顯得尤其重要。

生物工程技術(shù)教學實驗室長期保存著多種重組菌(含人工重組DNA，特點是可表達人工產(chǎn)物)，這些菌種若保存不妥很易發(fā)生變異、退化或死亡。因此，保存菌種要有針對性選用最合適的保存方法。本課題組前期試驗用近年興起的甘油保存法，30%甘油濃度冷凍保存重組菌效果明顯好于用50%濃度的，但關(guān)于甘油保存重組菌濃度范圍報道有爭議。于是，本試驗對教學實驗所用的5種重組菌以不用甘油濃度組進行了360 d冷凍保存試驗，以尋求最適宜的保存濃度，更好地為教學、科研提供參考。

1 菌種保藏材料、方法及優(yōu)缺點

從表1[3,10]可以看出，甘油冷凍保存法簡單、經(jīng)濟、實用，值得試驗研究。

2 甘油低溫保存菌種法研究進展

(1)張愛梅[5]、鐘志宏[11]等對甘油保存菌種方法進行改良，即細菌種純化接于肉湯管，4～6 h增菌后，加入適量甘油生理鹽水保存液，冰箱-20℃保存。3年保存期內(nèi)，各菌保存效果良好。

(2)郭淑清[12]、黃霞云[13]等實驗將生長良好培養(yǎng)物5份，加體積分數(shù)為0.8甘油生理鹽水保存液2份，混勻(甘油濃度為22%)，分裝于滅菌有標記的連蓋小塑料管中，每管約0.2 mL，封蓋，存入-20℃冰箱。于保存1 a末、2 a末、9 a末分別取樣培養(yǎng)，檢測結(jié)果全部生長良好，性狀與保存前一致。說明甘油生理鹽水凍存菌種不易變異。

(3)張愛梅[5]、黃霞云[13]等[10,14]文獻對比研究了多種保藏法，分析得出“抵抗力較強菌種，超低溫保存能存活15 a以上，低溫保存能存活5 a以上”；“耐受力特別弱菌種，超低溫保存能存活5 a以上，低溫保存能存活2 a以上”；“實驗室用低溫保存菌株法較合理，但微生物檢查所用菌種的傳代次數(shù)不得超過5代，應用前應對菌種的純度和特性進行確認”?？梢姷蜏乇２鼐N范圍廣，值得試驗研究。

(4)孫萍[16]等論文指出“菌株冷凍時加入一些低溫保護劑可以保護菌株。如加甘油，能滲透到細胞內(nèi)，延緩細胞內(nèi)冰晶的形成，并能保護細胞內(nèi)液體物質(zhì)濃縮的影響”。“但甘油原液保存法因甘油的脫水作用使其保存菌株效果不佳，某些菌株容易死亡”。由此甘油液保存濃度是試驗的關(guān)鍵。

3 材料與方法[1,7]

以筆者實驗室常用的重組菌為試驗材料，以-20℃低溫保存法配比多種濃度甘油進行保存試驗，以期為重組菌株實驗室保存提供理論依據(jù)。

表1 菌種保藏材料及方法對比

3.1 菌種

本實驗室保藏的重組菌P38、GFP、4T-1和空菌株TOP10、BL21。

3.2 甘油保存液

體積分數(shù)為0.5的甘油溶液，即分析純甘油5份加入去離子水5份，充分混合，121℃滅菌20 min后備用。

3.3 試劑

配制LB液體、固體培養(yǎng)基(胰蛋白胨1.0%、酵母提取物0.5%、NaCl 1.0%，固體的加瓊脂粉1.5%)各50 mL、150 mL若干，121℃滅菌20 min備用。

含抗生素的培養(yǎng)基：氨芐青霉素加入冷卻無菌水，配成100 mg·mL-1母液于-20℃冰箱凍存。Amp母液解凍加于滅菌冷卻至60℃的LB液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基中，混勻，Amp終濃度為100 μg·mL-1。制固體培養(yǎng)基的要立即倒平板，倒置于4℃條件下保存。

質(zhì)粒小提試劑盒(離心柱型 50preps)：天根生化科技(北京)有限公司無水乙醇和TBE緩沖液。

TBE緩沖液(5×)：Tris 54 g，0.5 mol·L-1EDTA (pH值8.0) 20 mL，加去離子水混合完全溶解，定容至1 L備用。

3.4 菌種保存管

Eppendorf管1.5 mL包裝，同上高壓蒸汽滅菌，烘干備用。

3.5 保存方法[1,10～13,14～17]

將-70℃凍存含質(zhì)粒的大腸桿菌GFP、P38、4T-1以劃線方式接種于Amp+的LB平板(Amp含量100 μg·mL-1)上，空菌株TOP10、BL21也劃線接種于不含Amp的LB平板上，每種菌涂3個板，倒置37℃培養(yǎng)16～24 h，挑單個典型菌落分別接種于30 mL含或不含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃振蕩(轉(zhuǎn)速180 rpm)培養(yǎng)至OD600值1.0(有研究[1]指出，菌種保存時應選細胞生長對數(shù)期即OD600值為0.8或穩(wěn)定期早期即OD600值為1.0)，混加滅過菌的甘油保存液(體積分數(shù)0.5)，使甘油終濃度分別為8%、15%和25%，分裝于滅菌有標記的Eppendorf管中，每管1.0 mL，扣緊蓋，每個重復裝6支，立即放入-20℃冰箱中凍存。次日每種菌取1管融化，接種于LB平板，確證生長良好且無污染，其余各管即可長期保存。

3.6 菌種活化力檢測

本實驗采用最常用的平板活菌計數(shù)法。具體操作如下：

3.6.1 梯度稀釋 360 d后取出一套-20℃甘油凍存重組菌，室溫解凍，待測菌液按梯度稀釋1 ∶104、1∶105和1∶106。吸100 μL的稀釋菌液于含Amp+的LB固體平板上 (?9 cm)，無菌刮鏟涂勻，37℃倒置培養(yǎng)16～24 h。以單菌落數(shù)乘以菌液的稀釋倍數(shù)，即為菌液稀釋前的活細胞數(shù)。

3.6.2 質(zhì)粒檢測 用質(zhì)粒小提試劑盒標準堿裂解法提取質(zhì)粒，以瓊脂糖凝膠電泳法來檢測DNA分子量大小。

4 結(jié)果與分析

4.1 -20℃甘油凍存的重組菌各處理組的活細胞數(shù)

360 d后取出一套-20℃甘油凍存重組菌，室溫解凍，以平板菌落計數(shù)法檢測各組活細胞數(shù)見表2。

從表2可知，含質(zhì)粒菌的活細胞數(shù)15%甘油組>25%甘油組>8%甘油，其中P38的活細胞數(shù)>GFP的活細胞數(shù)>4T-1的活細胞數(shù)；而不含質(zhì)粒的空菌株活細胞數(shù)25%甘油組>15%甘油組>8%甘油組，且BL21的活細胞數(shù)>TOP10的活細胞數(shù)。由此，-20℃冷凍保藏重組大腸桿菌時，宜在菌液OD600值為1.0，甘油終濃度保持15%～25%為佳。

表2 OD600值為1.0的菌液在-20℃凍存360 d的活細胞數(shù)

4.2 -20℃甘油凍存的重組菌各處理組質(zhì)粒提取的電泳圖

各處理組-20℃保存360 d，取出培養(yǎng)活化菌液OD600值為1.0時各吸取1.4 mL，以標準堿裂解提取質(zhì)粒試劑盒分別提取質(zhì)粒，然后以150 μLTBE緩沖液進行溶解，再分別吸取10 μL質(zhì)粒量進行瓊脂糖凝膠電泳(1.0% agarose 見圖1)。由圖1可知，本實驗保存的重組菌，8%甘油組的質(zhì)粒與15%甘油組的質(zhì)粒均正常未有丟失。圖中P38質(zhì)粒大小為3 600 bp，GFP質(zhì)粒大小為5 400 bp，4T-1質(zhì)粒大小為4 900 bp。

4.3 -20℃甘油凍存的重組菌各處理組稀釋觀察菌落生長

上面采用平板菌落計數(shù)法檢測各處理組活細胞數(shù)時，稀釋各組菌落生長速度有明顯差異，即在37℃培養(yǎng)下，含質(zhì)粒菌的菌落生長需20～22 h，而不含質(zhì)粒的空菌株菌落生長只需16～18 h。

5 結(jié)論與討論

(1)試驗得出，不同濃度甘油低溫冷凍保存不同重組大腸桿菌菌株效果明顯有差異。保存360 d測試結(jié)果表明，含質(zhì)粒菌的活細胞數(shù)15%甘油組>25%甘油組>8%甘油組，P38的活細胞數(shù)>GFP的活細胞數(shù)>4T-1的活細胞數(shù)，且8%甘油組與15%甘油組的質(zhì)粒含量大小無差異；而不含質(zhì)粒空菌株的活細胞數(shù)25%甘油組>15%甘油組>8%甘油組，且BL21的活細胞數(shù)>TOP10的活細胞數(shù)。可見，-20℃冷凍保藏重組大腸桿菌時，宜在菌液OD600值為1.0，甘油終濃度保持15%～25%為佳。這與多數(shù)文獻[2,10～11,14～17]的實驗得出“甘油低溫保存一般宜15%～22%濃度”相近。而周智慧[1]論文認為重組菌“在甘油濃度>10%會導致質(zhì)粒不穩(wěn)定，易引起質(zhì)粒丟失。保種時應保持甘油終濃度為8%”。有出入，待于商榷。

(2)試驗重組大腸桿菌-20℃甘油液保存后，取出活化時菌落生長速度與是否含質(zhì)粒有差異，即37℃恒溫培養(yǎng)下，含質(zhì)粒菌的菌落生長需20～22 h，而不含質(zhì)粒的空菌株菌落生長只需16～18 h。此點未見有文獻報道。

(3)試驗證明，15%～25%甘油液-20℃冷凍保存重組菌種“方便、有效、經(jīng)濟實用”。也為保證生物技術(shù)實驗教學的有序進行提供了方便。